流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期教學內(nèi)容

流式細胞術(shù)FlowCytometry（FCM）第一頁，共58頁。什么(shénme)是流式細胞儀●流式細胞儀實物(shíwù)BDFACSVantageBD-Calibur第二頁，共58頁。1.發(fā)展(fāzhǎn)歷史1934Moldavan1973Steinkamp一、

概述(ɡàishù)第三頁，共58頁。2.定義：對在高速(ɡāosù)流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術(shù).3.特點測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細胞可進行多參數(shù)測量在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術(shù)。第四頁，共58頁。凡是能被熒光素標記的細胞或顆粒都可用流式細胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細胞儀所配置(pèizhì)的激光光源激發(fā)在生物檢測技術(shù)中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。4.應(yīng)用(yìngyòng)范圍第五頁，共58頁。二、流式細胞儀的工作原理和基本(jīběn)結(jié)構(gòu)待測細胞(xìbāo)以單個細胞(xìbāo)的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細胞(xìbāo)排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞(xìbāo)液柱。液柱與激光束相交(xiāngjiāo)，細胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。第六頁，共58頁。第七頁，共58頁?；?jīběn)結(jié)構(gòu)流動室和液流系統(tǒng)(xìtǒng)；激光源和光學系統(tǒng)(xìtǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)(xìtǒng)；計算機和分析系統(tǒng)(xìtǒng)。第八頁，共58頁。三、流式細胞儀可檢測(jiǎncè)到的細胞參數(shù)

非熒光(yíngguāng)信號顆粒(kēlì)度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性第九頁，共58頁。血液(xuèyè)涂片第十頁，共58頁。外周全(zhōuquán)血細胞散射光雙參數(shù)點圖第十一頁，共58頁。熒光(yíngguāng)信號熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光(jīguāng)激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光(jīguāng)光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光(jīguāng)光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。第十二頁，共58頁。熒光信號(xìnhào)與細胞特性熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。定量染色熒光信號大小被標記組分(zǔfèn)含量的定量多熒光標記胞內(nèi)多種組分(zǔfèn)，實現(xiàn)多參數(shù)測量第十三頁，共58頁。二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光光信號分離，導向各探測(tàncè)通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。光信號(xìnhào)收集第十四頁，共58頁。三數(shù)據(jù)處理及流式報告(bàogào)FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)(duìshù)線性線性線性對數(shù)(duìshù)脈沖(màichōng)處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果（面積，峰高，寬度）第十五頁，共58頁。流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個(jǐɡè)概念：%Gated：陽性細胞百分比。反映細胞群體中陽性細胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關(guān)，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強度，在陽性細胞為偏態(tài)分布時一般用該值。第十六頁，共58頁。散點圖密度(mìdù)圖二維等高圖直方圖圖報告(bàogào)中常見的幾種流式細胞圖第十七頁，共58頁。圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡(diāowánɡ)和壞死第十八頁，共58頁。流式細胞儀數(shù)據(jù)分析點圖分析(fēnxī)第十九頁，共58頁。流式細胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析(fēnxī)第二十頁，共58頁。圖中100～101（M1）為陰性(yīnxìng)細胞，101以上的（M2）為陽性細胞第二十一頁，共58頁。五、流式細胞術(shù)的應(yīng)用(yìngyòng)

細胞結(jié)構(gòu)(jiégòu)細胞大小細胞顆粒度細胞表面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原(kàngyuán)細胞活性細胞內(nèi)/外的細胞因子激素結(jié)合位點、細胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細胞膜電位、線粒體膜電位……第二十二頁，共58頁。一）細胞DNA含量(hánliàng)檢測細胞固定(gùdìng)后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結(jié)合于細胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。第二十三頁，共58頁。第二十四頁，共58頁。單參數(shù)(cānshù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細胞(xìbāo)，4N代表G2/M期細胞(xìbāo)，兩者中間代表S期細胞(xìbāo)。這是以2倍體和4倍體細胞(xìbāo)為主的流式DNA圖第二十五頁，共58頁。DNA細胞周期分析(fēnxī)細胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析(fēnxī)DNA含量(hánliàng)細胞數(shù)量2N4N

第二十六頁，共58頁。第二十七頁，共58頁。2倍體異倍體4倍體腫瘤組織(zǔzhī)中的各種DNA倍體第二十八頁，共58頁。含量與凋亡(diāowánɡ)關(guān)系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表(dàibiǎo)凋亡細胞數(shù)。凋亡過程中，細胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第二十九頁，共58頁。第三十頁，共58頁。第三十一頁，共58頁。二）腫瘤(zhǒngliú)診斷與抗腫瘤(zhǒngliú)藥物研究

第三十二頁，共58頁。1.腫瘤(zhǒngliú)診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學特征利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷(zhěnduàn)，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷(zhěnduàn)和腫瘤細胞學診斷(zhěnduàn)。第三十三頁，共58頁。2倍體異倍體4倍體腫瘤(zhǒngliú)組織中的各種DNA倍體第三十四頁，共58頁。第三十五頁，共58頁。2.凋亡(diāowánɡ)研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡(diāowánɡ)峰。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。第三十六頁，共58頁。第三十七頁，共58頁。AnnexinVAssay

第三十八頁，共58頁。圖AnnexinV/PI雙標記分析(fēnxī)細胞凋亡和壞死第三十九頁，共58頁。Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

圖FCM測試(cèshì)細胞周期分布和凋亡第四十頁，共58頁。根據(jù)(gēnjù)凋亡細胞的特點來檢測在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月(xīnyuè)體形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變??；細胞膜皺折卷曲，但早期細胞膜的完整性未受到破壞凋亡細胞的FSC？SSC？細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？第四十一頁，共58頁。CD3(T細胞，CD4、CD8))、CD19（B細胞）、CD16、CD56（NK細胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖病、腫瘤(zhǒngliú)療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。三）淋巴細胞分類(fēnlèi)第四十二頁，共58頁。第四十三頁，共58頁。第四十四頁，共58頁。流式細胞術(shù)檢測(jiǎncè)細胞表型第四十五頁，共58頁。流式細胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機理(jīlǐ)研究等有重要價值。四）白血病的免疫(miǎnyì)分型第四十六頁，共58頁。五）細胞內(nèi)蛋白(dànbái)的分析：細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光(yíngguāng)標記，用流式細胞儀進行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。熒光(yíngguāng)探針多為FITC。第四十七頁，共58頁。熒光(yíngguāng)信號使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達(biǎodá)含量第四十八頁，共58頁。熒光樣本(yàngběn)制備雙色直接(zhíjiē)染色第四十九頁，共58頁。端粒（熒光(yíngguāng)蛋白）第五十頁，共58頁。

六）細胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡(pínghéng)鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。第五十一頁，共58頁。FCM檢測(jiǎncè)胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能第五十二頁，共58頁。M1陰性界限(jièxiàn)劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ)水平、未受刺激時等。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。第五十三頁，共58頁。六.分選：用熒光(yíngguāng)探針標記的細胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，大型機分選速度可達到每秒上萬個細胞第五十四頁，共58頁。488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSingle