雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法

雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方案1.樣品制備（Samplepreparation）1.1儀器高速離心機(jī)試劑NS（制備好的）；Citratedhumanplasma溶解緩沖液（9M尿素，4,CHAPS2,IPG緩沖液，40mMDTT,40mMTris-base）1.3樣品處理方法1） .吸取適量的制備好的NS加入到Citratedhumanplasma中，在溫度為37°下孵化5min。NS與血漿的加入比例為0.6:8ml。2） 孵化后，將樣品高速離心，離心轉(zhuǎn)速為，時間為。。。。。3） 除去上清液，將沉淀的納米球再混懸于0.05M,pH7.4的磷酸緩沖鹽中，再次以上次條件離心，本步驟重復(fù)三次。4） 將離心后收集到的總蛋白溶解于溶解緩沖液（9M尿素，4,CHAPS，2,IPG緩沖液，40mMDTT,40mMTris-base）。2?第一相等電聚焦（IEF）2.1固定化pH剃度膠條的水化（IPGstriprehydration）2.1.1儀器IPGphor2.1.2試劑水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mMDTT和0.5%IPG緩沖液）水化液需當(dāng)天新鮮配制2.1.3實(shí)驗(yàn)步驟A.加樣品溶漲1） .用樣品溶解緩沖液（9M尿素，4,CHAPS,2,IPG緩沖液，40mMDTT,40mMTris-base）溶解樣品。蛋白質(zhì)上樣濃度（Q:如何確定上樣濃度,）不要超過10mg/ml,否則會造成蛋白質(zhì)的集聚或沉淀。2） .吸取適量（見下表1）含有樣品的水化液放入標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽中，為確保樣品充分進(jìn)入膠條中，不要加入過量的水化液。表1IPG膠條所需水化液體積3）.去掉IPG膠條的保護(hù)膜，膠面朝下，先將IPG膠條尖端（陽性端）朝標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢下壓膠條，并前后移動，避免生成氣泡，最后放下IPG膠條平端（陰極），使水化液浸濕整個膠條。4） .IPG膠條上覆蓋適量礦物油，蓋上蓋子。5） .將標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端背面電極與IPGphor儀器的陽極平臺接觸;膠條槽的平端背面電極與IPGphor儀器的陰極平臺接觸。6） .設(shè)置IPGphor儀器運(yùn)行參數(shù):IPG膠條溶脹的電壓，溫度和時間；等電聚焦電泳時的梯度電壓和溫度。電泳參數(shù)見表2。低電壓時水化，有利于高分子量蛋白質(zhì)進(jìn)入膠中，并減少蛋白質(zhì)形成積聚集體。表2IPGphor電泳參數(shù)g■t,v.." 」0尢電就0 iwrlPCjstiipBWwl1ItHJmm-HzIPGnrip-為電MVID-Uhnur（善ft）200VIhour5fl0￥Ihour30trninBflOOVShMJJ% NWS4^9.3-1OU3-L0PJLI.IPG膠條水化溶脹后可自動進(jìn)行等電聚焦電泳。.暫時不進(jìn)行第二向的IPG膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-80?保存幾個月。B.不加樣品IPG水化溶脹a.標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽:.用適量的水化溶脹液進(jìn)行膠條溶脹，3).去掉IPG膠條的保護(hù)膜，膠面朝下，先將IPG膠條尖端(陽性端)朝標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢下壓膠條，并前后移動，避免生成氣泡，最后放下IPG膠條平端(陰極)，使水化液浸濕整個膠條。4).IPG膠條上覆蓋適量礦物油，蓋上蓋子。5).將標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端背面電極與IPGphor儀器的陽極平臺接觸;膠條槽的平端背面電極與IPGphor儀器的陰極平臺接觸，溶脹過夜。.于膠條糟的加樣孔中加入濃縮的樣品。每個加樣孔的一側(cè)可加入7.5》l樣品(每個加樣孔分別有兩側(cè)可加樣)，采用此種方法上樣，每個膠條槽最多可加入30》l樣品。.設(shè)置IPGphor儀器運(yùn)行參數(shù):等電聚焦電泳時的梯度電壓和溫度，電泳參數(shù)見表2。.進(jìn)行等電聚焦電泳。.暫時不進(jìn)行第二向的IPG膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-80?保存幾個月。第一向膠條的平衡(IPGstripequilibration)IPG膠條平衡兩次，每次15分鐘。平衡緩沖液包括6M尿素和30%甘油，會減少電內(nèi)滲，有利于蛋白質(zhì)從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移。第二次平衡步驟中加入260mM碘乙酰胺，以去除多余的DTT(銀染過程中，DTT會導(dǎo)致點(diǎn)拖尾pointstreaking)。IPG膠條輕輕潤洗，并去除多余的平衡緩沖液，然后放入第二向SDS膠中。2.2.1儀器:玻璃管(200mm長,20mmi.d.),Parafilm,振蕩儀試劑:.分離膠緩沖液(1.5MTris-HCl,pH8.8和0.4%(w/v)SDS)2).平衡緩沖液(0.05MTris-HCl,pH8.8，6M尿素,30%(w/v)甘油和2%(w/v)SDS).溴酚藍(lán)溶液:0.25%(w/v)溴酚藍(lán)溶于分離膠緩沖液中實(shí)驗(yàn)步驟.使用前每10ml平衡緩沖液中加入0.1gDTT(相當(dāng)于平衡緩沖液I),根據(jù)表3加入適量平衡緩沖液I和溴酚藍(lán)溶液。取出IPG膠條分別放入玻璃管中(每個玻璃管中放入一條IPG膠條)，用Parafilm封口，在振蕩儀上振蕩15分鐘，倒掉平衡緩沖液I。.每10ml平衡緩沖液加入0.25g碘乙酰胺(相當(dāng)于平衡緩沖液II)。根據(jù)表3加入適量平衡緩沖液II和溴酚藍(lán)溶液。用Parafilm封口，在振蕩儀上振蕩15分鐘，倒掉平衡緩沖液II。.用去離子水潤洗IPG膠條一秒鐘后，將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘，以去除多余的平衡緩沖液。表3IPG膠條平衡液用量膠條長度(cm)建議平衡液體積(ml)/條溴酚藍(lán)溶液(ul)72.5-512.5-25115-1025-50135-1025-50181050241570第二相SDS電泳(SDS)3.1儀器電泳槽試劑.丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液(30.8%T，2.6%C)過濾后可于4?C儲存兩周內(nèi)使用。.分離膠緩沖液(1.5MTris-HCl,pH8.8和0.4%(w/v)SDS)此溶液可于4?C儲存兩周內(nèi)使用。.10%(w/v)過硫酸銨溶液(此溶液需使用前新鮮配制)。4)4).覆蓋液(緩沖液飽和的正丁醇):.取代液(50%v/v甘油和0.01%溴酚藍(lán)水溶液).低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液:含有0.5%(w/v)低熔點(diǎn)瓊脂糖的電極緩沖液。TEMED灌膠步驟,根據(jù)第一向IEF電泳時IPG膠條的大小選擇第二向合適的垂直電泳槽。1).按儀器說明書裝好灌膠模具，倒入凝膠溶液(在HoferDALT和EttanDALTII的灌膠模具中，拔掉灌膠的膠管后，取代液會把管道中剩余的凝膠溶液壓入模具中)。在每塊膠面上加覆蓋液以保持凝膠上樣面平整。.同時灌制多塊凝膠時，室溫下至少要聚合3小時。.暫時不需要的凝膠可用塑料薄膜包裹于4?C保存，2天內(nèi)使用。3.4電泳步驟,.電泳槽中裝滿電泳緩沖液，并打開溫控系統(tǒng)，設(shè)置溫度為15?。2).將平衡好的IPG膠條浸入電極緩沖液中幾秒鐘。3).將IPG膠條小心的放置于SDS膠面上，并輕壓使IPG膠條與SDS膠面充分接觸，然后在膠面上覆蓋2ml瓊脂糖溶液(75?左右)，使瓊脂糖在5分鐘內(nèi)凝固。34).垂直SDSgels(13%T,2.6%C,大小250x200x1mm)運(yùn)行條件5).當(dāng)溴酚藍(lán)染料遷移到膠的底部邊緣即可結(jié)束電泳。.將膠轉(zhuǎn)移到染色盒里固定，準(zhǔn)備染色。檢測染色(Detection/Staining)染色方法大致有:1)考馬斯亮蘭染色法(簡稱為考染法);2)硝酸銀染色法(簡稱為銀染法);3)負(fù)染法;4)熒光染色法;5)放射性同位素標(biāo)記法等這幾種檢測方法的靈敏度各不相同。目前最常用的是銀染法和考染法。銀染的靈敏度是考染的50,100倍故一般用銀染法進(jìn)行分析處理，再用考染法來進(jìn)行樣品制備。4.1經(jīng)典的考馬斯亮蘭染色程序,固定20%TCA1h染色0.1%CBBin40%EtOH/10%aceticacid2h脫色40%EtOH/10%aceticacid2X30min4)強(qiáng)化1%aceticacidovernight5)清洗deionizedH2O30min4.2銀染法步驟溶液(250ml/gel(16cmX18cm)時間(fix)25mlaceticacid,100mlmethanol125mlmilli-Qwater60min60min(Sensitization)75mlmethanol,0.5gNaSO22317gNaAc,165mlmilli-Qwater30min3X5min(wash)250mlmilli-Qwater(silver)0.625gAgNO,milli-Qwater20min3(wash)250mlmilli-Qwater2min6.25gNaCO,100|J1formaldehyde,(Develop)23250mlmilli-Qwater2-10minStop3.65gEDTA,milli-Qwater10