醫(yī)學(xué)交流課件：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)

單克隆抗體技術(shù)可用抗體治療的疾病移植排斥腫瘤自身免疫病心血管疾病感染性疾病過(guò)敏性疾病治療用抗體發(fā)展的三個(gè)階段單克隆抗體基因工程抗體多克隆抗血清（二）治療用抗體部分

1975年8月7日，Kohler和Milstein在Nature上發(fā)表了一篇報(bào)道,題為Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.(Nature1975;256:495)“可分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)。”這一文獻(xiàn)已成為一篇經(jīng)典的文獻(xiàn),對(duì)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究有著深遠(yuǎn)的意義。為此,Kohler和Milstein獲得了1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。這一技術(shù)上的突破,在制造和使用抗體方面開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)新紀(jì)元。所以Mab被稱為第二代抗體。治療性抗體(TherapeuticalMonoclonalAntibodies)26種Bevacizumab(anti-EGFR)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌Efalizumab(anti-CDIIa)慢性中、重度銀屑病I-131Tositumomab(anti-CD20)non-Hodgkin淋巴瘤Abciximab(anti-GPIIb/IIIa)抗凝Alemtuzumab(anti-CD52)B-細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病Infliximab(anti-TNFα)Crohn’s病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Trastuzumab(antiHER-2)轉(zhuǎn)移性乳腺癌Basiliximab(anti-CD25)腎移植急性排斥Cetuximab(anti-EGFR)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌或直腸癌Rituximab(anti-CD20)non-Hodgkin’s淋巴瘤Muromomab-CD3(anti-CD3)腎移植急性排斥Daclizumab(anti-CD25)腎移植急性排斥Cetuximab單抗結(jié)腸癌Tysabri重組人源化IgG4k抗炎癥反應(yīng)產(chǎn)品適應(yīng)癥產(chǎn)品適應(yīng)癥Palivezumab(anti-FproteinofRSV)防治小兒下呼吸道合胞病毒感染Ibritumomabtiuxetan(anti-CD20)non-Hodgkin’s淋巴瘤Adalimumab(anti-TNFα/anti-CD33)CD33急性髓性白血病Omalizumab(anti-IgE)中、重度持續(xù)性哮喘Campath人源化抗體抗CD52Rituxan嵌合抗體抗CD20Mylotarg(抗生素標(biāo)記重組人IgG4)抗CD33Humira重組全人IgG1抗TNFSynagis人源化IgG1抗RSV病毒表位F蛋白R(shí)emicade嵌合IgG1抗TNFaBexxarI131標(biāo)記鼠IgG2a抗CD20(超敏反應(yīng))淋巴細(xì)胞T淋巴因子（干擾素）細(xì)胞免疫B抗體體液免疫一、抗體的結(jié)構(gòu)和功能

1、一個(gè)抗體分子包括兩個(gè)完全相同的重鏈分子（H）和兩個(gè)完全相同的輕鏈分子（L）

2、用木瓜蛋白酶處理可將抗體分解為3個(gè)部分，即兩個(gè)Fab片段和個(gè)Fc片段：

Fab：保存與抗原結(jié)合的活性和特異性

Fc：抗體結(jié)合抗原后激活機(jī)體免疫反應(yīng)的主要部位VLCLCHVH

FabFcBasicStructureofAbMolecules

抗體分子的基本結(jié)構(gòu)重鏈由約450個(gè)氨基酸（IgG、IgA、IgD）或570個(gè)氨基酸（IgM、IgE）組成，輕鏈由約214個(gè)氨基酸組成。完整抗體的相對(duì)分子質(zhì)量約為150kDa。在Ig分子氨基端，L鏈的1/2區(qū)段與H鏈的1/4區(qū)段的氨基酸組成及排列順序多變，稱為可變區(qū)（variableregion,V區(qū)）；羧基端L鏈的1/2區(qū)段與H鏈的3/4區(qū)段的氨基酸組成和排列比較恒定，稱為恒定區(qū)（constantregion,C區(qū)）。在V區(qū)中，某些特定位置的氨基酸殘基顯示更大的變異性，構(gòu)建了抗體分子和抗原分子發(fā)生特異性結(jié)合的關(guān)鍵部位，稱為互補(bǔ)決定區(qū)（complementarydeterminingregion,CDR），它是V區(qū)中特異結(jié)合抗原的部位。而C區(qū)則決定了Ig分子的異種抗原性，主要發(fā)揮抗體分子的效應(yīng)功能。重鏈和輕鏈V區(qū)中各有3對(duì)CDR（CDRl，CDR2，CDR3），每個(gè)CDR長(zhǎng)約5個(gè)~16個(gè)氨基酸。V區(qū)中CDR以外的部分稱為框架區(qū)（frameworkregion,FR），F(xiàn)R區(qū)為β片層（β-sheet）結(jié)構(gòu)，氨基酸組成相對(duì)保守，不與抗原分子直接結(jié)合，但對(duì)維持CDR的空間構(gòu)型起著極為重要的作用。L鏈有VL和CL兩個(gè)功能區(qū)，H鏈有VH和CH1、CH2、CH3等4個(gè)功能區(qū)。VL和VHCDR區(qū)共同構(gòu)成一個(gè)抗原結(jié)合部位。哺乳類的輕鏈有兩種型別，κ型和λ型。重鏈可分為μ、ε、γ、δ、α5類。多克隆抗體：由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)抗原決定簇，因此每個(gè)免疫細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對(duì)某一抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原產(chǎn)生的不同抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。一,單克隆抗體定義

由最初一個(gè)細(xì)胞元件繁殖而形成的純細(xì)胞集團(tuán)，稱一個(gè)克隆（clone）。單克隆是指由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖而形成的遺傳性狀完全相同的細(xì)胞群。把能分泌某種特異抗體的一個(gè)B淋巴細(xì)胞分離出來(lái)，通過(guò)純種培養(yǎng)所產(chǎn)生的抗體只有一種。這種由單一克隆B淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的，識(shí)別抗原分子上某一特定抗原決定簇的抗體，稱單克隆抗體（McAb），簡(jiǎn)稱單抗。McAb的主要特點(diǎn):1.

高度均質(zhì)性.2.

高度特異性—針對(duì)一個(gè)抗原決定簇.3.

來(lái)源穩(wěn)定,可大批生產(chǎn).二、單克隆抗體的制備1975年,英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室的Kohler和Milstein首先應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(P3X63-Ag8)混合,加入仙臺(tái)病毒,進(jìn)行融合后,在選擇性培養(yǎng)基HAT[H,Hypoxanthin次黃嘌呤;A,Aminopterin氨基喋呤,T,Thymidine胸腺密啶核苷]上克隆再克隆,得到單株無(wú)性繁殖雜交瘤細(xì)胞系。在基培養(yǎng)液的上清中或接種到小鼠腹腔的腹水中,含有高度專一的，能在單個(gè)抗原中決定簇水平上選擇Ag的特異性抗體.這種Ab系由單株系細(xì)胞所產(chǎn)生,因此稱為MAb。利用雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)單克隆抗體1、抗原免疫

動(dòng)物選擇：Balb/c小鼠抗原途徑2、細(xì)胞融合

骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-（次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型）

脾細(xì)胞

病毒

聚乙二醇（PEG）

電融合技術(shù)

PEG的作用機(jī)制PEG可以使細(xì)胞聚積在一起,當(dāng)PEG的濃度達(dá)50%時(shí),PEG可能與鄰近膜的水分相結(jié)合,使細(xì)胞之間只有幾個(gè)埃的空間的水分被取代,由此,降低細(xì)胞表面的極性,導(dǎo)致脂雙層不穩(wěn)定,引起細(xì)胞膜的融合.3、雜交瘤細(xì)胞的選擇HAT培養(yǎng)基（次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶）核酸合成途徑：全合成途徑（被葉酸拮抗劑氨基蝶呤阻斷）補(bǔ)救途徑（關(guān)鍵酶為次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HGPRT）核苷酸的合成(從無(wú)到有)甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸THFA5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸THFA5-甲酰胺-4-氨甲酰咪唑核苷酸補(bǔ)救途徑次黃嘌呤次黃嘌呤-5磷酸次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶4、克隆化與再克隆化克?。河蓡蝹€(gè)細(xì)胞繁殖擴(kuò)增而形成性狀均一的細(xì)胞集落的過(guò)程（1），有限稀釋技術(shù)柏松分布（2），半固體瓊脂培養(yǎng)法0.5%瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆三,單克隆抗體的檢測(cè)1、單克隆抗體活性檢測(cè)

原理：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

2、雜交瘤染色體分析

3、Ig亞類分析鑒定①

先分析Ig類型,IgG,A,M②

再分析亞類,IgG1,IgG2a,IgG2b4、單克隆抗體純度鑒定

1.包被已知抗原:Ag要純,Ag越純，特異性越高。蛋白濃度1-10ug/ml.

每孔加0.2mL,4℃過(guò)夜.PBST洗3次x5’;封閉10%小牛血清.37℃30’.PBST洗3x5’。加培養(yǎng)上清37℃2h.PBST洗3x5’。注意加陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照。4.加酶標(biāo)記二抗(兔抗鼠)37℃2hPBST洗3x5’。

5.加底物顯色.6.加終止劑2MH2SO4,50uL測(cè)OD值判定結(jié)果:

陰性孔應(yīng)無(wú)色或接近無(wú)色.

陽(yáng)性孔明顯顯色.OPD-棕紅色測(cè)定孔OD≥2倍以上,判定為陽(yáng)性四,雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

五,雜交瘤單抗的大量制備①.

動(dòng)物腹水制備②.

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)六,McAb的純化

鹽析

DEAE凝膠過(guò)濾親和層析(proteinA)七,單克隆抗體應(yīng)用

1、單克隆抗體靶向制劑

1）藥物與單抗直接偶聯(lián)

2）藥物通過(guò)小分子與單抗連接

3）藥物通過(guò)大分子與單抗相連

2、腫瘤的導(dǎo)向治療類別分類品名類別分類品名毒素類植物毒素蓖麻毒素、肥皂草素、厥連毒素烷化劑苯丁酸氮芥，美法侖，動(dòng)物毒素?？苎舅乜褂薪z分裂劑長(zhǎng)春鹼類，阿霉素，4-去甲基柔紅霉素微生物毒素綠膿桿菌外毒素、白喉毒素DNA嵌入劑美登素，Calicheamycin真菌毒素蛾膏覃鹼、Ristricfocin酶類羧基肽酶G胞核戊苷脫氨基酶，減性磷酸酶放射性同位素α-放射性同位素212鉍β-內(nèi)酰胺酶β-放射性同位素204鉈，32磷細(xì)胞因子白細(xì)胞介素II，腫瘤壞死因子，干擾素γ-放射性同位素127碘，99m锝，111銦脂質(zhì)體化療藥物抗代謝劑氨甲喋呤，5-氟去氧尿嘧啶3,單克隆抗體與新型診斷技術(shù)體內(nèi)微量成分和藥物的測(cè)定癌癥診斷傳染病診斷蛇毒診斷體內(nèi)定位診斷

放射免疫顯影技術(shù)：是對(duì)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶或復(fù)發(fā)灶進(jìn)行定位或定性診斷的無(wú)創(chuàng)傷新技術(shù)

研究進(jìn)展:1.基因工程抗體2.人/鼠雜交單克隆抗體3.噬菌體抗體

鼠抗體可變區(qū)人抗體恒定區(qū)人－鼠嵌合抗體人抗體可變區(qū)重構(gòu)抗體(或改形抗體）(CDR移植的人單抗)人源化單抗制備細(xì)胞工程技術(shù)基因工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物一,細(xì)胞技術(shù)EBV病毒轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞技術(shù)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞技術(shù)EBV病毒轉(zhuǎn)化雜交瘤細(xì)胞技術(shù)二,基因工程A,重組DNA嵌合抗體

用編碼人抗體Fc區(qū)域的DNA片段替換編碼鼠源單抗Fc的DNA片段，重組的DNA分子克隆到表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，從該細(xì)胞收集的即為嵌合抗體

目前，用于治療目的的單克隆抗體多為鼠源性單克隆抗體。鼠抗體基因與人基因的同源性較少，因此鼠源性單克隆抗體對(duì)人體具有較強(qiáng)的免疫原性，使用后很可能會(huì)誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)。由于這種抗體反應(yīng)90％是針對(duì)C區(qū)的，因此設(shè)計(jì)用人C區(qū)替代鼠C區(qū)，則可能使鼠源性單克隆抗體的免疫原性明顯減弱。

嵌合抗體的基本原理是從分泌某種鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞基因組中分離并鑒定出重排的功能性鼠IgV區(qū)基因，經(jīng)基因重組與人IgC區(qū)基因按一定方式相拼接，克隆到表達(dá)載體中構(gòu)建鼠/人嵌合的輕重鏈基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá),制備特異性嵌合抗體。嵌合抗體原理

根據(jù)抗體基因由多個(gè)不同功能區(qū)組成，每個(gè)功能區(qū)都位于獨(dú)立外顯子中的特點(diǎn)，人們可以對(duì)抗體基因進(jìn)行重新組裝。1984年由Morrison等構(gòu)建的嵌合抗體（chimericanantibody)即是第一種基因工程抗體，開(kāi)創(chuàng)了抗體工程的先例。B、改型抗體

為了減少鼠蛋白在嵌合抗體中所占的比例,在超變區(qū)進(jìn)行氨基酸置換.通過(guò)置換鼠抗體超變區(qū)(CDR3)獲得改型抗體或人源化抗體。

一種人源單克隆抗體的結(jié)構(gòu)C.單鏈抗體

應(yīng)用PCR技術(shù)得到抗體重鏈可變區(qū)VH,插入表達(dá)載體表達(dá)VH單區(qū)小抗體,與抗原有1/10的親和力.將VL基因末端與VH基因N末端連接,將此重組基因轉(zhuǎn)入E.Coli,所得的可變區(qū)單鏈抗體有原抗體與Ag結(jié)合的相同特異性和親和力.最大的優(yōu)點(diǎn)是分子小,可進(jìn)入微循環(huán),有利于實(shí)體瘤治療診斷.三、雙特異性抗體:

這種新型抗體的兩個(gè)Fab片段能同時(shí)與不同的兩個(gè)抗原結(jié)合即具有不同結(jié)合活性.

制備雙特異抗體有化學(xué)偶聯(lián)法.雜交瘤方法和基因工程方法.①.偶聯(lián)法可快速、大量制備雙特異抗體,但在體內(nèi)易被清除.②.雜交瘤方法制備的雙特異抗體生物活性高,但制備要經(jīng)過(guò)融合,篩選而繁瑣的步驟,耗時(shí)長(zhǎng),不易與其他單抗分離開(kāi).③.基因工程方法制備的雙特異抗體分子量小,易于大量制備,有廣闊前途.四、抗體庫(kù)技術(shù)和噬菌體抗體

整套抗體(RepertoireAb.)McAb——基核細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)

1990年Mccafferty等證明:將Ab可變區(qū)基因插入噬菌體geneⅢ中,表達(dá)出與噬菌體衣殼蛋白的N末端相連的抗體—噬菌體融合蛋白.抗體功能片段呈現(xiàn)在噬菌體表面,而且能正確折疊,并能與特異性Ag結(jié)合,由于有此特性,可用抗原直接篩選基因文庫(kù)中任何一種所需要的抗體,使得整套抗體的分離.生產(chǎn)更快更容易.從分離的淋巴細(xì)胞中提取mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增重鏈和輕鏈用一套特別的限制性內(nèi)切酶酶解將重鏈序列克隆到重鏈絲狀噬菌體載體中將重鏈和輕鏈重組到一個(gè)絲狀噬菌體載體中用抗原結(jié)合篩選噬菌斑將輕鏈序列克隆到輕鏈絲狀噬菌體載體中在絲狀噬菌體中表達(dá)抗體的過(guò)程噬菌體抗體的生產(chǎn)分四個(gè)步驟1.

從免疫或未免疫的B細(xì)胞中分離Ab可變區(qū)基因.2.

PCR擴(kuò)增抗體基因片段并克隆進(jìn)噬菌體以建立基因文庫(kù)(可達(dá)106-109).3.克隆到入噬菌體,建立基因文庫(kù).篩選特異性的

VH,VLDNA片段.4.測(cè)定序列.將此完整的小鼠VH,VL基因分別與人的CL,CH相嵌合,構(gòu)成嵌合基因.5.轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞.表達(dá)Ig分子.

也可用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)構(gòu)建小鼠V區(qū)CDNA文庫(kù).五轉(zhuǎn)基因鼠1,在鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)（ＥＳ）采用內(nèi)源技術(shù)使鼠IgH和IgK基因失活２,相互繁育和回交產(chǎn)生ＤＩ鼠不能產(chǎn)生鼠源抗體，３，以人工酵母染色體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將含有人的IgH（ＹＨ２）和IgK（ＹＫ２）的基因整合到ＥＳ細(xì)胞染色體上生成轉(zhuǎn)基因小鼠八,轉(zhuǎn)基因植物重組人α干擾素

單克隆抗體的研制

干擾素是細(xì)胞免疫的重要成分，目前廣泛應(yīng)用于病毒性肝炎、腫瘤和一些其他病毒感染的治療中。干擾素的檢測(cè)和重組人干擾素的純化工藝均需要高質(zhì)量的單克隆抗體，特別是在生產(chǎn)重組干擾素工藝中，單克隆抗體親和層析是生產(chǎn)干擾素最重要步驟。1、雜交瘤細(xì)胞株的建立純化重組人干擾素α1ｂ（抗原）6周齡雄性BALB/c小鼠100μｇ抗原＋完全佛氏佐劑100μｇ抗原＋不完全佛氏佐劑100μｇ抗原＋不完全佛氏佐劑尾靜脈注射抗原100μｇ第一次免疫第二次免疫第三次免疫加強(qiáng)免疫↓↓↓↓1個(gè)月后2個(gè)月后融合前3天動(dòng)物免疫無(wú)菌取脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/01:5~1:10混合，離心＋37℃水浴，加入預(yù)溫的50%PEG，靜置1.5min，滴加不完全DMEM，離心加完全DMEM接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃5%CO2環(huán)境培養(yǎng)第2天換含1%HAT完全DMEM培養(yǎng)基14d后換1%HT培養(yǎng)基，挑選克隆細(xì)胞融合ELISA方法檢測(cè)抗體陽(yáng)性克隆篩選細(xì)胞體外擴(kuò)增腹腔接種BLAB/c小鼠14d后收集腹水腹水制備2、抗體的篩選

采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液、腹水中和抗體滴度,分別用重組人干擾素(α1ｂ、α2ｂ、α2ａ、)和重組集成干擾素、重組新型干擾素作抗原。3、抗體特異性鑒定交叉中和試驗(yàn)Westernblot試驗(yàn)4、免疫球蛋白類和亞類的鑒定5、雜交瘤細(xì)胞染色體核型分析6、單克隆抗體純化7、單克隆抗體蛋白計(jì)算8、抗人α型干擾素親和層析柱的制備動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥

動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)無(wú)細(xì)胞壁倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢需氧量少，對(duì)攪拌敏感聚集體形成原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開(kāi)始退化

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)定義動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因工程細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：嚴(yán)格滅菌不能有有害物質(zhì)適量的供氧清除代謝廢物，良好的生成環(huán)境及時(shí)分種生長(zhǎng)形式懸浮培養(yǎng)半懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)基的種類天然合成無(wú)血清體外培養(yǎng)特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差,敏感培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，易污染體外培養(yǎng)條件溫度，37度pH：7.2-7.4氣體，氧，二氧化碳，氮?dú)鉅I(yíng)養(yǎng)條件需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長(zhǎng)因子，其中多種成分可以由血清提供供應(yīng)公司雜交瘤細(xì)胞CHO細(xì)胞昆蟲(chóng)細(xì)胞淋巴樣細(xì)胞通用Bio-WhittakerIncUltradoma(30)Ultra-CHO(<300)InsectXpress(0)Ex-Vivorange(1000-2000)UltraCulture(3000)UltradomaPF(0)BoehringerMannheimNutridomarange(40-100)————GiboHybridomaSFM(730)CHO-SFM(400)SF900AIMV—HybridomaPHFM(0)HycloneLaboratorlesCCM-1(200)CCM-5(<400)CCM-3(0)——ICNFlowBiorich2—Biorich2——JRHBiosciencesSeralabEx-cell300(11)Ex-cell301(100)Ex-cel(401)Aprotain-1(0)—Ex-cell309(10)SigmaQBSF-52(45)—SFinsect——QBSF-55(65)Medium(0)TCSBiologicalsLtd.Softcell-domaLP(30)Softcell-CHO(300)Softcell-insect(0)—Softcell-Universal(3000)Softcell-domaHP(0)VentrexHL-1(<50)————當(dāng)前從市場(chǎng)可獲得的適用于各種細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)丙氨酸(L-alanine)8.9精氨酸(L-arginine)17.4200.0精氨酸(L-arginine·HCl)126.084.0211.0天冬酰胺(L-asparagine)50.0天冬酰胺(L-asparagine·H2O)15.0天冬氨酸(L-asparagineacid)13.320.0半胱氨酸(L-cystelne·HCl·H2O)35.12胱氨酸(L-cystine)12.048.050.0胱氨酸(L-cystine·HCl)31.0谷氨酸(L-glutamicacid)14.720.0谷氨酰胺(L-glutamine)292.0292.0584.0146.0300.0甘氨酸(glycine)30.07.510.0常用培養(yǎng)基成分及配方/mg·L-11常用培養(yǎng)基成分及配方/mg·L-12成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)組氨酸(L-histidine)8.015.0組氨酸(L-histidine·HCl·H2O)42.042.020.96羥脯氨酸(L-hydroxyproline)20.0異亮氨酸(L-isoleucine)26.052.0105.03.950.0亮氨酸(L-leucine)26.052.0105.013.150.0賴氨酸(L-lysine)29.2賴氨酸(L-lysine·HCl)72.5146.036.540.0甲硫氨酸(L-methionine)7.515.030.04.4815.0苯丙氨酸(L-phenylalanine)16.532.066.04.9615.0脯氨酸(L-proline)34.520.0絲氨酸(L-serine)42.010.530.0蘇氨酸(L-threonine)色氨酸(L-tryptophan)酪氨酸(L-tyrosine)24.04.018.048.010.095.016.072.011.92.0420.05.020.0成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)酪氨酸(L-tyrosine2Na·2H2O)52.07.8纈氨酸(L-valine)23.546.094.011.720.0生物素(D-biotln)1.00.00730.2偏多酸鈣(D-calciumpantothenate)1.01.04.00.480.25氯化膽堿(cholinechloride)1.01.04.013.963.0葉酸(folicacid)1.01.04.01.31.0肌醇(inositol)2.02.07.218.035.0煙酰胺(nicotinamide)1.01.04.00.0371.0吡哆醛(pyridoxal·HCl)1.01.04.00.0621.0核黃素(riboflavin)0.10.10.40.0380.2硫胺(thiamin·HCl)1.01.04.00.341.0維生素B2(vitamineB2)1.360.005對(duì)氨基苯甲酸(P-aminobenzoicacid)1.0常用培養(yǎng)基成分及配方/mg·L-13常用培養(yǎng)基成分及配方/mg·L-14成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)CaCl2200.0200.0200.033.22KCl400.0400.0400.0223.6400.0MgCl257.22MgSO497.67MgSO4·7H2O200.0200.0100.0NaCl6800.06800.06400.07599.06000.0NaHCO32200.02200.03700.07176.02000.0Na2HPO4·H2O140.0140.0125.0142.04CuSO4·5H2O0.0025FeSO4·7H2O0.100.834ZnSO4·7H2O0.863Ca(NO3)2·4H2O100.0常用培養(yǎng)基成分及配方/mg·L-15成分BEM(320-1015)MEM(320-112)DMEM(320-1965)HAMF12(320-1765)RPMI1640(320-1877)葡萄糖(D-glucose)1000.01000.04500.01802.0200.0硫辛酸(lipoicacid)15.00.21酚紅(phenolred)10.010.01.25.0丙酮酸鈉(sodiumpyruvate)110.0次黃嘌呤(hypoxanthine)4.77亞油酸(linoleicacid)0.084腐胺(putrescine·2HCl)0.161胸腺嘧啶核苷(thymidine)0.73谷胱甘肽(glutathionereduced)1.0大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)懸浮貼壁微載體包埋和微束結(jié)團(tuán)商品名基質(zhì)帶電基和交換當(dāng)量形狀直徑大小/um比表面積/cm2·g-1比重/g·mL-1透明度Cytodex-1葡聚糖DEAE1.5meq/g球狀131-21060001.03+Superbeads葡聚糖DEAE2.0meq/g球狀135-2055000-6000ND+Biocarrier聚丙烯酰胺二甲胺苯基1.4meq/g球狀120-18050001.04+Cytodex-2葡聚糖三甲基2羥胺基0.6meq/g球狀114-19855001.04+Cytodex-3葡聚糖60ug膠原/cm2載體表面球狀133-2154500ND+Ventragel交聯(lián)明膠明膠球狀150-250ND1.03+Celibeads交聯(lián)明膠明膠球狀115-2353300-43001.04+Btostlon聚苯乙烯負(fù)電荷球狀160-3002251.05±Cytosperes聚苯乙烯負(fù)電荷球狀160-3002501.04±DE-53纖維素DEAE2.0meq/g柱狀40-50NDND-已商品化的微載體商品名基質(zhì)直徑/um比重/gm·L-1孔徑/um空體積/%比表面積/cm2·g-1公司CultipherS明膠170-2701.0310-20501.5PercellCultipherGLD明膠加鈦430-600ND50-100500.25PercellVX-100明膠加鈦5001.6-1.720-40850.4VeraxInformatrix膠原-葡聚糖400-8001.00220-6099NDBiomatSiran玻璃300-500ND10-10060NDSchottGlaswerkeAsahiMC纖維素180-2101.0330982.8AsahiCytopore1纖維素200-2801.0330982.8PharmaciaCytopore2纖維素200-2801.0330982.8Pharmacia已商品化的多孔載體平床式中空纖維生物反應(yīng)器示意圖三室系統(tǒng)的Membroferm生物反應(yīng)器示意圖籠式通氣攪拌器示意圖氣升式生物反應(yīng)器示意圖VitafiberⅡ型圓柱狀中空纖維反應(yīng)器示意圖多極流化床CF-IMMO生物反應(yīng)器示意圖CelliGenplus生物反應(yīng)器示意圖Vero細(xì)胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級(jí)放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口收獲病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)

將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimal）是把外源基因?qū)雱?dòng)物的生殖細(xì)胞中，并整合該外源基因的細(xì)胞能發(fā)育成為個(gè)體，整合的外源基因又能影響其后代遺傳的動(dòng)物。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

TransgenicAnimals用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi),并能穩(wěn)定傳代的一類動(dòng)物。 制造產(chǎn)品、改良生命、研究手段

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在全世界范圍內(nèi)形成一個(gè)高潮，在1998年世界上最保守的英國(guó)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)增加了27%，占整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)量的17%。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)業(yè)化也迅猛發(fā)展，全球依賴轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)為核心的公司43家。近年來(lái)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究在促進(jìn)生長(zhǎng)，提高抗病力，血液肽生產(chǎn)和利用乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)藥用蛋白以及疾病模型等主要的方面取得了明顯的進(jìn)展。一、基本過(guò)程及原理供體的基因受體的受精卵高效表達(dá);定位整合、穩(wěn)定遺傳和適度表達(dá)與建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相關(guān)的技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)包括：（1）外源目的基因的獲得和組構(gòu)（2）將外源目的基因有效地導(dǎo)人生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，經(jīng)選擇獲得轉(zhuǎn)目的基因的細(xì)胞（3）選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物，使轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育（4）鑒定、篩選所得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系

基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化學(xué)和生物學(xué)方法1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細(xì)胞法（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）3)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4)精子載體法

原核注射法是將外源基因（轉(zhuǎn)基因或DNA的構(gòu)建）的多個(gè)拷貝導(dǎo)入到受精卵的原核中。迄今為止利用這種方法已經(jīng)生產(chǎn)了大量轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。利用顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛和羊包括收集卵母細(xì)胞、卵母細(xì)胞的體外成熟、體外授精、顯微注射后的體外胚胎培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移胚胎到接受者體中等一系列的操作。DNA顯微注射精原核卵原核DNA注射針持卵管顯微注射儀

顯微注射法的特點(diǎn)快速操作較簡(jiǎn)單DNA大小無(wú)限制有效率3-5%隨機(jī)整合總效率較低(實(shí)際成功率1/1000)

以小鼠轉(zhuǎn)基因?yàn)槔?/p>

1.注射外源基因后受精卵的存活率為86％

2.將受精卵移殖到母鼠子宮內(nèi)后受精卵的存 活率為25％

3.母鼠的懷孕率為80％

4.轉(zhuǎn)基因在基因組上的整合率為24％

5.因此小鼠轉(zhuǎn)基因的總有效率約為4％動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的效率胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcellES)是從早期胚胎細(xì)胞團(tuán)分離出來(lái)的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多功能細(xì)胞．其是一種正常二倍體細(xì)胞，能參與胚胎的發(fā)育，因此可對(duì)ＥＳ細(xì)胞進(jìn)行基因操作．

2)胚胎干細(xì)胞法

（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）胚泡培養(yǎng)皿中培養(yǎng)分離內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)胰蛋白酶解離加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞2)胚胎干細(xì)胞法DNA胚胎干細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法囊胚原腸胚微注射轉(zhuǎn)基因動(dòng)物篩選胚胎干細(xì)胞法的特點(diǎn)一般帶有定點(diǎn)整合元件,避免了隨機(jī)整合體外培養(yǎng),正-負(fù)選擇,相對(duì)較簡(jiǎn)單需經(jīng)過(guò)多代才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，成本高目前只在小鼠身上獲得成功逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

1974年Jaenisch等用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為轉(zhuǎn)基因載體，將SV40DNA

注入小鼠囊胚腔中，發(fā)現(xiàn)獲得的小鼠體內(nèi)有SV40DNA整合。3)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體外源基因四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚逆轉(zhuǎn)錄病毒感染嵌合小鼠純合轉(zhuǎn)基因小鼠反轉(zhuǎn)錄病毒外源基因8細(xì)胞胚植入代孕母鼠嵌合小鼠純合轉(zhuǎn)基因小鼠雜交、篩選通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒載體獲得轉(zhuǎn)基因小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點(diǎn)單位點(diǎn)單拷貝整合插入位點(diǎn)分析較容易對(duì)家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(＜10kb)轉(zhuǎn)入的基因易缺少其鄰近的調(diào)控序列有可能大量復(fù)制病毒和存在病毒污染精子載體法該方法是將外源基因與精子共同培養(yǎng)，再通過(guò)電穿孔或脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法將外源基因?qū)氤墒斓木樱咕訑y帶外源DNA進(jìn)入卵中并受精，從而使外源DNA整合到染色體中。4)精子載體法DNA精子受精卵卵細(xì)胞共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法電穿孔法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物精子載體法特點(diǎn)簡(jiǎn)便、實(shí)用外源DNA以附加體存在,不再受宿主DNA的影響理論上有較好前景小鼠和魚(yú)具體機(jī)制不清楚,尚待進(jìn)一步改進(jìn)體細(xì)胞核移植法該技術(shù)是以動(dòng)物體細(xì)胞（包括動(dòng)物成體體細(xì)胞、胎體成纖維細(xì)胞等）為受體，將目的基因?qū)肽軅鞔囵B(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞，再以這些動(dòng)物體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動(dòng)物克隆，進(jìn)而得到帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞微注射DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細(xì)胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物微注射

基因的整合、表達(dá)檢測(cè)與細(xì)胞篩選

1)

隨機(jī)整合：線性化DNA分子, DNA的濃度和構(gòu)型、緩沖液成分， 核內(nèi)注射整合位點(diǎn)多變，影響表達(dá) 水平和組織特異性表達(dá)2) 共整合：將不同基因或不同構(gòu)件同 時(shí)注射3) 同源重組/定位整合:

基因打靶

基因打靶

genetargeting基因敲除(geneknockout):

將某個(gè)基因定向去除基因敲入(geneknockin):

定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑?代另一段基因序列通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物體內(nèi)研究此基因的功能1.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體neor基因HSV-tk基因

HB1 HB2同源重組整合,neo基因置換ES細(xì)胞基因組的目的基因tk1HB1neorHB2tk2非特異整合正負(fù)選擇法:

neor:新霉素抗性基因,G418tk:單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶,自殺基因,GCV特異整合tk1HB1neorHB2tk22.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體包埋法顯微注射法3.基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡

4.胚泡植入假孕小鼠的子宮中

5.嵌合體的雜交育種

4.轉(zhuǎn)移注射卵

假孕母鼠：輸卵管轉(zhuǎn)移和子宮轉(zhuǎn)移5.鑒定和鼠系建立胚鼠組織、胎鼠組織、幼鼠尾巴：外源基因的整合檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)基因鼠幼鼠血液：表達(dá)水平檢測(cè)鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblotPCR鑒定tk1HB1neorHB2tk2P1P2PCR無(wú)條帶非特異整合P1PCR特異條帶P2CSHB1neorHB2特異整合1.打靶載體的構(gòu)建同源基因片段質(zhì)粒載體neor基因HSV-tk基因

HB1 HB22.打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體包埋法顯微注射法同源重組整合,neo基因置換ES細(xì)胞基因組的目的基因tk1HB1neorHB2tk2非特異整合正負(fù)選擇法:

neor:新霉素抗性基因,G418tk:單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶,自殺基因,GCV特異整合tk1HB1neorHB2tk23.基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡

4.胚泡植入假孕小鼠的子宮中

5.嵌合體的雜交育種

多次交配可得純合轉(zhuǎn)基因鼠系含轉(zhuǎn)入基因[嵌合體(chimericmouse)]轉(zhuǎn)基因鼠純合鼠系的建立二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因大鼠、小鼠、羊、牛、兔、豬、魚(yú)、昆蟲(chóng)分析動(dòng)物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型基因產(chǎn)品的制備:乳腺、膀胱生物反應(yīng)器動(dòng)物新品種的培育與動(dòng)物改良轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥的應(yīng)用1998年全球轉(zhuǎn)動(dòng)物制藥產(chǎn)品總銷售額為6.2億美元，預(yù)計(jì)到2010年總銷量額將達(dá)到110億美元，其中75億美元是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品，主要是藥用蛋白和營(yíng)養(yǎng)保健品。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥的優(yōu)點(diǎn)：（1）利用的設(shè)備簡(jiǎn)單、不耗能、無(wú)環(huán)境污染；（2）品種多、產(chǎn)量高、質(zhì)量好；（3）縮短生產(chǎn)周期短（目前新藥的開(kāi)發(fā)周期約需15-20年），利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器，只需約5年）（4）生產(chǎn)成本低，用其他生產(chǎn)工藝（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法）來(lái)生產(chǎn)1g藥物蛋白，成本需800-5000美元，而利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物只需要0.02-0.5美元1、利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人藥用蛋白的美歐市場(chǎng)評(píng)估和R&D現(xiàn)狀利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人用營(yíng)養(yǎng)保?。ㄡt(yī)療）品現(xiàn)狀

2、利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人用營(yíng)養(yǎng)保?。ㄡt(yī)療）品

美國(guó)在21世紀(jì)初的營(yíng)養(yǎng)醫(yī)用品市場(chǎng)大約為2500億美元，而歐洲將超過(guò)美國(guó)，目前全球營(yíng)養(yǎng)醫(yī)用品市場(chǎng)的平均增長(zhǎng)率超過(guò)187%，其中營(yíng)養(yǎng)醫(yī)用蛋白的發(fā)展?jié)摿ψ畲?，已?jīng)成為營(yíng)養(yǎng)醫(yī)用品的支柱，現(xiàn)在只滿足市場(chǎng)需求的10~15%。歐美等國(guó)家在此領(lǐng)域開(kāi)始了激烈的競(jìng)爭(zhēng)，全球一些制藥公司（如Jonhnson，Novartis，AmericanHomeProducts等）都紛紛對(duì)營(yíng)養(yǎng)醫(yī)用蛋白進(jìn)行投資，而一些巨型制藥公司（如GenzymeCorp，ZenecaGroupPLC等）則將一些營(yíng)養(yǎng)