新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作指導(dǎo)書(shū)操作步驟試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行取出-20℃保存的試劑盒，并將試劑盒批號(hào)、過(guò)期日期等信息記錄在《PCR檢測(cè)記錄表》上,從試劑盒取出2019-nCoV反應(yīng)液，解凍，上下顛倒混勻后，點(diǎn)動(dòng)離心；取X個(gè)0.2mlPCR八連管（X=樣本數(shù)目，包括質(zhì)控品數(shù)量）放在PCR管架上。將PCR反應(yīng)液分裝至八連管中，每管分裝20μl（17ulNC(ORFlab/N)反應(yīng)液A和3ulNC(ORFlab/N)反應(yīng)液B），蓋好所有的PCR管蓋，通過(guò)傳遞窗傳送至標(biāo)本制備區(qū)進(jìn)行加樣。剩余部分要在試劑盒上標(biāo)記：開(kāi)啟人、開(kāi)啟日期和剩余人份。新冠病毒RNA的提取新冠病毒RNA的提取1.2.1.1將室溫放置96孔試劑板顛倒3次，去除塑封膜后在96孔板離心機(jī)中短暫離心（或手甩），避免掛液。撕去96孔試劑板上的鋁箔膜，確認(rèn)板子方向（磁珠在第6/12列）。1.2.1.2在96孔板的第1及第7列孔中加入200μL樣品，避免交叉污染。1.2.1.3將96孔板放入Smart32核酸提取儀中，裝上磁棒護(hù)套。1.2.1.4按以下程序進(jìn)行自動(dòng)化提取實(shí)驗(yàn)：1.2.1.5自動(dòng)化程序結(jié)束后，將第6及第12列的洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈的無(wú)核酸酶離心管中；如不馬上使用，請(qǐng)將洗脫液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無(wú)核酸酶離心管中，零下20度保存。PCR擴(kuò)增在樣本制備區(qū)的生物安全柜中進(jìn)行加樣操作，并使用干凈的手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。取出提取的RNA保存離心管，擺放在1.5ml離心管架上，若經(jīng)過(guò)冷凍處理，則需進(jìn)行解凍，振蕩混勻后進(jìn)行點(diǎn)動(dòng)離心。根據(jù)RNA上的編號(hào)對(duì)準(zhǔn)備好的PCR混合液進(jìn)行編號(hào)。打開(kāi)PCR管蓋，分別用干凈的濾芯槍頭加入5uL對(duì)應(yīng)編號(hào)的樣本RNA至PCR混合液中。每一次實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)擴(kuò)增三個(gè)陰性質(zhì)控（1份生理鹽水，2份陰性樣本）和1個(gè)弱陽(yáng)質(zhì)控。加完模板的槍頭應(yīng)小心打入廢液缸中，并確保移液器前臂沒(méi)有碰到廢液缸口。加完所有模板后，仔細(xì)核對(duì)加樣順序與編號(hào)是否正確，確保每個(gè)反應(yīng)管的加樣無(wú)誤。確定每個(gè)八連管的蓋子蓋緊后，在微型離心機(jī)上進(jìn)行點(diǎn)動(dòng)離心去氣泡（或在擴(kuò)增區(qū)微型離心機(jī)上進(jìn)行），并通過(guò)傳遞窗傳送至擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。以達(dá)安AGS4800定量PCR操作為例：打開(kāi)程序軟件，按樣本對(duì)應(yīng)順序設(shè)置空白質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品以及未知樣本；探針檢測(cè)模式設(shè)置為：Reporter1：FAM，Quencher1：NONE；Reporter2：VIC，Quencher2：NONE；Reporter3：Cy5，Quencher3：NONE將八連管放入PCR儀中，整體按壓管蓋使其壓緊，在《48孔板工作表》記錄每個(gè)樣本在PCR儀上的位置，確認(rèn)程序正確并已啟動(dòng)后，實(shí)驗(yàn)人員方可離開(kāi)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。室內(nèi)質(zhì)控質(zhì)控品來(lái)源名稱(chēng)來(lái)源陰性質(zhì)控留樣生理鹽水外購(gòu)陽(yáng)性質(zhì)控第三方質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)控方法每個(gè)批次標(biāo)本的檢測(cè)均需有留樣檢測(cè)、生理鹽水及陽(yáng)性對(duì)照參與提取-擴(kuò)增的全過(guò)程，全程操作同標(biāo)本的處理。只有連續(xù)評(píng)價(jià)結(jié)果在控，本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定工作可靠，檢驗(yàn)報(bào)告才可發(fā)出。失控判斷規(guī)則陰性質(zhì)控品：FAM和（或）VIC檢測(cè)通道有明顯擴(kuò)增曲線；Cy5通道無(wú)明顯擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性質(zhì)控品：FAM和VIC檢測(cè)通道任意一個(gè)或兩個(gè)通道無(wú)明顯擴(kuò)增曲線；Ct值>32，Cy5通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線；空白質(zhì)控品：任意一個(gè)通道或所有通道有明顯擴(kuò)增曲線；以上規(guī)則任意一個(gè)滿足均為失控，需重新進(jìn)行試驗(yàn)。失控處理分析并填寫(xiě)《失控分析報(bào)告》結(jié)果解釋結(jié)果判讀10.1.1.如果檢測(cè)樣品在FAM和VIC通道無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值>40，且Cy5通道有擴(kuò)增曲線，可判樣品未檢測(cè)到2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）RNA；10..1.2.如果檢測(cè)樣品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明顯的擴(kuò)增曲線，可判樣品為2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）陽(yáng)性。10.1.3.如果檢測(cè)樣品僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤40，另一通道無(wú)擴(kuò)增曲線，結(jié)果需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果仍為單通