微生物藥物學(xué)第二十二章生物轉(zhuǎn)化的類型和機(jī)制

微生物藥物學(xué)第二十二章生物轉(zhuǎn)化的類型和機(jī)制第一頁，共八十三頁，2022年，8月28日在許多國(guó)外文獻(xiàn)中經(jīng)常能夠看到的描述這種技術(shù)的名詞有：microbialtransformation;microbialconversion;BiotransformationBioconversionBiocatalysisenzymation等。第二頁，共八十三頁，2022年，8月28日微生物(酶)轉(zhuǎn)化是有機(jī)化學(xué)反應(yīng)

中的一個(gè)特殊的分支微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是某種微生物將一種物質(zhì)（底物）轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)（產(chǎn)物）的過程，這一過程是由某種微生物產(chǎn)生的一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶作為生物催化劑進(jìn)行的一種或幾種化學(xué)反應(yīng)，簡(jiǎn)言之，即為一種利用微生物酶或微生物本身的合成技術(shù)。第三頁，共八十三頁，2022年，8月28日微生物(酶)轉(zhuǎn)化是有機(jī)化學(xué)反應(yīng)

中的一個(gè)特殊的分支這些具有生物催化劑作用的酶大多數(shù)對(duì)其微生物的生命過程也是必需的，但在微生物轉(zhuǎn)化過程中，這些酶僅作為生物催化劑用于化學(xué)反應(yīng)。由于微生物產(chǎn)生的這些能夠被用于化學(xué)反應(yīng)的大多數(shù)生物催化劑不僅能夠利用自身的底物及其類似物，且有時(shí)對(duì)外源添加的底物也具有同樣的催化作用，即能催化非天然的反應(yīng)（unnaturalreactions）。第四頁，共八十三頁，2022年，8月28日在研究一個(gè)微生物（或酶）

轉(zhuǎn)化過程時(shí)，需要考慮的問題所用轉(zhuǎn)化底物的選擇；所用微生物對(duì)不同底物轉(zhuǎn)化能力的考察、轉(zhuǎn)化路線或轉(zhuǎn)化反應(yīng)的選擇等；其中最主要的是尋找適合于所設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化過程的微生物，以及如何來提高這種微生物的轉(zhuǎn)化能力，即提高這種酶活力；再則是發(fā)現(xiàn)一種新的酶或一種新的反應(yīng)以便為設(shè)計(jì)一個(gè)新的微生物轉(zhuǎn)化過程提供一條線索。

第五頁，共八十三頁，2022年，8月28日用于轉(zhuǎn)化的微生物或酶的多樣性用于微生物轉(zhuǎn)化的菌株或酶的篩選的范圍應(yīng)該盡可能地廣，因?yàn)橹聊壳盀橹挂呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了3000余種能夠催化各種化學(xué)反應(yīng)的酶，其中有些酶的催化效果比化學(xué)催化劑好；另外，微生物的多樣性和其生理生化特性的多樣性（它們能夠修飾和降解許許多多有機(jī)化合物），使我們有可能找到某種微生物或酶來催化某種特定的和所期望的化學(xué)反應(yīng)。第六頁，共八十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)生物轉(zhuǎn)化的基本類型

一、還原反應(yīng)脫氫酶被廣泛地用于醛和酮羰基以及烯烴碳-碳雙鍵的還原，這種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)可使?jié)撌中缘孜镛D(zhuǎn)化為手性產(chǎn)物，如圖所示。面包酵母醇脫氫酶和馬肝醇脫氫酶能催化酮不對(duì)稱還原，其還原產(chǎn)物仲醇的對(duì)映體過量率接近100%。第七頁，共八十三頁，2022年，8月28日

脫氫酶催化的還原反應(yīng)第八頁，共八十三頁，2022年，8月28日生物轉(zhuǎn)化中常用的一些脫氫酶

脫氫酶名稱特異性反應(yīng)所需的輔酶商品化酵母醇脫氫酶PrelogNADH+馬肝醇脫氫酶PrelogNADH+布氏熱厭氧菌醇脫氫酶PrelogNADPH+羥基甾體醇脫氫酶PrelogNADH+彎孢菌脫氫酶PrelogNADPH-乳桿菌屬的Lactobacilluskefir

醇脫氫酶Anti-PrelogNADPH+爪哇毛霉醇脫氫酶Anti-PrelogNADPH-甲單胞菌屬醇脫氫酶Anti-PrelogNADPH-第九頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、氧化反應(yīng)

氧化反應(yīng)是向有機(jī)化合物分子中引入功能基團(tuán)的重要反應(yīng)之一。生物催化的氧化反應(yīng)主要由三大類酶：?jiǎn)渭友趺?、雙加氧酶和氧化酶，它們所催化的反應(yīng)如圖所示。第十頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、氧化反應(yīng)

單加氧酶和雙加氧酶直接在底物分子中加氧，而氧化酶是催化底物脫氫，脫下的氫再與氧結(jié)合生成水或過氧化氫。脫氫酶與氧化酶相似，也是催化底物脫氫，但它催化脫下的氫與氧化態(tài)NAD(P)+結(jié)合，而不是與氧結(jié)合，這是兩者的主要區(qū)別。氧化反應(yīng)表面上看是加氧或脫氫，其本質(zhì)是電子的得失。單加氧酶、雙加氧酶和氧化酶是催化底物氧化失去電子，并將電子交給氧，即氧是電子受體；脫氫酶催化底物失去電子，它將電子交給NAD(P)+，然后還原型NAD(P)H再通過呼吸鏈或NAD(P)H氧化酶將電子最終交給氧并生成水。第十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日生物催化的氧化反應(yīng)類型

第十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、單加氧酶催化的氧化反應(yīng)單加氧酶（mono-oxygenases）可以使氧分子（O2）中的一個(gè)氧原子加入到底物分子中，另一個(gè)氧原子使還原型NADH或NADPH氧化并產(chǎn)生水（H2O）。單加氧酶在生物催化的手性合成中有著重要的應(yīng)用，圖所示為該酶催化的一些反應(yīng)類型。

第十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日單加氧酶所催化的一些反應(yīng)類型

底物產(chǎn)物反應(yīng)類型輔酶類型烷烴醇羥化金屬芳香烴酚羥化金屬烷基烴環(huán)氧化物環(huán)氧化金屬含雜原子化合物雜原子氧化物雜原子氧化黃素酮酯或內(nèi)酯Baeyer-Villiger黃素第十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日羥化反應(yīng)是一類重要的氧化反應(yīng)碳?xì)浠衔镏蟹腔顫姷腃—H鍵的羥化是一種非常有用的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，傳統(tǒng)的有機(jī)化學(xué)合成方法幾乎不能進(jìn)行這樣直接的羥化反應(yīng)。但很多微生物能夠直接進(jìn)行烷烴和芳香烴的羥化反應(yīng)，其中工業(yè)化應(yīng)用最為廣泛的是甾體的羥化反應(yīng)。第十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日環(huán)氧化反應(yīng)手性環(huán)氧化合物是一種重要的手性合成前體，可與多種親核試劑反應(yīng)產(chǎn)生重要的中間體。單加氧酶催化的烯烴環(huán)氧化反應(yīng)可用于制備小分子環(huán)氧化合物，其中有些產(chǎn)物是傳統(tǒng)的化學(xué)方法所不能制備的。另外，由單加氧酶催化的硫醚的氧化反應(yīng)也是非常重要的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多能夠催化這類反應(yīng)的微生物。第十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日拜爾-維利格反應(yīng)（Baeyer-Villiger）

由單加氧酶催化的另一個(gè)非常重要的反應(yīng)就是拜爾-維利格反應(yīng)（Baeyer-Villiger）。該反應(yīng)是指利用過氧羧酸氧化酮生成酯或內(nèi)酯，這是一個(gè)具有很高應(yīng)用價(jià)值的有機(jī)合成反應(yīng)。第十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、雙加氧酶催化的氧化反應(yīng)雙加氧酶（dioxygenases），有稱雙氧酶，能催化氧分子中的兩個(gè)氧原子加入到一個(gè)底物分子中。這類酶一般含有緊密結(jié)合的鐵原子，如血紅素鐵，其催化的典型反應(yīng)有以下三種（如圖所示）。第十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日雙加氧酶催化的氧化反應(yīng)

第十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日雙加氧酶催化的氧化反應(yīng)雙加氧酶催化的反應(yīng)有烯烴的氫過氧化反應(yīng)。烯烴可被一種雙加氧酶-脂氧酶氧化為脂質(zhì)氫過氧化物，其對(duì)細(xì)胞具有毒性，并能引起病變。脂質(zhì)氫過氧化物能被過氧化物酶還原為醇。大豆脂氧酶能夠催化天然的亞油酸的氧化并不有很高選擇性，同時(shí)對(duì)非天然的底物也能夠進(jìn)行同樣的催化反應(yīng)。第二十頁，共八十三頁，2022年，8月28日過氧化物酶過氧化物酶能夠催化過氧化氫化許多芳香族胺或酚類化合物，也有的過氧化物酶能夠用于特定構(gòu)型仲醇的制備。同樣，由于過氧化酶的立體選擇性，此酶還可用于消旋體氫過氧化物的拆分。雙加氧酶在能夠用于制備順式環(huán)狀二醇和順式環(huán)狀連二醇，這些手性化合物具有很多的用途。

第二十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、氧化酶和脫氫酶的催化反應(yīng)氧化酶催化電子轉(zhuǎn)移到分子氧中，以氧作為電子受體，最終生成水或過氧化氫。氧化酶有黃素蛋白氧化酶（氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶）、金屬黃素蛋白氧化酶（醛氧化酶）和血紅素蛋白氧化酶（過氧化氫酶、過氧化物酶）等。其中有些具有重要的應(yīng)用價(jià)值。第二十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日脫氫酶可以催化氧化和還原雙向可逆反應(yīng)，一般以催化還原反應(yīng)為主，但根據(jù)需要設(shè)計(jì)反應(yīng)條件可以使還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧化反應(yīng)。脫氫酶能夠催化多元醇分子中的某一羥基區(qū)域選擇性氧化，而化學(xué)方法需要對(duì)多元醇中的其他羥基進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)的反應(yīng)。另外，某些脫氫酶能夠催化消旋體醇對(duì)映體選擇性地氧化而用于拆分。第二十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、水解反應(yīng)水解酶（hydrolases，）是最常用的生物催化劑，占生物催化反應(yīng)用酶的65%左右。它們能夠水解酯、酰胺、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、環(huán)氧化物和腈等化合物，這些反應(yīng)的形式如圖所示。其中酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最常用的水解酶。第二十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日生物催化的水解反應(yīng)的類型

第二十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、酯水解用于酯水解的酯酶有豬肝酯酶、微生物酯酶（苦草桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、豆醬比赤氏酵母和黑根霉等）、具有酯酶活性的蛋白酶（-胰凝乳蛋白酶、苦草桿菌蛋白酶、青霉素?；?、米曲霉蛋白酶和灰色鏈霉菌蛋白酶等），以及脂肪酶（豬胰腺脂肪酶、假絲酵母屬脂肪酶、假單胞菌屬脂肪酶毛霉屬脂肪酶等）。第二十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、環(huán)氧化物水解環(huán)氧化物是一類重要的有機(jī)化合物，是許多生物活性物質(zhì)合成的原料。環(huán)氧化物水解酶能夠催化環(huán)氧化物進(jìn)行區(qū)域或?qū)τ尺x擇性水解，從而通過生物拆分法制備所需構(gòu)型的環(huán)氧化物。生物催化的烯烴環(huán)氧化反應(yīng)也能夠直接制備光學(xué)純的環(huán)氧化物。用于生物轉(zhuǎn)化的環(huán)氧化物水解酶有肝微粒體環(huán)氧化物水解酶和微生物環(huán)氧化物水解酶。第二十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、腈水解

含有腈基的有機(jī)化合物是一類重要的原料。天然腈存在于植物、真菌、細(xì)菌、藻類、海綿、昆蟲甚至哺乳動(dòng)物中。腈水解可通過腈水解酶和腈水合酶兩種不同的酶來實(shí)現(xiàn)。脂肪族腈一般先在腈水合酶催化下生成相應(yīng)的酰胺，然后再經(jīng)過酰胺酶或蛋白酶水解為羧酸。芳香族、雜環(huán)和不飽和脂肪腈一般被腈水解酶直接水解產(chǎn)生羧酸，而不形成中間體酰胺。第二十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日4、酰胺水解多肽和蛋白質(zhì)是由氨基酸通過酰胺鍵（肽鍵）相互連接形成的大分子。L-氨基酸被廣泛用于醫(yī)藥、食品和手性合成中。近年來，一些非天然D-氨基酸被用作手性化合物合成的前體，D苯苷氨酸、D-對(duì)羥基苯苷氨酸是-內(nèi)酰胺類抗生素的常用側(cè)鏈。第二十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日4、酰胺水解氨基酸制備一般有微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶法三種。其中用酶法合成對(duì)映體純氨基酸主要有如圖所示的三種方法：水解酶催化消旋體拆分；裂合酶催化不對(duì)稱氨加成；脫氫酶催化不對(duì)稱還原胺化反應(yīng)。第三十頁，共八十三頁，2022年，8月28日酶法制備L--氨基酸的三種方法

第三十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日工業(yè)上常用的酰胺水解酶有：酰胺酶（amidase）又稱氨基肽酶，其能催化消旋體氨基酸酰胺選擇性水解生成L-氨基酸；氨基?；福╝cylase），其能選擇性地催化L-N-?；被崴?，如這類酶能夠催化消旋體N-乙酰色氨酸和N-乙酰苯丙氨酸水解拆分制備L-苯丙氨酸和L-色氨酸；乙內(nèi)酰脲酶俗稱海因酶，這類酶在體內(nèi)負(fù)責(zé)催化嘧啶堿基代謝中二氫嘧啶環(huán)的水解開環(huán)反應(yīng)，故又稱二氫嘧啶酶，常用的海因酶與酰胺酶和?；覆煌?，它優(yōu)先水解D-型對(duì)映體，屬D-海因酶；內(nèi)酰胺酶，其可用于消旋體內(nèi)酰胺的水解拆分，這些單一對(duì)映體的產(chǎn)物是合成很多生理活性物質(zhì)的重要中間體。第三十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日四、轉(zhuǎn)移和裂合反應(yīng)在生物催化中最為常用的酶為氧化還原酶和水解酶，其在催化手性合成反應(yīng)中約占90%左右。然而，其他四大類酶——轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶（合成酶）在生物催化中也有著重要的應(yīng)用，它們能催化C—C、C—N、C—O以及C==C和C==O等化學(xué)鍵的生成或裂解反應(yīng)。第三十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、轉(zhuǎn)移反應(yīng)轉(zhuǎn)移酶（transferases，）是一類常見的生物催化劑，它所催化的轉(zhuǎn)移反應(yīng)如下式所示。這類酶催化的底物有氨基酸、酮酸、核苷酸和糖等化合物，其中糖基轉(zhuǎn)移酶已被用來制備新型的糖。X—Y+Z轉(zhuǎn)移酶X+Z—Y

第三十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日糖苷化酶（glycosidses）糖苷化酶能催化糖苷鍵的水解，故又稱糖水解酶（glycohydrolases）。該酶不需要任何輔酶，是真正的水解酶。這種水解酶有兩種類型：外糖苷化酶和內(nèi)糖苷化酶，前者僅水解末端糖苷鍵，后者可水解糖鏈中部的糖苷鍵。由糖苷化酶水解的逆反應(yīng)可用于糖苷的合成，利用游離單糖作為底物直接進(jìn)行糖苷合成反應(yīng)稱為直接糖基化，這是一個(gè)熱力學(xué)控制的反應(yīng)。由于反應(yīng)的平衡常數(shù)有利于水解反應(yīng)，因此必須采用高濃度的單糖和親核試劑，反應(yīng)產(chǎn)率一般很低，產(chǎn)物為粘稠糖漿。第三十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、裂合反應(yīng)

裂合酶（lyases，）能催化一種化合物裂為兩種化合物或其逆反應(yīng)。這類酶包括醛縮酶、水合酶和脫羧酶等。裂合酶在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要的應(yīng)用，它們能催化C—C、C—N和C—O等鍵的裂合和生成，有時(shí)還伴隨雙鍵的形成。裂合酶的逆反應(yīng)也有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，如工業(yè)上應(yīng)用苯丙氨酸氨裂解酶和天冬氨酸酶催化合成L-苯丙氨酸和L-天冬氨酸。第三十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日醛縮酶醛縮酶（aldolases）能催化不對(duì)稱C—C鍵的形成，并能使分子延長(zhǎng)2~3個(gè)碳單位，對(duì)有機(jī)合成極為有用。該酶常用于糖的合成，如氨基糖、硫代糖和二糖類似物的合成。醛縮酶的底物專一性不高，能催化多種底物反應(yīng)。第三十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)酮醇酶轉(zhuǎn)酮醇酶（transketolase）以Mg2+和焦磷酸硫胺素（TPP）為輔酶，催化羥甲基酮基從一個(gè)磷酸酮糖分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)磷酸醛糖分子中，該酶催化醛糖鏈立體選擇性地延伸兩個(gè)碳單位，她是很有前途的生物催化劑。偶姻反應(yīng)（acyloinreactions）是指兩個(gè)分子醛縮合形成酮醇的反應(yīng)，如兩分子丁醛縮合形成丁偶姻（C3H7-CHOHCOC3H7）。

第三十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、加成和消去反應(yīng)裂合酶還可以催化小分子化合物如水和氣惱不對(duì)稱加成到C==C雙鍵，以及氫氰酸加成到C==O鍵上。由醇腈酶（oxynitrilase）催化的氰醇反應(yīng)所生成的手性氰醇，是合成除蟲菊酯類沙蟲劑的醇基部分。第三十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、加成和消去反應(yīng)這類酶催化反應(yīng)還包括：水和氨的加成反應(yīng)（如利用不同的微生物細(xì)胞能夠?qū)Σ煌〈奶继茧p鍵進(jìn)行加水反應(yīng)，具有很好的手性合成應(yīng)用前景）、Michael加成反應(yīng)、鹵化反應(yīng)和脫鹵素反應(yīng)等。第四十頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)

參與藥物制備過程重要反應(yīng)的酶類及作用機(jī)制已經(jīng)研究和應(yīng)用了各種各樣的微生物來源酶于有關(guān)藥物制備和其他精細(xì)化學(xué)品的制備，特別是在消旋體的拆分、不對(duì)稱合成，以及其他復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)中的應(yīng)用。盡管經(jīng)典的化學(xué)反應(yīng)都能夠?qū)崿F(xiàn)這些過程，但用于酶催化反應(yīng)的微生物資源的可再生性、反應(yīng)過程的環(huán)境友好性，以及其他化學(xué)反應(yīng)無法比擬的優(yōu)越性，愈來愈多化學(xué)反應(yīng)將被酶促反應(yīng)所取代。這些酶類參與的反應(yīng)涉及到如下幾個(gè)方面。第四十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、生物催化拆分生物催化拆分（biocatalyticresolutions），即為利用酶對(duì)對(duì)映異構(gòu)體中的一種手性分子具有特異性的催化作用，而對(duì)對(duì)映異構(gòu)體中的另一種手性分子不起作用這樣的特性，將具有催化特異性的一種對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為所希望的對(duì)映體純的產(chǎn)物/中間體。至今為止，在生物催化拆分中使用最多的是水解酶。第四十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、生物催化拆分從經(jīng)濟(jì)的角度看，利用水解酶進(jìn)行拆分是不合算的，因?yàn)閺睦碚撋现v，其最高得率僅為50％。這一不足從理論上講，通過有效地結(jié)合外消旋化可以來彌補(bǔ)。這種通過外消旋化來得到單一對(duì)映體的方法，即為動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分（dynamickineticresolution）。外消旋化可以自發(fā)進(jìn)行，如乙內(nèi)酰脲；也可以通過改變反應(yīng)條件，如pH和溫度；或者通過使用外消旋酶來進(jìn)行。

第四十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、對(duì)映體會(huì)聚轉(zhuǎn)化另外一條能夠得到100%對(duì)映體轉(zhuǎn)化收率的不同路線是對(duì)映體會(huì)聚轉(zhuǎn)化（enantioconvergenttransformations），即或是利用兩種對(duì)映體互補(bǔ)的酶進(jìn)行不同區(qū)域特異性的轉(zhuǎn)化，或是結(jié)合使用酶催化和化學(xué)催化的方法，使得到100%的轉(zhuǎn)化收率。前一種方法的適用范圍不廣，后一種方法已經(jīng)在（R）-Nifenalol（硝苯洛爾）的制備過程中獲得了成功，其利用環(huán)氧化物水解酶催化和硫酸催化相結(jié)合的方法（如圖所示）。第四十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日利用化學(xué)-酶水解對(duì)-硝基苯乙烯氧化物對(duì)映體會(huì)聚合成（R）-Nifenalol的途徑

第四十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日3、去對(duì)稱化反應(yīng)

利用不同的水解酶或水合酶進(jìn)行去對(duì)稱化（desymmetrization），是一種非常有效的特異性反應(yīng)。一個(gè)對(duì)稱的前手性分子，利用某一種特定的酶促僅對(duì)分子中的一個(gè)功能基團(tuán)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，最終得到一個(gè)所期望的手性分子，這就是去對(duì)稱化。圖所示為美國(guó)Schering-Plough公司利用脂肪酶，對(duì)2-取代-1,3-丙二醇進(jìn)行去對(duì)稱化轉(zhuǎn)化，最終得到合成抗真菌藥物SCH1048的關(guān)鍵手性中間體。

第四十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日利用脂肪酶對(duì)2-取代-1,3-丙二醇進(jìn)行

去對(duì)稱化的轉(zhuǎn)化反應(yīng)

第四十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日4、不對(duì)稱合成

相對(duì)于生物催化拆分，用于生物催化不對(duì)稱合成的底物是一種前手性前體，其通過對(duì)映體加成反應(yīng)，可以被轉(zhuǎn)化為所期望的光學(xué)活性化合物。與去對(duì)稱化反應(yīng)相似，這些反應(yīng)具有產(chǎn)生定量收率的所期望的光學(xué)活性化合物。參與藥物制備過程重要反應(yīng)的酶的種類很多，以下就脂肪酶、環(huán)氧化物水解酶和糖苷化酶的作用機(jī)制及有關(guān)內(nèi)容作一闡述。第四十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日一、脂肪酶很多細(xì)菌能夠產(chǎn)生脂肪酶。脂肪酶既能夠水解長(zhǎng)鏈?；视?，也能夠合成長(zhǎng)鏈酰基甘油（如圖所示）。由于脂肪酶所催化的水解反應(yīng)和合成反應(yīng)都具有區(qū)域選擇性（regioselectivity）和對(duì)映體選擇性（enantioselectivity），因此，該酶已被作為重要的立體選擇性生物催化劑，用于有機(jī)化學(xué)合成。第四十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日（一）脂肪酶的定義脂肪酶的簡(jiǎn)單定義為：催化長(zhǎng)鏈?；视退猓ɑ蚝铣桑┑聂然ッ福╟arboxylesterase）；如果以三油酰甘油酯（trioleoylglycerol）為標(biāo)準(zhǔn)底物時(shí)，水解含有?；滈L(zhǎng)大于10個(gè)碳原子的甘油酯時(shí)，往往被稱之為脂肪酶（lipase），如果當(dāng)以三丁酸甘油酯為標(biāo)準(zhǔn)底物時(shí)，水解含有小于10個(gè)碳原子的甘油酯時(shí)，往往被稱之為酯酶（esterase）。但應(yīng)該注意的是，這些脂肪酶往往具有優(yōu)先水解酯酶底物。另外一種更為容易的理解的含義是：對(duì)于含大的手性羧酸和小的醇的酯，其水解或酯交換由酯酶催化，而對(duì)由小的羧酸和大的手性醇構(gòu)成的酯，則由脂肪酶催化，如圖所示。

第五十頁，共八十三頁，2022年，8月28日脂肪酶和酯酶催化的酯水解反應(yīng)

第五十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的一些微生物來源的脂肪酶

微生物名稱用途CandidarugosaCandidaAntarcticaA/BThermomyceslanuginosusRhizomucormiehei有機(jī)合成有機(jī)合成洗滌劑食品加工BurkholderiacepaciaPseudomonasalcaligenesPseudomonasmendocinaChromobacteriumviscosum有機(jī)合成洗滌劑洗滌劑有機(jī)合成第五十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日細(xì)菌脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制

典型的α/β水解酶折疊

第五十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日銅綠假單胞菌脂肪酶的結(jié)構(gòu)

第五十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日脂肪酶的催化機(jī)制1、親核絲氨酸殘基的活化，其活化過程一方面來自于被鄰近的組氨酸，另一方面來自于受絲氨酸中O-作用的底物羧基碳原子的親核進(jìn)攻；2、被活化的絲氨酸與底物中的羧基碳結(jié)合，形成一個(gè)過度態(tài)的四元中間體，這個(gè)中間體由于兩個(gè)肽中的NH基團(tuán)與O-的作用而使其穩(wěn)定，組氨酸在這一過程中提供一個(gè)質(zhì)子給底物中要離去的醇基上；3、共價(jià)中間體（“?；浮保┑男纬?，底物中的酸部分與酶中絲氨酸殘基形成酯鍵，周圍的水分子被鄰近的組氨酸活化，結(jié)果是OH-對(duì)共價(jià)中間體中的羧基碳原子進(jìn)行親核進(jìn)攻；4、組氨酸殘基提供一個(gè)質(zhì)子給活化的絲氨酸殘基中的氧原子，使絲氨酸與?；糠值孽ユI斷裂，釋放?；a(chǎn)物。第五十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日

脂肪酶的催化機(jī)制第五十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日親核試劑捕捉酶分子活性部位形成?；?酶復(fù)合物的過程

第五十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日脂肪酶進(jìn)行酯水解和酯合成的過程（a）：不溶性酯的水解（b）：涉及到不溶性生物催化劑、溶于有機(jī)溶媒的?；偷孜锏霓D(zhuǎn)酯反應(yīng)第五十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日?qǐng)D顯示了該酶的活性部位：底物基團(tuán)與酶結(jié)合的三個(gè)結(jié)合袋，以及位于結(jié)合袋周圍的氨基酸殘基。如圖所示：飛鏢形的活性部位被分為一個(gè)大大的疏水溝，其可以恰如其分地容納sn-3?；?；一個(gè)可以嵌入抑制劑的醇部分，其可以再被分為一個(gè)可以容納sn-2部分的疏水/親水袋，（由于sn-2結(jié)合袋對(duì)底物結(jié)合的交互作用最密切，因此，這可能是決定酶立體選擇性的優(yōu)先因素），和一個(gè)較小的可以容納sn-1鏈的結(jié)合袋。范德華力是維持以上底物中這些基團(tuán)與酶結(jié)合的主要作用。另外，sn-2鏈中的酯氧原子與活性部位組氨酸的NE2原子之間的氫鍵，對(duì)固定抑制劑的位置具有重要的作用。第五十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日一些由微生物來源的脂肪酶催化潛手性化合物成為單一異構(gòu)體的反應(yīng)種類

第六十頁，共八十三頁，2022年，8月28日脂肪酶應(yīng)用受到限制的因素1）對(duì)映體選擇性還不夠高；2）酶的活性受到限制；3）酶難以循環(huán)使用；4）利用脂肪酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分制備單一異構(gòu)體的最高得率為50%。第六十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日限制因素的突破方法1）利用體外進(jìn)化技術(shù)改造酶提高對(duì)映體選擇性；2）研究固定化技術(shù)提高酶在有機(jī)溶劑中的活性和穩(wěn)定性；3）研究循環(huán)技術(shù)使酶能夠反復(fù)使用；4）研究動(dòng)力學(xué)拆分使酶能夠進(jìn)行對(duì)映體轉(zhuǎn)換的催化反應(yīng)。

第六十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日以鈀碳為第二種催化劑，使S-構(gòu)型化合物外消旋化；用來源于C.antarctica的脂肪酶對(duì)外消旋體苯乙胺進(jìn)行立體選擇性?；磻?yīng)的動(dòng)力學(xué)拆分過程

第六十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日一些利用脂肪酶制備藥物關(guān)鍵中間體的實(shí)例關(guān)鍵中間體藥物抗抑郁藥帕羅西汀，拆分得到(S)--甲基--乙酰硫代丙酸抗高血壓藥卡托普利拆分得到(2R,3S)-4-甲氧苯基縮水甘油酸甲酯抗心絞痛和高血壓藥地爾硫卓拆分得到手性側(cè)鏈-氨基-N-苯甲?；?(2R,3S)-3-苯基異絲氨酸抗腫瘤藥紫杉醇拆分消旋體非甾體消炎藥（S）-奈普生S-(-)-乙酸酯免疫抑制劑脫氧精胍菌素拆分得到D-泛酸內(nèi)酯輔助藥D-泛酸第六十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、環(huán)氧化物水解酶

（一）環(huán)氧化物水解酶的定義和作用環(huán)氧化物水解酶催化一份水分子加入到環(huán)氧化物分子中的環(huán)氧乙烷部分，形成相應(yīng)的1-2二醇。這種酶廣泛地存在于自然界中，如植物、昆蟲、細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物等。除了這種酶在不同的生物體內(nèi)具有獨(dú)特的功能外，環(huán)氧化物的酶觸反應(yīng)代表了這一類酶具有重要的生物化學(xué)作用，因?yàn)椋涸诤芏嗑哂猩锘钚宰饔玫姆巧锖铣苫衔锏慕到膺^程中，發(fā)現(xiàn)很多中間產(chǎn)物為環(huán)氧化物；另外，環(huán)氧化物結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧乙烷部分由于其具有親電子作用，而具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)性，它有可能與很多生物親核物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。第六十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日環(huán)氧化物水解酶的種類目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種這樣的酶：可溶性（也稱為胞質(zhì)）環(huán)氧化物水解酶（solubleepoxidehydrolases，sEH）、微粒體環(huán)氧化物水解酶(microsomalepoxidehydrolases，mEH)、白三烯A4環(huán)氧化物水解酶(leukotrieneA4hydrolases，LTA4H)、膽固醇環(huán)氧化物水解酶以及hepoxilin水解酶。

第六十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日一些微生物環(huán)氧化物水解酶對(duì)映體選擇性地水解外消旋體環(huán)氧化物的實(shí)例

第六十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日（二）環(huán)氧化物水解酶的作用機(jī)理和結(jié)構(gòu)特征除了對(duì)哺乳類的微粒體環(huán)氧化物水解酶（mEH）的作用機(jī)理有所深入研究外，對(duì)其他有關(guān)的這類酶的作用機(jī)理幾乎沒有什么研究，但可以認(rèn)為，這類酶的作用機(jī)理應(yīng)該是相近的。一般認(rèn)為，mEH通過反式（trans）進(jìn)攻環(huán)氧乙烷來水解環(huán)氧化物，這一親核進(jìn)攻主要在立體位置上位于紙平面后的碳原子上進(jìn)行。利用取代基不同對(duì)水解速率變化的效應(yīng)研究，以及動(dòng)力學(xué)溶劑同位素研究，結(jié)果支持這一假設(shè)。還有一種普遍可以接受的反應(yīng)機(jī)理是：先通過酶分子中的專一的組氨酸殘基來活化水分子，然后由被活化了的水分子直接進(jìn)攻環(huán)氧化物中的環(huán)結(jié)構(gòu)部分。第六十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧化物水解的一般過程

第六十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日

AgrobacteriumradiobaterAD1環(huán)氧化物水解酶的催化機(jī)理第七十頁，共八十三頁，2022年，8月28日在大多數(shù)情況下，較為暴露的碳原子被優(yōu)先受到攻擊，因此，k1>k2、k4>k3。環(huán)氧化物水解酶生物轉(zhuǎn)化的四種途徑

第七十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日（三）環(huán)氧化物水解酶的底物特異性

1、單取代環(huán)氧化物；2、苯乙烯氧化物型的環(huán)氧化物；3、雙取代環(huán)氧化物。第七十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日帶有各種不同取代基的環(huán)氧化物第七十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、糖苷化酶與糖基轉(zhuǎn)移酶

寡糖、糖脂、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖以及其他一些含糖化合物在生物體內(nèi)具有廣泛的生理作用，特別是不少含糖化合物具有特殊的藥理活性，從而激發(fā)了藥物研究工作者的研究熱情，使之成為當(dāng)今藥物開發(fā)研究的一個(gè)重要分支。第七十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、糖苷化酶與糖基轉(zhuǎn)移酶目前很多已經(jīng)應(yīng)用的微生物藥物都是糖苷化合物，如具有抗菌、抗蟲、免疫調(diào)節(jié)、除草和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等生物活性的大環(huán)內(nèi)酯類糖苷化合物，以及蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素等。盡管通過化學(xué)合成的方法可以形成特異性的糖苷鍵，但其區(qū)域?qū)Ｒ恍曰蛄Ⅲw專一性合成的效率往往是低下的，而利用酶或微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法來合成各種糖苷鍵，是近年來一個(gè)新的研究領(lǐng)域。第七十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日糖基轉(zhuǎn)移酶生物催化糖苷鍵的酶包括兩個(gè)大類，即糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase）和糖苷化酶（glycosidase）。在一個(gè)合適的反應(yīng)系統(tǒng)中，前者可以有效地和選擇性地催化供體上的糖殘基轉(zhuǎn)移到受體分子上，從而形成新的糖苷化合物。利用糖基轉(zhuǎn)移酶催化生成糖苷化合物的優(yōu)點(diǎn)是較高的轉(zhuǎn)化率和選擇性，但其缺點(diǎn)是需要有一個(gè)比較復(fù)雜的提供糖基的供體，且該基團(tuán)對(duì)酶來說具有很大的隱蔽性。第七十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日糖苷化酶相反，利用糖苷化酶催化反應(yīng)，能夠催化比較簡(jiǎn)單的糖基供體，甚至在某些條件下，可以直接將單糖化合物與受體形成糖苷鍵，且很容易用粗酶來進(jìn)行催化反應(yīng)，其主要的缺點(diǎn)是在某些情況下，區(qū)域選擇性不夠高。第七十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日1、糖苷化酶催化的寡糖合成

催化該反應(yīng)時(shí)的糖基供體可以是單糖、寡糖或活化的糖苷化合物。該酶催化反應(yīng)時(shí)與底物形成一個(gè)糖基-酶復(fù)合中間體，該中間體或是與水分子作用后生成水解產(chǎn)物，或是與受體分子作用后生成新的糖苷化物或寡糖。由于這種催化反應(yīng)有時(shí)是一個(gè)可逆反應(yīng)，因此，往往通過提高單糖的濃度時(shí)反應(yīng)有利于合成糖苷化物的方向進(jìn)行。

第七十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日2、糖苷化酶催化的糖苷化物合成：

逆向水解反應(yīng)

由糖苷化酶催化的逆向水解反應(yīng)（reversehydrolysis）是一種合成糖苷化物有效的方法，如用杏仁-D-葡萄糖苷酶，在叔丁醇：水為90：10v/v，反應(yīng)溫度為50℃的條件下催化各種不同的底物，可以得到相應(yīng)的糖苷化合物（如圖25-23a所示）。另外，用相同的酶，以作為受體分子的醇為溶劑，其與水的比例為90：10v/v，反應(yīng)溫度為50℃的系統(tǒng)中，可以用來催化底物的端基保護(hù)反應(yīng)（如圖b所示）。由于受體分子本身為溶劑（acceptorsolvent），且為低水系統(tǒng)，因此，反應(yīng)有利于合成進(jìn)行。第七十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日由糖苷化酶催化的糖苷化物合成（a：低水和有機(jī)助溶劑反應(yīng)