第六章 一般毒性2-2

毒性評價或安全性評價的基本目的受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量－反應（效應）研究確定毒作用的靶器官確定損傷的可逆性其它：敏感檢測指標和生物學標志、毒作用機制、毒物動力學、中毒的解救措施…第四節(jié)短期、亞慢性和慢性毒性作用一、蓄積作用—檢測方法概念蓄積作用（accumulation）：外來化合物進入機體之后，經(jīng)代謝或原型排出體外，但當其連續(xù)、反復進入機體，而且吸收速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化與排出的速度或總量時，化合物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化合物的蓄積作用蓄積庫（depot）：化學物蓄積的組織器官部位。常見的蓄積庫包括：血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼概念物質(zhì)蓄積（materialaccumulation）：用分析方法能測得機體內(nèi)存在該化合物或其代謝產(chǎn)物，且隨接觸時間延長而增加功能(機能)蓄積(functionalaccumulation)

：在機體內(nèi)雖不能被測出，卻在長期接觸下出現(xiàn)了慢性中毒現(xiàn)象蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎一種外源化學物有無蓄積作用是評定該化學物是否可能引起潛在慢性中毒是論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標準時安全系數(shù)的一種依據(jù)。目的

求外來化學物的蓄積系數(shù)了解蓄積毒性的強度為慢性及其它有關毒性試驗提供劑量選擇依據(jù)方法理化方法：應用化學分析或其他技術測定化學物進入機體后在體內(nèi)含量變化的過程該方法可測定化學物的半衰期，故可作為檢測物質(zhì)蓄積的方法生物學方法：將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的效應進行比較。所測蓄積性不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積研究方法

蓄積系數(shù)法

：在一定期限之內(nèi)以低于致死劑量(<LD50)，每日給予實驗動物，直至出現(xiàn)預計的毒性效應(或死亡)為止，計算達到預計效應的總累積劑量，求出累積劑量與一次接觸該化合物產(chǎn)生相同效應的劑量的比值

.即為蓄積系數(shù)(K值)

√多用小鼠或大鼠為實驗動物，一般以死亡為指標

K=ＥD50(n)ＥD50(１)K=LD50(n)LD50(１)蓄積系數(shù)評價標準蓄積系數(shù)(K)蓄積作用分級<11~3~5~高度蓄積明顯蓄積中等蓄積輕度蓄積某些外源化學物的慢性中毒效應無法用K值表示如多數(shù)有機磷化合物屬于輕度蓄積（K>5），但小劑量反復與機體接觸后，紅細胞和腦組織的乙酰膽堿酯酶可以持續(xù)降低，且伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀方法：（1）急性毒性實驗LD50(1)

（2）1/20-1/5LD50每日染毒

LD50(n)

（50%動物死亡時累計染毒的總量）（3）計算K值：K=LD50(n)/LD50(1)

若累計染毒量已達到5個LD50，動物仍未死亡或死亡未達到半數(shù)，可終止實驗，其Ｋ值按＞５作為結果。1.固定劑量法方法：（1）測定LD50(1)（2）第1-4天，先給予0.1LD50(1)，以后每4天遞增劑量1.5倍

LD50(n)（3）計算Ｋ值。

28天時死亡動物仍未達到半數(shù)，可停止實驗，此時的總量達到12.8LD50(1)，即Ｋ＞12.8，可認為基本無蓄積。

２.遞增劑量法方法：分為1/2、1/5、1/10、1/20LD50四個劑量組和對照組，每組10只動物，每天染毒一次，共染毒20天，觀察每組動物死亡數(shù)量。結果判定：蓄積不明顯：各劑量組均無死亡；弱蓄積性：僅1/2LD50組有死亡，其它劑量組無死亡；中等蓄積性：1/20LD50組無死亡，其它各組間死亡數(shù)有劑量反應關系；強蓄積性：1/20LD50組有死亡，且有劑量反應關系。

３.劑量固定的20天蓄積法研究方法

蓄積系數(shù)法

：在一定期限之內(nèi)以低于致死劑量(<LD50)，每日給予實驗動物，直至出現(xiàn)預計的毒性效應(或死亡)為止，計算達到預計效應的總累積劑量，求出累積劑量與一次接觸該化合物產(chǎn)生相同效應的劑量的比值

.即為蓄積系數(shù)(K值)

√多用小鼠或大鼠為實驗動物，一般以死亡為指標

K=ＥD50(n)ＥD50(１)K=LD50(n)LD50(１)生物半減期法：利用動力學原理

生物半衰期法從上圖可以看出，一種化學物質(zhì)若以t1/2相等的時間間距染毒，其在體內(nèi)經(jīng)過6個t1/2的接觸期就可以基本上達到蓄積的極限，此時理論蓄積量達到極限的98.4%，此后即使繼續(xù)接觸該物質(zhì)，機體的蓄積量基本上也不會增加。重復劑量毒性作用/亞急性毒性作用指實驗動物或人連續(xù)接觸外源化學物4周（28天）內(nèi)所產(chǎn)生的毒效應。能初步確定相應的NOAEL/LOAEL我國毒理學評價標準中內(nèi)容--食品、消毒劑、農(nóng)藥和新化學品二、短期毒性作用

三、亞慢和慢性毒性作用

外源化學物在長期重復染毒時可產(chǎn)生與急性毒性試驗完全不同的毒作用隨著動物的衰老，有些因素如組織易感性改變、代謝和生理功能的改變，以及自發(fā)性疾病等均可影響毒作用的性質(zhì)和程度。某些重要的疾病例如心臟病、慢性腎衰、腫瘤等均與年齡增長有關。外源化學物的蓄積作用是發(fā)生慢性毒性作用的基礎概念指實驗動物或人連續(xù)較長時間接觸外來化合物所出現(xiàn)的中毒效應。subchronictoxicity：實驗動物或人連續(xù)較長期（約相當于生命周期1/10）接觸外源化學物所產(chǎn)生的中毒效應。可基本確定NOAEL/LOAEL，嚙齒類染毒90天，犬1年。chronictoxicity：實驗動物或人長期接觸外源化學物引起的毒性效應。嚙齒類染毒至少12個月，亦可至終身。Parkinson等(1995)報告117種藥品犬亞慢性(90天)和慢性(24月)毒性試驗結果與大鼠(短期或長期毒性試驗)的結果比較，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)新的毒性資料，因此認為動物毒性試驗長于6個月沒有必要，除非研究致癌作用Weil等（1969）報告，112種受試物中，大鼠染毒90天后才出現(xiàn)毒性效應的只有3種，認為大鼠90天實驗即可確定受試物的NOAEL慢性毒性試驗傾向于和致癌試驗合并進行試驗目的觀察長期接觸受試物的毒性效應譜、毒作用特點、靶器官；探索受試物作用機制；觀察長期接觸受試物所致毒性作用的可逆性；確定長期接觸受試物所致毒作用的劑量－反應（效應）關系，確定其NOAEL和/或LOAEL，為制定人類接觸的安全限量提供依據(jù)；觀察不同動物對受試物的毒效應差異，為確定適當?shù)陌踩禂?shù)，將結果外推到人提供依據(jù)。實驗動物選擇和要求-亞慢性試驗

※兩種實驗動物：嚙齒類（大鼠），非嚙齒類（犬）

※實驗時間較長：要求為斷乳不久的動物，小鼠體重以15g、大鼠50-1０0g（<6周）左右為宜

※至少應設計３個染毒劑量組及１個正常對照組，必要時再加一個受試化合物的溶劑對照組

衛(wèi)星組：試驗中期解剖或試驗結束后做恢復期觀察，額外設置的動物組

※小動物每組不少于２0只，大動物每組不少于8只，分組要隨機化。動物同性別個體初始體重相差應不超過平均體重的±20%。一般雌雄兩性動物同時分別進行，各劑量組兩性動物數(shù)相等

實驗動物選擇和要求-亞慢性試驗

※盡可能使用高等級動物，在符合國家實驗動物要求的試驗環(huán)境中進行

※

預檢（1周）：適應環(huán)境、篩檢健康等不合要求的動物

※

給藥前禁食處理：減少殘留食物對毒物毒性的影響

※亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。低劑量組不宜出現(xiàn)任何看觀察到的毒效應。

具體劑量的設計參考LD50和人體實際攝入量如以化學物LD50的1/201/5為最高劑量（或用人體擬用的最高劑量），高、中、低3個劑量間組距以2-4倍為遞減。藥品：大鼠—人臨床擬用劑量的10、30、100倍非嚙齒類：人臨床擬用劑量的5、15、50食品：盡可能涵蓋人體預期攝入量的100倍量（或動物最大給予劑量）染毒途徑應考慮兩點：（1）盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化合物的途徑或方式；（2）應與預期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致。常為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種受試物在飼料中的比例一般應小于5%，最大不超過10%。當摻入量超過5%時，要調(diào)整飼料的營養(yǎng)成分，使其比例盡量與對照組一致。一般為擬用臨床用藥期的2-3倍觀察時間90天亞慢實驗染毒期90天染毒+恢復期觀察（28天）：觀察受試物所致毒性的可逆性、持續(xù)性和遲發(fā)型試驗期間至少應每天觀察一次動物的一般表現(xiàn)、動物出現(xiàn)中毒表現(xiàn)的體征、程度、持續(xù)時間和死亡情況等。觀察指標-亞慢性試驗一般綜合性觀察指標：體重、食物利用率、中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間，臟器系數(shù)等一般化驗指標：主要指血常規(guī)和肝、腎功能的檢測病理學檢查：確定靶部位、損傷的性質(zhì)和程度食物利用率

動物每吃100g食物所增長的體重克數(shù)，表示為體重（g）/飼料（100g）。喂飼染毒時，可計算實際染毒劑量。食物利用率可以鑒別動物體重降低是由于進食減少，還是受試物毒作用。例如：大鼠喂飼溴甲烷熏蒸過的食物2個月，其體重平均增加156.6g，而對照組大鼠平均體重增加180.9g，雖然前者體重增加較慢，但接觸組與對照組的食物利用率卻基本相同（接觸組為25.2，對照組為25.6），說明大鼠長期食用溴甲烷熏蒸過的食物，基本上不影響其對食物的吸收和利用，體重增長減慢可能是由于食欲下降或其它原因所致。系統(tǒng)尸檢和組織病理學檢查臟器稱重和臟器系數(shù)（relativeorganweight）：又稱臟器相對重量，指臟器濕重與單位體重的比值，通常是每100g體重中某臟器所占質(zhì)量，表示為臟器質(zhì)量(g)/體重(100g)。臟器適用于實質(zhì)性臟器，包括：心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、卵巢等。臟器系數(shù)增大表示該臟器腫大，病變可能是增生、充血、水腫；臟器系數(shù)減小可能表示臟器發(fā)育不良或萎縮等變化。病理學檢查：包括肉眼（大體）檢查、病理切片檢查、免疫組織化學檢查、細胞超微結構電鏡檢查等，分別從大體、組織、細胞、亞細胞甚至分子水平等多個方面發(fā)現(xiàn)受試物的毒效應。

特異性指標指可反映受試物對機體毒作用本質(zhì)的特征性指標，常與毒作用機制有關，有時可作為效應生物學標志。雙（3，5-二特丁基-4-羥基芐磷酸單乙酯）鎳鹽，結構可分成三個部分：

①二個分子的五價磷化合物，該部分有抗膽堿酯酶作用；

②2，6-二特丁基酚的結構，可誘導微粒體酶活性；

③作為一種有機鎳或鎳鹽，可致皮炎及皮膚過敏?？赡嫘杂^察目的：了解毒性反應的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲緩毒性末次給藥后24小時，每組活殺部分動物，其余動物停止染毒，繼續(xù)觀察2～4周，檢測各項指標，重點觀察毒反應器官。指標觀察時間一般狀況和癥狀，每天觀察一次。飼料消耗和體重，每周記錄一次。試驗周期小于3個月的，末次給藥后24小時和恢復期結束時各進行一次全面檢查。試驗周期大于3個月的，可在試驗中期活殺少量動物檢測各項指標。瀕死或死亡動物應即時檢查。觀察指標慢性毒性作用

chronictoxicity概念-慢性毒作用指實驗動物或人長期（甚至終身）反復接觸外來化合物所出現(xiàn)的毒效應時間:依受試物具體要求和動物種類定大鼠1年狗1-2年如果與致癌試驗結合進行，染毒期限最好接近或等于動物的預期生命試驗目的觀察長期接觸受試物的毒性效應譜、毒作用特點、靶器官；闡明受試物慢性毒性的劑量－反應（效應）關系，確定其NOAEL和/或LOAEL，預測人群接觸該受試物后可能發(fā)生慢性毒性的危險性，為制定人類接觸的安全限量提供依據(jù)實驗動物選擇和要求-慢性試驗

※兩種實驗動物：嚙齒類，非嚙齒類

※

要求為初斷乳的動物，小鼠出生后3周，體重1012g；大鼠出生后34周，體重5070g

※一般雌雄兩性動物同時分別進行，各劑量組兩性動物數(shù)相等。

實驗動物選擇和要求-慢性

※至少應設計３個染毒劑量組及１個正常對照組，必要時再加一個受試化合物的溶劑對照組

，小動物每組40－60只，大動物每組８－12只，分組要隨機化。如分批處死，試驗結束時，每劑量組每性別的嚙齒類動物不少于10只，非嚙齒類動物不少于４只；動物同性別個體初始體重相差應不超過平均體重的20%。

※盡可能使用高等級動物，在符合國家實驗動物要求的試驗環(huán)境中進行

※劑量設置原則為：足夠高的劑量以能觀察到受試物的毒作用、闡明毒性靶器官同時試驗能順利進行；有明確的劑量－反應關系，得到理想的LOAEL和NOAEL。

參考：亞慢LOAEL、LD50劑量選擇參考以亞慢性閾劑量或其1/5-1/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/50-1/10為慢性毒性的預計閾劑量，并以其1/100為預計的慢性無作用劑量組以LD50為出發(fā)點，高、中、低三組分別為LD50的1/10、1/100、1/1000劑量間距一般為2-4倍（不超過10倍），以利于得到劑量-反應關系，也有利于排除實驗動物個體敏感性差異一般來說，當預期受試物無明顯毒性時，亞慢性和慢性毒性試驗最高劑量(不進行體重和體表面積換算)設計為至少等于人擬用最大劑量的倍數(shù)是：保健食品應為100倍，中藥為50倍，純化學藥品為30倍當以不同的劑量依據(jù)設計與較長期結果不一致時，需要根據(jù)以往的經(jīng)驗判斷，或增加劑量組以保證得到良好的劑量-反應關系。試驗期限-慢性12個月染毒期12個月染毒期+恢復期觀察（28天）：觀察受試物所致毒性的可逆性、持續(xù)性和遲發(fā)