第五章體外技術

第五章體外分析技術體外分析技術主要是利用放射分析方法或其派生的相關技術在體外進行肌體內物質種類和含量的分析測定。體外分析技術的典型代表——放射免疫分析（RIA）競爭性體外放射分析法：非競爭性體外放射分析法：標記抗原和未標記抗原對抗體都有相同的結合能力，但是當抗體的量有限時，這種結合就出現相互競爭，彼此抑制。用標記抗體作示蹤劑，在反應系統(tǒng)中加入過量的抗體，待測抗原同放射標記抗體進行全量反應。RIA特點：靈敏度高(可測水平達10-12—10-15g)特異性強操作簡便，成本低應用廣泛目前可用RIA測定的微量物質：激素、蛋白質、環(huán)磷酸腺苷、抗原、抗體、維生素、藥物等300多種第一節(jié)放射免疫分析(RIA)放射性標記的抗原和非標記抗原(標準抗原或被測抗原)同時與限量的特異性抗體進行競爭性免疫結合反應，這種競爭關系可用以下反應來表示：*Ag：標記抗原Ag：非標記抗原Ab：特異性抗體*Ag-Ab：標記抗原抗體復合物Ag-Ab：非標記抗原抗體復合物一、基本原理：*Ag與Ag的免疫活性完全相同，對Ab具有同樣的親和力；當*Ag和Ab為恒定量，Ag和*Ag的總量大于Ab上的有效結合點時，*Ag-Ab的形成是隨著Ag量的增加而減少，剩下來的未結合或游離的*Ag則隨著Ag量的增加而增加；測定*Ag-Ab或*Ag即可推出被測的Ag量。放射免疫分析原理示意圖

標準曲線：

配制一系列已知濃度的標準抗原，分別向其中加入固定量的標記抗原和抗體，反應平衡后，分離抗原的結合部分和游離部分，測定*Ag-Ab的放射性B或游離*Ag的放射性F，計算出結合率B%［B/(B+F)×100%］或其他指標。以B%或B/B0%為縱座標，標準抗原的濃度為橫座標，繪制曲線即為標準曲線(standardcurve)。（一）抗體：

抗體的親和力是抗體與抗原之間相互作用的一種結合能力或強度。親和力大即免疫結合既快又牢固，不易重新解離。Ag+Ab

Ag-Abk1k2親和力的大小用親和常數（affinityconstant）Ka值來表示，Ka＝k1/k2

，一般要求Ka值在1010～1012

L/mol之間。

二、基本試劑親和常數Ka的計算最常用的方法是標準作圖法：即以B/F為縱坐標，以［B］為橫坐標，得到一條直線，其斜率的負數即為Ka標準分析圖抗體的特異性

指抗體分別與相應抗原和抗原結構類似物的結合能力的比較。交叉反應率=ED50（B）/ED50（A）×100%

抗體與相應抗原結合能力強，而與該抗原結構類似物結合能力弱，則特異性高?？贵w與抗原結構類似物的結合稱交叉反應（crossreaction）抗體的滴度指抗體實際應用時的稀釋倍數，稀釋倍數越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價越高。將抗血清稀釋成不同濃度，分別加入定量標記抗原，充分反應后分離B、F，以稀釋度為橫坐標，B0%為縱坐標繪制標準曲線。B0%為30%~50%的稀釋度為最佳稀釋度。（二）標記抗原：

對標記抗原的要求：1．比活度(specificactivity)：比活度越高，靈敏度越高。2．放射化學純度(radiochemicalpurity)：指具有免疫活性的標記抗原的放射性占總放射性的百分率，一般要求大于95%。3．免疫活性：蛋白質分子上標記過多的碘原子就可能引起免疫活性的改變，一般以每個蛋白質分子上只標1～2個125I原子為宜。4．半衰期：合適，保證制造、運輸、分析整個過程。（三）標準品：

對標準品的要求：1．標準品(standard)與被測物應屬同一種物質2．在與抗體發(fā)生反應時，應與被測物具有相等的活性和親和力3．高度純化4．定量精確已知含量并呈梯度濃度的系列標準抗原，做標準曲線用。（1）分離的目的是使抗原抗體復合物和游離抗原分開，以便測量B與F；（2）游離抗體及非標記抗原無放射性，不干擾測量；（3）分離方法主要是使大分子和小分子物質分離。（四）分離方法雙抗體法(測量B)：用抗原免疫動物而產生的抗體稱為第一抗體，用第一抗體再免疫另一種動物所產生的抗體稱為第二抗體。當RIA反應完成后，于反應液中加入第二抗體，第二抗體則與含有第一抗體的免疫復合物B相結合形成第二抗體復合物，其分子量比第一抗體復合物大，可用離心方法分離出來，稱為雙抗體法（doubleantibodymethod）。優(yōu)點：B和F分離較為完全，非特異性結合低，使用方便。缺點：分離時間長，第二抗體用量多，易受反應環(huán)境中蛋白質及鹽含量的影響。雙抗體示意圖沉淀法(測量B)：某些中性鹽和有機溶劑（如聚乙二醇（PEG）或堿金屬中性鹽等）在一定條件下，能使抗體與抗原復合物沉淀。優(yōu)點：本法操作簡便，分離速度快，價格低廉。缺點：分離效果易受pH值、離子強度、溫度、蛋白質含量的影響，且非特異性結合較高。雙抗體＋沉淀法(測量B)：將雙抗體和沉淀法兩者結合進行分離。本法具有兩種方法的優(yōu)點，并克服了雙抗體分離時間長和沉淀法非特異性結合高的缺點?；钚蕴课椒?測量F)：活性炭吸附小分子游離抗原，離心分離后，復合物留在上清液中，游離抗原在沉淀物中，測量沉淀物中的放射性F。優(yōu)點：本法操作簡便，分離速度快，價格低廉。缺點：易于解離，分離效果時間和溫度的影響較大，非特異性結合較高。固相分離法(測量B)：將抗體或抗原通過特殊技術聯結在固相載體上，免疫反應在固相載體上完成，達到平衡后形成固相的Ag-Ab復合物，可與游離部分分離。優(yōu)點：操作簡便，迅速，分離效果好，非特異性結合低。（五）放射性測量儀器γ井型計數器：測γ射線，125I標記液體閃爍計數器：測β射線，3H、14C等標記配計算機系統(tǒng)，自動測量、數據處理、打印結果?；静僮鬟^程：

放免測定一般包括加樣、溫育、分離B與F、測量與數據處理五個步驟放射免疫分析法的必備條件和基本步驟質量控制（qualitycontrol，QC）包括實驗室內質量控制（internalqualitycontrol）與實驗室間質量控制，實驗室內質量控制又包括批內質控與批間質控。三、質量控制(一)實驗室內質量控制：是一個實驗室內部實驗方法的質量控制，以便在一個人的同一批或不同批實驗中，不同操作者和不同方法之間有可比性。

零標準管結合率（B0%）：即最大結合率，指不加非標記抗原時，標記抗原與抗體的結合率，一般要求在30%～50%，該指標主要用來反映標記物與抗體的質量是否穩(wěn)定。非特異性結合率（NSB%）：指不加抗體時標記抗原與非特異物質的結合率，一般要求＜5%～10%。最低濃度管與最高濃度管的結合率之差：＞30%。標準曲線直線回歸的參數：包括截距a、斜率b和相關系數r，要求a、b值穩(wěn)定，r＞0.99。ED25、ED50與

ED75：指標準曲線的結合率在25%、50%和75%時對應的抗原濃度值，它反映標準曲線的穩(wěn)定性，有助于批間結果的比較。質控圖：連續(xù)測定10批以上高、中、低三種已知濃度的質控血清的均數±標準差（x±s），畫出均數線與兩個標準差的范圍，將以后每次實驗測定的高、中、低值標在圖上，即為質控圖。WHO要求在一次實驗中有下列情況之一者，其結果應舍棄：①三種QCS中有一個測定值＞3s；②三種QCS中在同一方向上有兩種＞2s；③三種均在同一方向上＞1s。1、精密度(precision)：批內CV＜5%，批間CV＜5%~10%又稱重復性，指同一樣品在多次重復測定中所得結果的一致程度。以標準差(SD)和變異系數(CV)表示(二)試劑盒質量控制：指測定方法的最小可檢出量，即從生物樣品中能夠檢出某物質的最小濃度。2、靈敏度（sensitivity）：準確度(accuracy)指測定值與已知真實值的符合程度?？捎没厥章剩╮ecoveryrate）來表示:回收率%＝

測定值/真實值×100%一般要求達到90%～110%。3、準確度：5、穩(wěn)定性：4、特異性：取決于抗體的特異性，交叉反應越少，特異性越好。指試劑盒在適宜的溫度等條件下，在有效期內保持原有性能不變的能力。健全性（perfection）是評價被測物與標準品的免疫活性是否相同的指標。用標準曲線與樣品稀釋曲線的平行性分析來判斷方法的可靠性。平行性好者可靠性好。健全性6、健全性：(三)實驗室間的質量控制：實驗室外質量控制是對各實驗室之間測定結果按統(tǒng)一評價方案及方法比較分析，以提高各實驗室之間所得結果的可信性和可比性。

第二節(jié)免疫放射分析(IRMA)一、原理將過量的標記抗體與抗原結合，分離結合的標記抗體與未結合的多余的標記抗體，測定復合物的放射性，其活度與待測抗原的量呈正相關。Ag＋*Ab

Ag-*Ab＋*AbAg：抗原*Ab：標記抗體Ag-*Ab：抗原與標記抗體的復合物二、特點免疫放射分析法有以下特點：1．以標記抗體作為示蹤劑。2．反應動力學：因標記抗體是過量的，且反應是非競爭性的，抗原抗體是全量反應，故反應速度比RIA快。3．靈敏度明顯高于放射免疫分析，約為放射免疫分析的10～100倍。4．標準曲線工作范圍寬。5．特異性高。6．穩(wěn)定性好。7．目前僅限于蛋白質和多肽抗原。三、常用方法抗體夾心法（最常用）：

將分離抗體涂在反應容器的壁上，稱固相抗體。固相抗體先與待測抗原反應，形成固相抗體－抗原復合物，再與標記抗體反應，形成固相抗體－抗原－標記抗體復合物附著在管壁上，傾去上清液直接測量反應容器的放射性。

標記第三抗體法：用雙抗夾心法中的第二抗體（標記抗體）作為抗原免疫其他的動物獲得的抗體為第三抗體。反應后得到固相抗體－抗原－第二抗體－標記第三抗體的復合物。IRMA和RIA的區(qū)別：反應機制不同反應試劑分離方法不同劑量關系反應中的NSBIRMA和RIA工作原理的主要區(qū)別：RIAIRMA競爭性抗原抗體結合反應非競爭性抗原抗體結合反應采用標記抗原采用標記抗體三種主要反應試劑二種主要反應試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的AgAb的量與待測Ag的量呈負相關AgAb的量與待測Ag的量呈正相關反應到達平衡慢反應到達平衡快非特異結合主要影響高劑量區(qū)非特異結合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素一、酶標記的免疫分析法（enzymeimmunoassay,EIA）：將抗原抗體結合的高特異性與酶促反應的高靈敏度有機結合起來，用酶標記抗體（抗原），檢測待測標本中未知抗原（抗體），當相應的抗原抗體特異性結合后，加入相應的酶的底物，酶可以高效專一催化和分解底物，生成有顏色的產物。根據顏色有無和深淺，可以判斷待測標本中有無特異性抗原（抗體）以及量的多少。

可以定性、定量，是一種敏感、特異、簡便、只需一般光譜分析儀器的微量測定技術。

第三節(jié)非放射免疫分析

二、化學發(fā)光免疫分析法（chemicalluminescentimmunoassay，CLIA）：以發(fā)光物質作為標記示蹤物，標記抗原或抗體；是一種超微量分析法。其突出特點是設備簡單，試劑穩(wěn)定，無放射性污染。

如是標記抗原，則待測抗原與熒光標記抗原競爭結合有限量抗體，反應達到平衡后，將游離標記抗原與發(fā)光標記抗原-抗體復合物分離，然后處理復合物，使其發(fā)光物質發(fā)光，其中發(fā)光強度與待測抗原呈負相關；非競爭法中，用發(fā)光物質標記抗體，與IRMA法原理相似。三、時間分辨熒光分析法（timeresolvedf