第二章高效液相色譜法

第二章高效液相色譜法

HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC第一節(jié)概述高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術基礎上建立的一種液相色譜法。一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別二、HPLC與GC差別三、高效液相色譜儀流程圖四、特點一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相：<1mL/min柱效低（H↑，n↓）分析周期長：例，L170*?0.9cm,0.5mL/min,20AA>20h無法在線檢測2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動相：1-10mL/min柱效高（H↓，n↑）分析時間大大縮短：20AA，<1h可以在線檢測二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測占有機物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%續(xù)前2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）三、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置高效液相色譜儀流程圖HPLC裝置高效液相色譜儀/v_show/id_XMjQyODk0OTE2.html?from=y1.2-1-87.4.12-1.12-1-2-11視頻:高效液相色譜儀原理與操作60%乙氰經(jīng)20min等梯度洗脫達100%乙氰，保持10min,流速1.2mL/min,柱溫:10℃,UV：254nm色譜圖續(xù)前四、HPLC的特點和應用

“三高”“一快”“一廣”高柱效：n=104片/米，柱效高（遠高于一般LC）高靈敏度(<10-9)高選擇性分析速度快(<1h)應用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）高效液相色譜的優(yōu)缺點優(yōu)點：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復性好，定量精度高，應用范圍廣適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物缺點：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多目前的發(fā)展趨勢是向生物化學和藥物分析及制備型傾斜；第二節(jié)基本理論和條件選擇熱力學理論：塔板理論——平衡理論基礎動力學理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中分離條件的選擇圖示back續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項及其影響圖示三、HPLC法中分離條件的選擇1.固定相與裝柱方法的選擇：選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm）首選化學鍵合相，勻漿法裝柱2.流動相及其流速的選擇：選粘度小、低流速的流動相——甲醇，1ml/min

3.柱溫的選擇：

選室溫250C左右第三節(jié)各類高效液相色譜法

一、液固吸附色譜法（LSC）二、液液分配色譜法（LLC）三、化學鍵合相色譜法（BPC）一、液固吸附色譜法（LSC）

流動相為液體，固定相為固體吸附劑

1．分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異競爭吸附：Xm+nSa==Xa+nSm

X—溶質(zhì)分子S---溶劑分子（m---流動相a---吸附表面）K==[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]nK----吸附平衡常數(shù)，即分配系數(shù)分離前提：K不等或k不等續(xù)前2．固定相：與LC比，固定相粒徑不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝膠作用特點：柱選擇性好，峰形好適用：分離弱極性化合物表孔硅膠（薄殼硅膠）（1）硅膠全多孔硅膠無定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108

堆積硅珠YQG3~4μm8×108理想

原理：吸附特點：峰易拖尾適用：分離極性化合物續(xù)前3．流動相：底劑（烷烴）+有機極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷或庚烷+氯仿4．影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間5．出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱6．硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液二、液液分配色譜法（LLC）1．分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用

固定液——極性→NLLC（正向）固定液——非極性→RLLC（反向）3．正相色譜——固定液極性>流動相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分三、化學鍵合相色譜法（BPC）（一）化學鍵合相（二）反相鍵合相色譜（三）正相鍵合相色譜（四）離子對色譜（五）離子交換色譜（一）化學鍵合相利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面1．分離機制：分配+吸附（以LLC為基礎）2．特點：1）不易流失2）熱穩(wěn)定性好3）化學性能好4）載樣量大5）適于梯度洗脫（二）反相鍵合相色譜1．分離機制：疏溶劑理論流動相與溶質(zhì)排斥力強，作用時間↑，k↑，組分tR↑流動相與溶質(zhì)排斥力弱，作用時間↓，k↓，組分tR↓2．固定相：極性小的烷基鍵合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問題）3．流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動相極性>固定相極性底劑+有機調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑，洗脫劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF（四氫呋喃）續(xù)前4．流動相極性與k的關系：流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）（三）正相鍵合相色譜1．分離機制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導力、或氫鍵作用力2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動相：極性?。ㄍ琇SC）底劑+有機極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇續(xù)前4．流動相極性與k的關系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結構相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小）分離物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等（四）離子對色譜反相離子對色譜法反相離子對色譜法（IPC或PIC）反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分離子與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離。1）離子對試劑：烷基磺酸鈉→分離陽離子（分析堿）四丁基季胺鹽→分離陰離子（分析酸）2）影響k的因素a．與流動相的極性有關（同反相色譜）b．與R的鏈長有關：R↑長，極性↓小，tR↑，k↑3）適用：較強的有機酸、堿（五）離子(交換)色譜利用固定相中離子交換基團與組分離子的交換能力的不同而達到分離的液相色譜。特別適用分析陰離子固定相：陰離子交換樹脂流動相：電解質(zhì)溶液檢測器：電導檢測器EluentPumpColumnDetectorPumpingSeparationDetectionRecording(Chromatogram）F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-SampleinjectionvalveSuppressorDetectioncellInjection離子色譜儀器構成Column：IonPac

AG12A/AS12A

Eluent：2.7mMNa2CO30.3mMNaHCO3

Flowrate：1.2mL/minDetection：Conductivity(ASRSRecyclemode)0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-陰離子分析實例84小結、液相色譜分類和機理1、液液色譜

正相色譜:固定相為極性、流動相為非極性或弱極性的液相色譜。流出順序:非極性向極性過渡。反相色譜:

固定相為非極性、流動相為極性的液相色譜。流出順序:極性向非極性過渡。正相離子對色譜:固定相為極性、流動相為非極性或弱極性的并含有適當?shù)挠袡C反離子,這種反離子能與組分形成離子對的液相色譜。流出順序:按離子對極性大小流出,極性小的先流出。反相離子對色譜:固定相為非極性、流動相為極性的并含有適當?shù)挠袡C反離子,這種反離子能與組分形成離子對的液相色譜。流出順序:按離子對極性大小流出,極性大的先流出。

小結2、液固色譜固體固定相表面的吸附活性中心對組分的吸附能力不同而達到分離的色譜。

特點:1）.對同系物的選擇性小,不利于同系物的分離,而有利于按族的分離。2）.吸附中心的吸附力與分子的幾何形狀有關,有利于異構體的分離。3）.由于吸附中心主要是表面的硅醇結構,吸附能力大小決定于羥基對組分分子吸附與解吸能力的強弱,因此對流動相含水量要嚴格控制,方能得到良好的重復性。小結3、離子交換色譜

利用固定相中離子交換基團與組分離子的交換能力的不同而達到分離的液相色譜。R+r-+X-==R+X-+r-

R+r-陰離子交換樹脂X-組分離子r-平衡離子4、凝膠色譜(排阻色譜,空間排代色譜)利用固定相凝膠內(nèi)孔穴大小與組分分子大小而進行分離的一種技術,分子體積大,不能滲透到孔穴內(nèi)部去,較快流出色譜柱,相反較慢流出色譜柱。

吸附色譜吸附能，氫鍵異構體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機離子、有機離子分析手性色譜立體效應手性異構體分離，藥物純化

類型主要分離機理

主要分析對象或應用領域親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析小結、液相色譜分類和機理第四節(jié)影響分離的因素1．續(xù)前2．對流動相的要求：1）與固定液不反應2）對樣品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3）與檢測器匹配：UV（常用，測定波長應大于溶劑的截止波長）熒光，電化學4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）使用前過濾、脫氣續(xù)前

3．洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例即不斷改變其極性（兩個泵）適于分析極性差別較大的復雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）圖示第五節(jié)高效液相色譜儀1．輸液系統(tǒng)：恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵：常用2．進樣裝置1）隔膜進樣（高分子有機硅膠墊→進樣室）GC系統(tǒng)壓力較小，可以HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣（早期）2）閥進樣：不必停泵，六通閥續(xù)前3．色譜柱：直徑4~6mm,柱長10~30cm柱效評價：色譜系統(tǒng)適應性試驗R，n，fs（拖尾因子）柱再生：維護、保養(yǎng)、柱子的沖洗4．檢測器1）紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質(zhì)2）熒光檢測器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì)靈敏度高3）示差折光檢測器：利用折光率的差別靈敏度低，溫度要求嚴格4）電化學檢測器5）化學發(fā)光檢測器高壓輸液泵

高壓輸液泵

輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高效液相色譜儀的結構1高壓輸液泵

高壓輸液泵是液相色譜儀的關鍵部件，其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關系到分析結果的重復性和準確性。高壓輸液泵在線脫氣裝置一、輸液系統(tǒng)1高壓輸液泵柱塞往復泵目前多用柱塞往復泵。續(xù)前分析型的柱塞往復泵的容積一般只有0.1～lml，容易清洗和更換流動相。柱塞往復泵屬于恒流泵，流量不受柱阻影響。泵壓一般最高為40Mpa(400kg/cm2)。輸液的脈動性較大是這類泵的主要缺點。目前多采用雙泵補償法克服脈動性。按泵聯(lián)接方式分為并聯(lián)式與串聯(lián)式，后者較多，因為它可節(jié)約一對單向閥。Waters公司等的串聯(lián)輸液泵，兩個泵頭分別用兩個由微機控制的馬達驅(qū)動活塞運動，可達到無脈動溶劑輸出。續(xù)前

兩個柱塞往復泵串聯(lián)：泵1的缸體容量比泵2大一倍，兩者的柱塞運動方向相反。當泵1吸液時，泵2排液；當泵1排液時，泵2吸取泵1輸液的1／2量，另1／2量輸出。如此，泵1彌補了在泵2吸液時的壓力下降，減小了輸液脈沖。

在線脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。除在線脫氣裝置外，目前也采用超聲脫氣、真空脫氣等方式。

脫氣不好時有氣泡，導致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。2在線脫氣裝置梯度洗脫的實質(zhì)是通過不斷地變化流動相的強度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強度來實現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達到ABABCC3梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置按多元流動相的加壓與混合順序，可分為高壓與低壓梯度兩種洗脫裝置。高壓二元梯度洗脫是由兩個輸液泵分別各吸一種溶劑，加壓后再混