蛋白質(zhì)的分離純化

關(guān)于蛋白質(zhì)的分離純化第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的分離純化透析和超過濾超速離心層析（色譜）

(chromatography)電泳

(electrophoresis)第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日1透析和超過濾

P302第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日2超速離心

P302第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日

基本原理：層析由流動相和固定相組成樣品作為流動相流過固定相各組分在兩相中分布程度不同各成分遷移率不同分離3層析（色譜）（Chromatography）

P148第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日兩相：固定相（靜相）和流動相（動相）有效分配系數(shù)：第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日層析按流動相：氣相、液相色譜等；按操作形式不同：紙層析、薄層層析、柱層析等；按分離機(jī)制：凝膠層析、離子交換層析、親和層析、吸附層析等。第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.1紙層析

（Filter-paperchromatography）相對遷移率

P151第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.2薄層層析

（Thin-layerchromatography）

P152第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.3柱層析第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日①凝膠過濾層析

(分子排阻層析、分子篩層析）

（Gel-filtrationchromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。

P303第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日介質(zhì)：凝膠顆粒（多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。z的分級分離范圍交聯(lián)葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）瓊脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日原理：第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日②離子交換層析

（Ion-exchangechromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。介質(zhì)：離子交換樹脂溶液中的離子與樹脂上的帶電基團(tuán)進(jìn)行交換反應(yīng)；各種離子交換能力不同，與樹脂結(jié)合的牢固程度就不同；在洗脫過程中，各種離子遷移率不同，達(dá)到分離的目的。

P152和310第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日茚三酮反應(yīng)：生成紫色物質(zhì)脯氨酸和羥脯氨酸生成黃色物質(zhì)

氨基酸的定性定量第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日

根據(jù)蛋白質(zhì)與特異的配體相互作用來分離的。蛋白質(zhì)＋配體蛋白質(zhì)配體復(fù)合物③親和層析

(Affinitychromatography)

P313第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日④高效液相層析（High-Performanceliquidchromatography,HPLC）

P154和314也分為凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析等特點(diǎn)：固定相支持劑顆粒細(xì)采取高壓，洗脫速度增大第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日4電泳(Electrophoresis)在外電場存在下，利用蛋白質(zhì)分子攜帶的凈電荷不同以分離混合物ArneTiselius獲1948年諾貝爾化學(xué)獎

P307第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日4.1凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠（蛋白質(zhì)和多核苷酸）瓊脂糖凝膠（核酸）第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日電泳儀水平電泳槽垂直電泳槽第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）不連續(xù)：濃縮膠和分離膠電泳遷移率決定于所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。+凝膠加樣

P309第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日巰基乙醇：打開二硫鍵。SDS：變性劑，破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。

SDS以其氫鍵與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體。①帶有很多負(fù)電荷——遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有電荷②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象：近似雪茄煙形的長橢圓棒，

短軸長度相同，長軸長度隨蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量成正比例變化。遷移率主要取決于蛋白質(zhì)相對分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日遷移率第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日4.2等電聚焦電泳高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。在外電場的作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，并形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02pH單位的差別就能分開。

P310第三十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日第三十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日等電聚焦電泳電泳時(shí)，每種蛋白遷移至與它的pI相一致的pH處加入蛋白樣品電場作用下在凝膠中建立穩(wěn)定的一個(gè)pH梯度第三十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日第三十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日等電聚焦電泳+SDS-PAGE第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點(diǎn)；再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離.4.3