微生物檢測基礎

微生物檢測基礎2023/2/71第一頁，共七十三頁，2022年，8月28日一．什么是微生物？

微生物是指廣泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，具有單細胞或簡單的多細胞結構，或沒有細胞結構的一群最低等的生物。

整個微生物家族的主要成員有：病毒、細菌、霉菌、酵母、藍細菌、螺旋體、立克次氏體、衣原體、支原體、放線菌、微細藻類、原生動物。第二頁，共七十三頁，2022年，8月28日病毒

沒有細胞結構的專性寄生的大分子生物。如流感病毒、肝炎病毒（人體病毒），雞瘟病毒、口蹄疫病毒（動物病毒），煙草花葉病毒、番茄叢矮病毒（植物病毒），噬菌體（細菌和放線菌病毒）等。

第三頁，共七十三頁，2022年，8月28日細菌

單細胞原核生物，一般在普通光學顯微鏡（油鏡）下放大一千倍以上并染色才能清楚看見其個體。如人體腸道內的大腸桿菌、糞鏈球菌，用于釀醋的醋酸桿菌，使牛奶變酸的乳酸桿菌，生產味精的谷氨酸短桿菌，生產淀粉酶的枯草桿菌等。第四頁，共七十三頁，2022年，8月28日2023/2/75第五頁，共七十三頁，2022年，8月28日酵母菌

單細胞真菌，最低等的真核生物。一般用高倍鏡（400～600倍）觀察其個體細胞形態(tài)。如面包酵母、釀酒酵母、紅酵母等。第六頁，共七十三頁，2022年，8月28日霉菌

真核生物，單細胞或多細胞絲狀真菌可用低倍或高倍鏡觀察其形態(tài)。如釀制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生產葡萄糖的曲霉菌、生產青霉素的青霉等。

第七頁，共七十三頁，2022年，8月28日藍細菌（藍綠藻）

原核微生物，單細胞或細胞聚合體。第八頁，共七十三頁，2022年，8月28日單細胞，介于細菌與病毒之間的一類原始而小型的原核微生物。

支原體、衣原體、立克次氏體第九頁，共七十三頁，2022年，8月28日微細藻類單細胞藻類。如紅藻、綠藻、小球藻等。

第十頁，共七十三頁，2022年，8月28日原生動物單細胞，無真正細胞壁。如變形蟲、吸管蟲、草履蟲等。

第十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日二．微生物的特性

主要有四個方面種類多分布廣繁殖快易變異第十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日1．種類多

到目前為止，人們已認識的微生物已有10多萬種。

第十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日2．分布廣

微生物因其形體微小，重量輕，故可以隨著風和水流到處傳播。巖石、土壤、海洋、湖泊、河流、大氣。動物、植物、人體表面及與外界相通的腔、道。第十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日3．繁殖快

微生物驚人的生長繁殖速度是其他任何生物都望塵莫及的。一般細菌的世代時間為幾十分鐘到一百多分鐘。在最適宜的條件下，人們最熟悉的大腸桿菌每13～20min就可分裂出新的一代。

第十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日4．易變異微生物容易發(fā)生變異的主要原因是個體多為單細胞或結構簡單的多細胞，甚至非細胞結構，因而在受到外界物理或化學因素影響后，很容易引起細胞內的遺傳物質發(fā)生突變，結果導致遺傳性狀，包括形態(tài)或生理表型上的變異。微生物易變異的另一個原因是細胞增殖速度快，細胞數(shù)量多，因而盡管其自發(fā)突變率很低，也會造成在短時間內產生較多的變異后代。第十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日三．常見微生物的

形態(tài)結構

第十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日第十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日第十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日四．實驗室微生物的培養(yǎng)

第二十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日實驗室中微生物生長（培養(yǎng)）在液體或固體培養(yǎng)基中。細菌生長的培養(yǎng)基應含所有生長的基本需求：水分、碳源、氮源、無機鹽及生長因子等營養(yǎng)物質。細菌生長所需的營養(yǎng)物質第二十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日原養(yǎng)型不需要在培養(yǎng)基中添加另外的成分，而營養(yǎng)缺陷型需要添加生長因子如氨基酸、維生素和含氮堿基。所用的培養(yǎng)基可以是所有成分及含量確切知道的限定培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基）和含有不確定營養(yǎng)物混合物的天然培養(yǎng)基。第三十頁，共七十三頁，2022年，8月28日

瓊脂（洋菜）是用來固化液體培養(yǎng)基的。選擇培養(yǎng)基或鑒定培養(yǎng)基是用來檢測特定微生物類群的。第三十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日生長培養(yǎng)基實驗室中細菌通常生長（培養(yǎng)，cultured）在搖瓶、瓶子或稱作發(fā)酵罐的大培養(yǎng)容器液體培養(yǎng)基中或在圓的、通常為塑料、滅菌碟子培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基中。將微生物引種在這些培養(yǎng)基上稱為接種（inoculation）。第三十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基的性質取決于微生物的天然環(huán)境和微生物生長的營養(yǎng)要求。分離大量微生物用液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基用于個別細菌的分離和保存。第三十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日限定培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基含有通常為特定微生物生長基本要求的確定成分。通常是簡單的（最低的）、含有最低生長要求的培養(yǎng)基。第三十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日

天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基含有不確定的成分如蛋白胨（大豆粉酶消化液）和提供足夠營養(yǎng)成分的酵母提取物（氨基酸、維生素、糖和堿基），適合廣泛范圍微生物的生長。天然培養(yǎng)基如營養(yǎng)肉湯（NB）和胰胨、豆胨肉湯（TSB）是實驗室中常規(guī)用的細菌培養(yǎng)基，特別對生長要求還未確定的細菌生長使用。第三十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日常用血液作培養(yǎng)基的附加成分分離人類病原菌，由于它提供許多難養(yǎng)的人類病原菌生長的基本營養(yǎng)，如鏈球菌。特殊的選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基經常用于分離特定的微生物類群，尤其在醫(yī)院的實驗室中。第三十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基設計這些培養(yǎng)基是為選擇特定類群的微生物或鑒別兩種菌種時用。選擇培養(yǎng)基含有抑制非目的細菌生長的成分，鑒別培養(yǎng)基是添加某種營養(yǎng)物或／和化學物質，促進所要的微生物生長，使在鑒別培養(yǎng)基平板上兩種不同的微生物的菌落可以區(qū)分開來。第三十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日生長的環(huán)境條件溫度氧濃度PH水活度第三十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日溫度

嗜冷微生物適合于－10℃生活的細菌，最適生長溫度在20℃左右。嗜溫微生物生長溫度在15～45℃之間，最適生長溫度在37℃左右的細菌。嗜熱微生物生長溫度在30～75℃之間，最適生長溫度在55℃，在100℃以上溫度生長，稱為嗜高熱微生物。第三十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日氧濃度

根據(jù)細菌對氧要求的不同分為好氧菌，厭氧菌，包括專性厭氧菌、兼性厭氧菌、嚴格厭氧菌和耐氧菌微好氧在正常大氣氧濃度20﹪情況下就受到損傷，只能在更低的氧濃度下才能存活。

第四十頁，共七十三頁，2022年，8月28日pH值嗜堿菌（alkaliphiles）：生長在高pH（8.5～11.5）的微生物。嗜酸菌（acidophiles）：生長在低pH（0～5.5）中的微生物。第四十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日水活度像所有生物一樣，微生物對周圍環(huán)境的滲透壓是敏感的。低滲透壓時，水將聚集于細胞內，高滲透壓時水逸出。

第四十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日五．微生物的生長第四十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日1．細菌以二等分裂方式（1→2→4）分裂，細菌的生長為指數(shù)生長。群體細胞數(shù)目加倍所需的時間為倍增時間（td）。第四十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日細菌典型生長曲線

log10

穩(wěn)定期（平衡期）活細對數(shù)期衰亡期（死亡期）胞延遲期（指數(shù)期）數(shù)（延滯期）

培養(yǎng)時間第四十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日2．真菌的生長

真菌是絲狀的、無光合作用的、營異養(yǎng)性營養(yǎng)的真核微生物。第四十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日真菌生長的各個時期

穩(wěn)定期細減速期胞直線期自溶期

數(shù)

目延遲期指數(shù)期

培養(yǎng)時間第四十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日3．微生物生長的測定方法微生物的生長可用原生質的增加、細胞數(shù)目的增加或以代謝活動情況作指標。根據(jù)細胞的干重或某一化學成分如總氮含量數(shù)量很少，以至誤差很大。最常采用的微生物生長的方法是統(tǒng)計群休數(shù)目。第四十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日(1)活菌計數(shù)法有時一個菌落并非絕對地都是由一個單細胞所長成的，往往兩個或兩個以上相連結的細胞只長成一個單菌落；有些細胞比其它細胞較早地分裂，分裂的速度也快，于是它就首先出現(xiàn)可見的菌落，而其它的細胞較遲才出現(xiàn)菌落，所以，必須培養(yǎng)足夠長的時間，才能使所有的菌落增至足以肉眼看見的大小，一般至少需要24-48小時，有些生長較緩慢的微生物甚至需要幾天至一星期；此外，要控制培養(yǎng)皿內出現(xiàn)的菌落數(shù)不宜過多。第四十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日（2）計算器法將待檢菌液充分混勻，注入改良紐氏血球計數(shù)板，計數(shù)一定量的菌液中所含菌數(shù)，計算出每毫升所含菌數(shù)。第五十頁，共七十三頁，2022年，8月28日（3）比濁法

據(jù)細菌懸浮液的透光量間接測定細菌的數(shù)量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內與光的穿透量成反比，與光密度成正比。對于絲狀真菌的生長率，可以根據(jù)菌絲的生長長度或菌絲增加的重量。第五十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日六．微生物生長的控制

使工作者免受他們所研究的微生物傷害和所研究的微生物培養(yǎng)物不受環(huán)境中其他微生物污染的方法稱作無菌（滅菌）技術。

第五十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日1．滅菌方法第五十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日

方法有效性應用濕熱滅菌法

煮沸/蒸氣處理殺死多數(shù)細菌、真菌的營養(yǎng)細胞和病毒——對芽孢無效碟子、盆，對熱抗性的器具高壓滅菌器15磅/英寸2121℃殺死所有的營養(yǎng)細菌和芽孢，滅菌時間長短取決于大存在的微生物數(shù)量培養(yǎng)基、溶液、器具，任何經受熱和壓力的物品巴斯德消毒法71.7℃15秒液體熱處理但不能殺滅所有細菌。風味改變最少牛奶、果汁等第五十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日方法有效性應用間隙滅菌法

三次用90～100℃煮沸10分鐘處理，每次處理間隔24小時第一天殺死營養(yǎng)細胞，在間隔期間任何孢芽萌發(fā)下一次加熱處理時再殺死不能被高壓滅菌的培養(yǎng)基，但對熱有相對的抗性干熱滅菌法灼燒法熱空氣滅菌法熾熱直接加熱200℃（160～170℃――譯者注）2小時，破壞細胞和芽孢接種環(huán)玻璃器具第五十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日方法有效性應用過濾除菌濾器――孔徑大小0.22～0.45μm不能除去病毒不能加熱處理的液體輻射UV線――非電離不能很好穿透材料物體表面和空氣滅菌γ射線――電離穿透能力好藥物、塑料制品第五十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日自動高壓蒸汽滅菌鍋2023/2/757第五十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日2．消毒劑與防腐劑消毒劑是用于非生命體殺菌的化學物質防腐劑是能殺死微生物或抑制微生物生長的化學物質，這類物質對活組織是無毒性。第五十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日防腐劑用于健康有關的方面作用模型防腐劑有機汞表皮與蛋白質的SH基團結合硝酸銀防止新生兒感染淋病奈瑟氏菌引起的失明蛋白質沉淀劑碘液表皮碘化蛋白質中的酪氨酸殘基；氧化劑酒精（70﹪乙醇）表皮脂溶劑和蛋白變性劑雙酚類（六氯酚）肥皂、洗滌劑、除臭劑破壞細胞膜第五十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日防腐劑用于健康有關的方面作用模型陽離子去污劑（四胺基化合物）肥皂、洗滌劑與細胞膜中的磷脂相作用過氧化氫表皮氧化劑消毒劑二氯化汞桌子、臺面、地板與巰基結合游泳池和生活用水的滅藻劑蛋白質沉淀劑蛋白質沉淀劑碘液醫(yī)療器械碘化酪氨酸殘基第六十頁，共七十三頁，2022年，8月28日防腐劑用于健康有關的方面作用模型氯氣凈化生活用水氧化劑氯化物牛奶廠、食品工業(yè)設備、生活用水氧化劑陽離子去污劑（四胺基化合物）醫(yī)療器械、食品、制酪設備與磷脂作用環(huán)氧乙烷（氣體）實驗室中的熱敏感材料如塑料烷基化試劑臭氧飲用水強氧化劑第六十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日七．微生物的觀察第六十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日1．細菌的染色原理：細菌是無色透明的。在光學顯微鏡下，菌體與其背景相差很小，不易看清細菌的形態(tài)和結構，故通常要對細菌用染料染色，以增加菌體與背景的反差，便于在光學顯微鏡下觀察。第六十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日細菌染色所用的染料，按其所帶電荷狀態(tài)分，堿性染料和酸性染料。堿性染料：結晶紫、龍膽紫、堿性品紅（復紅）、蕃紅、美藍、甲基紫、中性紅、孔雀綠等。酸性染料：酸性品紅、剛果紅、曙紅等。在通常的培養(yǎng)條件下細菌帶負電，堿性染料帶正電荷，易與菌體的酸性物質（帶負電荷的細胞成分有核酸和酸性多糖）牢固地結合。所以，多采用堿性染料染色。只有在分枝桿菌屬（Myoobaoterium）或諾卡氏菌屬(Macardia)中的一些菌才能用酸性染料（石碳酸品紅）染色（抗酸性染色）。第六十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日方法簡單染色和復合染色法。簡單（單）染色法只用一種染料染菌體，目的僅為增加反差，便于觀察。復合（雜）染色法是用兩種染料染色，以區(qū)別不同細菌的革蘭氏染色反應或抗酸性染色反應；或將菌體和某一結構染成不同顏色，便于觀察。第六十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日革蘭氏染色法革蘭氏染色是最普通的細菌染色之一，根據(jù)它們細胞壁的結構，把細菌分成兩類。革蘭氏陽性細菌細胞圍繞原生質膜的外膜是由厚的肽聚糖層組成。革蘭氏陰性細菌只有一個薄的外部的肽聚糖層，但在其外面還有第二層胞壁外膜。革蘭氏陽性細菌用乙醇沖洗時保留了結晶紫和碘的復合物，因此光學顯微鏡下呈現(xiàn)紫色。革蘭氏陰性細菌由于它們失去了結晶紫和碘的復合物，并且吸收了較淺的石炭酸復紅，復染成粉紅色。第六十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日革蘭氏染色法2023/2/767第六十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日（1）用接種環(huán)取少量細菌在干凈的載玻片上涂布、固定。（2）用草酸銨結晶紫染色。（3）用弱酸性媒劑碘―碘化鉀溶液媒染。（4）用中性脫色劑，如乙醇或丙酮脫色，能被脫色的叫革蘭氏陰性菌，其菌體無色；不能被脫色的叫革蘭氏陽性菌，其菌體呈紫色。（5）以上四步已能區(qū)分兩大類細菌，為了使革蘭氏陰性菌易被觀察，還需用與草酸銨結晶紫顏色鮮明對比的品紅或蕃紅復染。經脫色的革蘭氏陰性菌被染上紅色，沒有脫色的革蘭氏陽性菌染不上紅色，仍呈紫色。革蘭氏染色法步驟第六十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日八．微生物的分離

第六十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日細菌的純培養(yǎng)實驗室中通常需要細菌的純培養(yǎng)，即所有的細胞都來自同一個最初的細菌。采用劃線平板法和傾注平板法接種細菌到瓊脂平板以獲得彼此分離的單個細菌細胞。經合適溫度培養(yǎng)后，每一個細菌形成一個肉眼可見的菌落，含有相當于109個細菌細胞。第七十頁，共七十三頁，2022年，8月28日

劃線劃線燒接種環(huán)