植物病毒病的檢驗(yàn)與鑒定

植物病毒病的檢驗(yàn)與鑒定第一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日植物病毒病的診斷與鑒定第四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日植物病毒?。菏怯芍参锊《炯纳鸬牟『χ参锊《静〉奈：白饔?.病毒引起的病害在數(shù)量上占植物病害的第二位。由植物病毒引起的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫蘆科等。在遼寧省引起毀滅性的植物病毒病有番茄蕨葉病毒病，辣椒花葉病毒病和煙草脈壞死病毒病等。2.生產(chǎn)上危害較大的植物病毒病害有：煙草花葉病、黃瓜花葉病、馬鈴薯病毒病、玉米矮花葉病等。3。植物病毒也有可利用的價(jià)值，特別在開發(fā)基因工程的載體、轉(zhuǎn)基因植物研究等方面，發(fā)揮了很大的作用。第五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日植物病毒病的診斷與鑒定植物病毒簡(jiǎn)介植物病毒病的癥狀特點(diǎn)植物病毒病的鑒定方法植物病毒病的防治第六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日一、植物病毒病簡(jiǎn)介觀察需要電子顯微鏡植物病毒主要成分是核酸和蛋白質(zhì)，核酸在內(nèi)部，外部由蛋白質(zhì)包被，稱為外殼，有的病毒粒體中還含有少量的糖蛋白或脂類。核酸5--40%，蛋白質(zhì)60-95%。植物病毒類型多樣，結(jié)構(gòu)特異第七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日植物病毒主要類型1.長(zhǎng)而彎曲的線狀粒體2.僵直的桿狀粒體3.示桿狀或線狀病毒核酸與蛋白亞基的排列4.桿菌狀粒體5.桿菌狀粒體橫切面6.多角體病毒粒體7.二十面體的核酸與蛋白亞基的排列第八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日二、植物病毒病的癥狀特點(diǎn)

一、外部癥狀(Symptom)：

病毒病害在癥狀表現(xiàn)上多為系統(tǒng)發(fā)病，表現(xiàn)為變色、畸形，少數(shù)引起壞死、腐爛，萎蔫極少發(fā)生。變色：花葉，黃化。

壞死：也稱作枯斑反應(yīng)，如馬鈴薯Ｙ病毒的某些株系侵染煙草可產(chǎn)生脈壞死。

畸形：抑制型：矮化，卷葉，皺葉，蕨葉。

刺激型：叢生，腫瘤。第九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日花葉（變色界限明顯）山茶花葉病第十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日黃化（葉柄發(fā)黃）第十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日壞死：以植物的組織和細(xì)胞死亡為特征，表現(xiàn)為枯斑、腐爛、焦枯等。第十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日葉片卷曲大麗花病毒病第十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日皺葉病蘋果皺葉病第十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日蕨葉病毒病；即葉片先從心部開始變硬呈帶狀或絲狀扭曲，嚴(yán)重者僅有一粗條葉脈，不能正常開花。第十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日馬鈴薯瘤腫病腫瘤：主要為病害植株地下部分，薯塊和匍匐莖上發(fā)生普遍。被害塊莖的芽眼和匍匐莖，由于病菌刺激細(xì)胞不斷分裂，形成大小不一、形狀不定、粗糙突起的腫瘤第十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日二、

病組織的內(nèi)部和細(xì)胞的變化：

1.組織變化：

組織壞死：如煙草花葉病毒TMV，它侵染心葉煙引起薄壁組織壞死，有些引起莖部維管束和葉部壞死，煙草花葉病毒侵染大豆引起頂芽和側(cè)枝壞死。一般引起黃化類型的病毒病多是因輸導(dǎo)組織、韌皮部壞死引起。第十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日組織壞死第二十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

組織增生：病毒侵染后，寄主植物體內(nèi)代謝失調(diào)，產(chǎn)生激素，引起增生。病組織的薄壁細(xì)胞分裂加快，數(shù)量迅速增多，使局部組織出現(xiàn)腫瘤或癌腫.有時(shí)植物細(xì)小的不定芽或不定根大量萌發(fā)生成叢枝或發(fā)根，也是增生的結(jié)果。第二十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日組織增生第二十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日2.細(xì)胞的變化：

花葉和斑駁是由于細(xì)胞內(nèi)葉綠素遭到破壞所致。

內(nèi)含體：某些植物被病毒侵染后，在病組織中產(chǎn)生的一種特殊結(jié)構(gòu)，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，在顯微鏡下可以觀察到。

內(nèi)含體的作用：①植物患病毒病后才有，因此，可作為一種診斷的指標(biāo)。②但并不是所有的病毒病都有內(nèi)含體，有些必須發(fā)育到一定階段才形成，同時(shí)一種病毒還可有多種形態(tài)的內(nèi)含體，因此，單靠?jī)?nèi)含體診斷還有一定的局限性。

第二十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)含體第二十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日甜椒表皮組織顯微鏡照片，經(jīng)紫紅核酸染劑染色，可看到中空的晶體狀內(nèi)含體可在細(xì)胞內(nèi)看到晶體內(nèi)含體(箭頭)。N:細(xì)胞核，S:氣孔。第二十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第二十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日三、患病植物的生理變化：表現(xiàn)為：①病毒侵染后呼吸強(qiáng)度先上升，后下降。②碳水化合物含量下降。③淀粉在葉部積累引起黃化。④多酚氧化酶和細(xì)胞色素氧化酶的活性增強(qiáng)，使細(xì)胞中毒壞死。⑤光合作用下降，破壞了寄主的葉綠素。⑥植物內(nèi)源激素水平失去平衡，造成畸形植物病毒病的癥狀特點(diǎn)第二十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日三、植物病毒病的鑒定方法（一）傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定方法目測(cè)法:利用病毒在植株上表現(xiàn)出來的外部特征進(jìn)行鑒定根據(jù)病毒的傳播方式可以確定病毒的屬。病毒的媒介傳播是確定病毒的輔助方法。指示植物鑒別法：利用將病毒接種在指示植物上表現(xiàn)出的特征性狀，作為鑒定是否感染病毒第二十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日（二）物理特征鑒別法1.稀釋限點(diǎn)(DilutionEndPoint，DEP)保持病毒侵染力的最高稀釋度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的體外穩(wěn)定性和侵染能力，也象征著病毒濃度的高低。2.鈍化溫度(ThermalInactivationPoint,TIP)處理十分鐘使病毒喪失活性的最低溫用攝氏溫度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有45℃；最高的是煙草花葉病毒，為97℃；而大多數(shù)植物病毒在55—70℃之間；3.體外存活期(Longevityinvitro，LIV)在室溫(20~22℃)下，病毒抽提液保持浸染力的最長(zhǎng)時(shí)間。大多數(shù)病毒的存活期在數(shù)天到數(shù)月。第三十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日4．沉降系數(shù)及分子量沉降系數(shù)的測(cè)定要用超速分析離心機(jī)，根據(jù)該病毒在一定離心力下沉降的速度來計(jì)算。有了沉降系數(shù)還可以來計(jì)算分子量。5．光譜吸收特性由于蛋白質(zhì)和核酸都能吸收紫外線，蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右。因此260／280的比值可以表示病毒核酸含量的多少，用于區(qū)分不同的病毒，比值小的多是線條病毒，比值高可能是球狀病毒。

第三十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日（三）免疫化學(xué)鑒定法1.電鏡觀察方法2.細(xì)胞病理學(xué)法：植物侵染病毒后會(huì)引起一系列的植物細(xì)胞病理變化，如在細(xì)胞內(nèi)形成病毒內(nèi)含體，影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)等。利用顯微鏡技術(shù)對(duì)病毒侵染引起的細(xì)胞病理學(xué)變化進(jìn)行觀察來檢測(cè)病毒的存在與種類。3.血清學(xué)鑒定

血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。最常用的有凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)（瓊脂雙擴(kuò)散法）、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第三十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日瓊脂雙擴(kuò)散為可溶性抗原與抗體在瓊脂凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應(yīng)。當(dāng)對(duì)應(yīng)的抗原、抗體在半固體瓊脂中相遇，且二者比例適當(dāng)時(shí)，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線，這組沉淀線是一組抗原、抗體的特異性復(fù)合物。當(dāng)瓊脂中有多組不同的抗原、抗體存在時(shí)，便各自依其擴(kuò)散速度的差異，在適當(dāng)?shù)牟课恍纬瑟?dú)立的沉淀線。第三十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日免疫瓊脂雙向擴(kuò)散是將可溶性抗原和抗體分別加到瓊脂板上相應(yīng)的小孔中，兩者各自向四周擴(kuò)散，如抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，兩者相遇即發(fā)生待異性結(jié)合，并在比例適合處形成白色沉淀線(圖5-1)。如果所加抗原和抗體標(biāo)本中分別含有若干與血清學(xué)反應(yīng)無關(guān)的抗原抗體，則因各種抗原的擴(kuò)散系數(shù)和各對(duì)抗原抗體間的最適比例不同，以及抗原抗體復(fù)合物所形成的沉淀線具有選擇性滲透屏障作用，擴(kuò)散后可以形成若干條沉淀線，—條沉淀線代表一對(duì)抗原抗體。因此，通過雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，用已知抗體(或抗原)檢測(cè)未知抗原(或抗體)，可鑒定抗原性物質(zhì)或免疫血清的濃度、純度及比較抗原之間的異同點(diǎn)。左圖為模式圖，右圖為實(shí)際試驗(yàn)的結(jié)果。上，兩個(gè)抗原孔里含有相同的抗原，沉淀線是不分叉的;中，兩個(gè)抗原孔里的抗原完全不同，沉淀線分叉;下，兩個(gè)抗原孔里的抗原部分相同，沉淀線部分交叉。第三十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就溶血現(xiàn)象，如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，整個(gè)試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統(tǒng)（綿羊細(xì)胞和溶血素）五種成份參加。其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體是相對(duì)應(yīng)的，如果出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對(duì)應(yīng)。

第三十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日第三十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱ELISA）將酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合,既保持了酶催化反應(yīng)的敏感性,又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性,因而極大的提高了靈敏度第三十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日

（三）分子鑒定法主要有核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)核酸分子雜交技術(shù)具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方是使用的探針和要檢測(cè)的核酸。從而測(cè)出要檢測(cè)病毒的DNA序列。第三十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。由于它具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力,并且可與其它分子生物學(xué)方法(如核酸雜交)和免疫學(xué)方法(如ELISA)相結(jié)合應(yīng)用,使其敏感性和特異性都大大增強(qiáng)第三十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日2/13/2023園林植物保護(hù)