蔗糖酶的酶促動力學(xué)

一、實驗?zāi)康暮鸵?．了解酶促動力學(xué)研究的范圍。2．以蔗糖酶為例，掌握測定米氏常數(shù)(Km)。二、實驗內(nèi)容和原理在酶促反應(yīng)中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度、pH和酶濃度恒定時，反應(yīng)初速度(v)則隨底物濃度[S]的增加而加速，最后達(dá)到極限，稱為最大反應(yīng)速度(v)。Michaelis和Menten根據(jù)反應(yīng)速度與底物濃度的這種關(guān)系，推導(dǎo)出如下方程：此式稱為米氏方程，式中Km稱為米氏常數(shù)，按此方程，可用作圖法求出Km。方法有：1．以v[S]作圖由米氏方程可知，v=V／2時，Km＝[S]即米氏常數(shù)值等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時所需底物濃度。因此，可測定一系列不同底物濃度的反應(yīng)速度v,以v對[S]作圖。當(dāng)v＝V／2時，其相應(yīng)底物濃度即為Km。2．以1／v對1／[S]作圖取米氏方程的倒數(shù)式：以1／v對1／[S]作圖可得一直線，其斜率為Km／V，截距為1/V。若將直線延長與橫軸相交，則該交點在數(shù)值上等于—l／Km。本實驗以蔗糖為底物．利用一定量蔗糖酶水解不同濃度蔗糖所形成的產(chǎn)物(葡萄糖和果糖)的量來計算蔗糖酶的Km值。葡萄糖和果糖能與3，5—二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，生成桔紅色化合物，可于520nm處比色測定之。棉子糖是一種非還原性三糖，與蔗糖有相似的結(jié)構(gòu)。蔗糖酶水解棉子糖，可得到雙糖（密二糖）和單糖（果糖），果糖是還原糖。棉子糖水解的速度可以用所生成的還原糖來進(jìn)行測定，但本實驗是要測定棉子糖和果糖對蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用，還原糖的測定不能真實的反應(yīng)果糖對蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用。實驗材料和試劑1．實驗材料：蔗糖酶提取的各步分離純化樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。2．實驗試劑：（1)3,5－二硝基水楊酸試劑：甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液。甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。（2)1％葡萄糖溶液(葡萄糖相對分子量198.17）。（3）1％蔗糖溶液。（4）0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5。（5）5％棉子糖溶液。（6）4mol/L尿素溶液。四、實驗器材與儀器1．試管及試管架；2．可見光分光光度計及1cm玻璃比色皿；3．恒溫水浴箱(50℃）。4.恒溫水浴（100℃）；5.移液管；6.微量移液槍。五、實驗步驟與數(shù)據(jù)記錄1.如下表所示，加入相應(yīng)試劑到各個試管中。并測定各試管溶液在520nm波長下的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．如表2所示配置各試管溶液。先采用6號管的底物溶液進(jìn)行預(yù)實驗，分別加入不同稀釋倍的蔗糖酶液，依表2步驟進(jìn)行后測定其吸光度。選用吸光度在0.6-0.7范圍內(nèi)的酶液，并以此作為蔗糖酶液的稀釋倍數(shù)。經(jīng)過預(yù)實驗可得1700倍為適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，因此下面的實驗都使用稀釋1700倍的蔗糖酶液。并記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。3．按表3加入相應(yīng)試劑到各個試管中，并按其步驟操作。測得A520，記錄數(shù)據(jù)。4．操作同步驟2，步驟3。五、實驗數(shù)據(jù)處理1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：圖1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2.表2數(shù)據(jù)處理：圖2.表2數(shù)據(jù)處理圖1/V～1/[S]由圖2求得Vmax=1.301×10-2，Km=1.301×10-6。3.表3數(shù)據(jù)處理：圖3.表3數(shù)據(jù)處理圖1/V～1/[S]由圖3求得Vmax=5.556×10-3，Km=5.