引物設計和實時熒光定量pcr

引物設計和實時熒光定量pcr第一頁，共七十八頁，2022年，8月28日一、熒光定量PCR技術的基礎理論第二頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、熒光定量PCR技術概論熒光定量PCR技術產生并成熟于上世紀90年代，由于該技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠對PCR反應的全過程進行實時監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技術從產生到現(xiàn)在短短的十幾年時間，在科研及檢驗領域獲得了廣泛的應用，成為分子生物學領域不可或缺的一項重要技術。第三頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、熒光定量PCR技術概論熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號隨著PCR反應的積累來實時監(jiān)控PCR反應的進程，并通過分析軟件對PCR的反應進行檢測分析的技術。系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

第四頁，共七十八頁，2022年，8月28日常規(guī)PCRvs實時PCR常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應的終產物進行半定量及定性分析定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析第五頁，共七十八頁，2022年，8月28日常規(guī)PCRvs實時PCR優(yōu)缺點比較

定量PCR

常規(guī)PCR靈敏度高高精確度安全省時只能進行半定量或定性分析不安全易污染費時費力第六頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、熒光定量PCR常用的三個概念擴增曲線、閾值、CT值（1）、擴增曲線及擴增曲線的兩種形式

左圖反映的是隨著PCR反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號的變化量的對數(shù)與PCR反應循環(huán)數(shù)的關系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時具有簡單明了的特點，所以很多軟件都采用右圖的形式，當然了，這兩種實時擴增曲線可以根據實驗的需要相互轉換。第七頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、熒光定量PCR常用的三個概念（2）、閾值線在熒光定量PCR擴增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。第八頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、熒光定量PCR常用的三個概念（3）、CT值

PCR過程中，各樣品擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時，所經過的擴增循環(huán)數(shù)。第九頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學基礎熒光定量PCR是隨著PCR循環(huán)的進行，以熒光信號強度的積累來實時反映PCR反應進程的。理想的熒光物質需具備以下特點：（1）、本底低（2）、熒光強度高（3）、每輪PCR反應完成后都有熒光強度的增高，而且這種熒光強度的增高和每輪循環(huán)后PCR產物的量成線性關系（4）、沒有PCR產物時，沒有熒光（5）、該熒光物質的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長范圍窄，各種熒光不會產生熒光的交叉干擾第十頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學基礎目前常用的幾種熒光物質（1）、Taqman探針類5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團，探針完整時，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團產生熒光；探針本身序列與目的基因序列互補，特異性高，退火后探針與目的基因互補序列結合，隨著PCR反應的進行，在Taq酶5’---3’外切酶的作用下，探針水解斷裂，熒光產生。第十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學基礎Taqman常用的熒光基團和淬滅基團熒光基團：5’端常用熒光基團FAM標記，最佳激發(fā)光波長：494-495nm，最大發(fā)射光波長：518-520nm。淬滅基團：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。

TAMRA本身也是一種熒光基團，激發(fā)光波長范圍較寬，500—560nm，最佳激發(fā)光波長在560nm附近，對FAM基團產生的發(fā)射光具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長較寬，560—650nm，當做多重熒光時，容易產生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已不常用。

BHQ和ECLIPSE為非熒光物質，只是一種熒光淬滅劑，本身不會產生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團較為常用，尤其在多重熒光定量PCR時常常被采用。第十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學基礎Taqman探針的特點及應用（1）、特異性強、準確性高本身具有序列特異性，保證了所檢測目的基因的特異性；其結構特點保證了其所產生的熒光強度與PCR產物的量成正比關系，因此準確性極高。（2）、對引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的Taq酶就能滿足實驗的要求。（3）、常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達幾十個拷貝)

及基因表達變化的精確分析（精確度可達0.1倍的變化）。（4）、目前價格也不是太貴，2OD1000.00左右第十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學基礎（2）、熒光染料類目前常用的熒光染料為SYBRGreenⅠ、SYBRGreenⅡ、

SYTO9、HRM等。其共同性質為：（a）、結合于雙鏈核酸的小溝處（b）、與雙鏈DNA結合后受激產生熒光（c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失第十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學基礎熒光染料的特點及應用（1）、能夠與所有的核酸雙鏈結合，受激后產生熒光，其熒光的強度與雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；（2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；（3）、SYBRGreenⅠ染料本身價格便宜，但是做熒光定量PCR時對引物設計的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStarTaq酶，或者操作時需要嚴格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴增會嚴重干擾結果的準確性，尤其是模板含量較低時；（4）、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；（5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。（6）、對PCR反應的毒性，能抑制PCR反應，降低PCR反應的效率。第十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日兩種化學試劑的比較化學試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測階段SYBRGreenI結合于雙鏈DNA的小溝中否延伸TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟第十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、熒光定量PCR的數(shù)學原理對于普通的PCR反應來說

n

Xn=X0（1＋E）上式中，

Xn為n輪PCR循環(huán)后，目的基因PCR產物的量；n為PCR循環(huán)數(shù)；X0為目的基因的初始模板量，E為PCR的反應效率，0≤E≤1。第十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、熒光定量PCR的數(shù)學原理

由于PCR反應體系中熒光物質的熒光強度與PCR產物的量成正比，所以用熒光強度來代替PCR產物的量，我們可以得到：

Rn=RB+X0(1+E)Rsn總熒光信號強度=本底信號+分子數(shù)量×單位信號強度Rn：第n個循環(huán)時的總信號RB：本底RS：單位信號強度X0：起始DNA數(shù)目E：PCR效率第十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、熒光定量PCR的數(shù)學原理當循環(huán)數(shù)n等于CT值時，所有樣品熒光信號強度變化量的對數(shù)全部一致，都達到了閾值。

RT=RB+X0(1+E)Rslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs

此時，PCR反應處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應效率E穩(wěn)定且近似相等；lg(RT-RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0為變量，且這兩個變量之間成一次性方程。也就是說，所有樣品的lgX0與到達閾值時的循環(huán)數(shù)n（Ct值）呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量CT第十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析CTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs（1）、PCR效率相等，在PCR擴增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)；（2）、RT

–RB要相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒光本底之差要相等；（3）、樣品的單位信號強度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團時，Rs就是每條PCR產物結合熒光染料后所發(fā)出的熒光強度，此熒光強度和

PCR產物的長短有關，PCR產物越長，結合的熒光染料越多，Rs值越大；用探針做熒光基團時，Rs就等于PCR反應時，Taq酶水解掉探針，探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度，和PCR產物的長度沒有直接關系。第二十頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析左圖橫坐標是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度Rn，改圖反映的是各個樣品隨著每輪PCR反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度與熒光本底的差值RT–RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的RT–RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關系才會成立。第二十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據未知樣品Ct值，就可以在標準曲線上計算出未知樣品初始模板量。第二十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日6、雙鏈核酸的熔解曲線分析使用熒光染料作為熒光基團時，由于熒光染料的特性隨著PCR反應的進行，雙鏈PCR產物呈指數(shù)增長，SYBRGreenⅠ與雙鏈PCR產物結合后熒光越來越強，當PCR反應結束時，熒光強度達到最大，此時對PCR產物進行緩慢加熱，從50℃一直加熱到99℃，在此過程中PCR產物按照TM值的大小雙鏈被依次打開，熒光強度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：第二十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日6、雙鏈核酸的熔解曲線分析對于核酸序列相同的PCR產物，其TM值也相同，而且其TM值在一個很小的溫度范圍內，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強度急劇降低，以熒光強度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：第二十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日6、雙鏈核酸的熔解曲線分析上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈，在一定的離子強度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不同，所以通過熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異，通過熔解曲線也能分析出來。電泳是通過核酸分子量的大小和構象來分析的，熔解曲線是根據雙鏈核酸的TM值來分析的，這與瓊脂糖電泳及SSCP有異曲同工之處。第二十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達的相對定量分析

研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。

實驗操作中，由于樣品選取時樣品的細胞個數(shù)不可能完全相同，RNA提取時得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調控研究中都會用一些看內參基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的內參基因是在各種生理條件下表達量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作內參照，常用的內參基因有RPS16基因、GAPDH基因、β-Actin基因、18srRNA基因等。第二十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達的相對定量分析以上公式就是引入內參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對定量的分析方法：雙標準曲線法和Delta-deltaCt法。第二十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達的相對定量分析（1）、雙標準曲線法所謂的雙標準曲線法就是對每個樣品的內參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。（2）、2-△△CT法該方法的前提條件是目的基因和內參基因的擴增效率相同且都為1，在試驗開始前必須分別對目的基因和內參基因作標準曲線，看兩者擴增效率的差別，假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中，無需再做標準品。第二十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達的相對定量分析（2）、2-△△CT法

該方法的前提條件是目的基因和內參基因的擴增效率相同且都為1，在試驗開始前必須分別對目的基因和內參基因作標準曲線，看兩者擴增效率的差別，假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中，無需再做標準品。該方法要求嚴格的重復，因為CT值的差異只要有很小的變化，測得的結果就會有很大的差別。該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。第二十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、引物設計及原則第三十頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、染料法引物的設計原則：（1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構；（3）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子；（4）、引物之間的TM相差避免超過2℃；（5）、典型的引物18到24個核苷長；（6）、目的基因和內參基因所擴增的PCR產物長度盡量一致，不大于

300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同（7）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做BLAST分析其特異性

第三十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、Taqman探針及引物的設計原則：

在Taqman探針法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，還要5’-3’外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光，普通PCR的延伸溫度為72℃，此溫度為Taq酶聚合作用的最佳溫度；Taqman探針法反應中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活性的同時，還需要Taq酶5’-3’外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光，Taq酶5’-3’外切酶活性的最佳溫度為60℃，所以TaqmanPCR反應的一般采用兩步法，即95℃變性，60℃復性延伸。

在Taqman探針及引物的設計過程中，引物的TM值已經確定為60℃左右，在每輪PCR循環(huán)的復性過程中（95→60℃），為了確保探針先于引物與模板結合，這就要求探針的TM值高于引物10℃左右，所以Taqman探針及引物一般都是引物TM值為60℃左右，探針的TM值為70℃左右。第三十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、Taqman探針及引物的設計原則：（1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子；（3）、引物TM值為60℃左右，探針的TM值為70℃左右；（4）、探針的5’端應避免使用鳥嘌呤G，因為5’G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用；

（5）、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量G含量高會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針；（6）、引物之間的TM相差避免超過2℃；（7）、典型的引物長度為18-24bp，探針長度為15-45bp；（8）、PCR產物長度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同；（9）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做BLAST分析其特異性

第三十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、Taqman探針及引物的設計原則：探針中GC含量的差異對定量PCR反應效率的影響第三十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、Taqman探針及引物合成時注意事項（1）、引物及探針設計好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通

PCR，電泳檢測PCR產物，看是否和設計的長度吻合，再看看非特異性擴增情況，必要時進行PCR產物的測序驗證；（3）、確定引物沒有問題后，再將探針送交合成，這樣安排能避免很多以外的損失；（4）、探針合成好后，先檢測一下探針的質量，250nm的探針終濃度，

25ul水，反應體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上檢測，

95℃，2min;95℃，20s，60℃，20s，40個cycles；看熒光本底和熒光強度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應，熒光強度不會變化，假如熒光強度變化的比較大，說明探針合成質量較差，建議重新合成。第三十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、引物設計的具體步驟及操作詳解（1）、在Pubmed中查找引物基因的全序列；第三十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日（2）、用primer3.0引物序列及大小設計；在網頁中搜索Primer3第四十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日將上一步中在Word中粘貼的基因序列信息，復制到Primer3中，如圖：第四十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（3）、在Pubmed中找引物序列中各個內含子外顯子片段構架，確保設計的引物序列跨兩個外顯子；第四十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第五十頁，共七十八頁，2022年，8月28日三、內參基因的選擇第五十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、理想的內參基因具有的特點（1）、不存在假基因；（2）、高度或中度表達，排除太高或低表達（3）、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞)，而且其表達量是近似的，無顯著性差別；（4）、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關；（5）、其穩(wěn)定的表達水平與目標基因相似；（6）、不受任何內源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。理想的內參基因很少或者說不存在，因為所有基因在不同的細胞或組織中、在細胞的不同生理時期、在不同的理化等外界刺激下，其表達量都會有所差異，有時可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。盲目地使用一種看家基因作為內參，一方面可能使基因表達的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能引致錯誤甚至相反的結論。第五十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、常用內參基因的表達情況（1）、GAPDHGAPDHmRNA在不同癌組織(包括肺癌、乳腺癌、腎細胞癌等)中的表達升高，在不同個體間、懷孕期間以及細胞周期的不同階段等變化很大，在正常的結腸上皮、人類前列腺癌的細胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變化。在各種因素(例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等)刺激下，培養(yǎng)細胞GAPDHmRNA的表達水平也不同。（2）、β-actin

當細胞向惡性轉化時，β-actinmRNA的表達水平增加。（3）、Rps16等第五十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、內參基因的選擇策略根據實驗的實際情況，不同組織、不同細胞、細胞的不同生理時期、不同的理化條件刺激等，查閱相關資料，選取三、四合適的內參基因，做熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內參，其他幾條內參基因與其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達穩(wěn)定，適合作為理想的內參。也可用geNorm內參分析軟件來選擇合適的內參基因。對于比較精確的實驗，最好采用兩種或兩種以上表達穩(wěn)定的基因作為內參，對每種內參基因測得的基因表達變化求方差和平均值。

第五十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日四、定量PCR的實驗設計和數(shù)據處理第五十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR實驗方案定量PCR實驗方案熒光染料法Taqman探針法雙標準曲線法2-△△CT法雙標準曲線法2-△△CT法第五十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR實驗方案（1）、染料法適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。（2）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達幾十個拷貝)

及基因表達變化的精確分析（精確度可達0.1倍的變化）。（3）、雙標準曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求較高的實驗。（4）、2-△△CT法適合檢測精度要求一般，樣品量相對較少，檢測的基因種類相對較多的實驗。

根據實驗的實際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、經費情況等來選擇合適的實驗方案。第五十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應的模板濃度（DNA，RNA）相對定量：計算初始反應模板的相對含量第五十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR--絕對定量標準品，標準曲線已知濃度的相應DNA模板，按不同濃度稀釋根據實時PCR反應得到相應的C(t)，構建標準曲線樣品與標準品同時進行PCR反應得到未知濃度樣品的C(t)值unknown104103第五十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日使用定量PCR進行絕對定量的優(yōu)勢敏感性高檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢測100—1010省時有效第六十頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR--相對定量相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達差異（倍數(shù)關系）相對定量的問題樣品材料不均一造成的差別內標基因內標通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（內標基因的表達要相對恒定，表達不受處理因素影響）對目的基因進行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差第六十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日SYBRGreenI法進行相對定量的問題問題：SYBRGreenI可以與非特異性雙鏈結合非特異產物信號結果不準確解決辦法：引入熔鏈曲線分析第六十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日熔鏈曲線分析決定退火溫度Non-specificproductspecificproductspecificproduct第六十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日五、實時定量PCR兩種相對定量方法比較相對雙標準曲線法和2-ΔΔc(t)

法第六十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日1.相對標準曲線法用目標基因和內標基因的標準品分別獲得標準曲線處理與未處理樣品同時擴增目標基因和內標基因，獲得C(t)值用內標基因對目標基因均一化處理樣本與未處理樣本目標基因C(t)值經內參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達差異適用范圍目標基因與內標基因擴增效率差異較大擴增效率較低第六十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日2.2-ΔΔc(t)

法公式推導M:目標基因，N：內標基因XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值)(1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值)(2)均一化(1)/(2):X0M/X0N=2C(t)N-C(t)M=2-ΔC(t)處理2與處理1相比：

(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t)ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)當有多個樣品時（如時間點），各樣品均一化后都與同一時間點相比第六十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日一般步驟選定目標基因和內標基因設計一步法或兩步法RT-PCR反應數(shù)據獲得及處理目標基因C(t)值（處理，未處理）內標基因C(t)值（處理，未處理）計算2-ΔΔc(t)

作圖適用范圍當擴增效率較高，且目標基因和內標基因擴增效率比較一致不做標準曲線，高通量檢測第六十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范1、誤差分析（1）、實驗方案本身的誤差熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差；

2-△△CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起誤差；

Taqman探針法誤差相對較小；雙標準曲線法誤差相對較小。（2）、儀器設備引起的誤差測量標準品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質量再到摩爾量，誤差本身就很大（雙標準曲線法不一定非要測標準品的濃度）；定量PCR儀的誤差耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等第六十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范1、誤差分析（3）、相對定量時內參基因表達不穩(wěn)定引起的誤差（4）、操作引起的誤差樣品處理、選取、核酸提取、反轉錄、加樣，操作過程中引起的誤差。2、操作規(guī)范熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗，同時又是花費很高的一項實驗，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達到這個目標，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。（1）、樣品的處理及選取處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白鼠攝食；選取試驗樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。第六十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范2、操作規(guī)范（2）、核酸提取加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質要去除干凈，確保得到高質量的核酸，分光光度計檢測核算質量，RNAOD260/280＝

2.0左右，DNAOD260/280＝1.8左右，最好再做電泳檢測；同一樣品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（3）、得到的RNA立即反轉錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉錄所得

cDNA要用看家基因檢測。（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內做內參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達恒定基因作為內參。（5）、做定量PCR時，先把除模板外的所有試劑預混，然后分裝到PCR管中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。（6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。第七十頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范2、操作規(guī)范（7）、重復操作讓重復操作最大的修正偏差？最有意義的重復是在提取樣品RNA時就重復，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉錄，所得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復之所以最有意義是因為我們是把RNA提取、反轉錄、上機檢測三步做了重復，這樣得出的平均值要比只在上機檢測時對同一cDNA樣品做三個重復要有意義的多。

同一個cDNA樣品做三個重復定量檢測求平均值主要是消除