植物細胞代謝產(chǎn)物制備

植物細胞代謝產(chǎn)物制備第一頁，共七十一頁，2022年，8月28日第9章內(nèi)容安排：I：植物細胞培養(yǎng)II：植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的應(yīng)用舉例分析與討論第二頁，共七十一頁，2022年，8月28日本節(jié)主要內(nèi)容：1.植物細胞培養(yǎng)技術(shù)本節(jié)關(guān)鍵問題：1.植物細胞的特點2.植物細胞培養(yǎng)方式：懸浮培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)3.植物細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器第三頁，共七十一頁，2022年，8月28日植物細胞培養(yǎng)得到的常見次級代謝物紫草寧小檗堿（黃連素）花青素，花黃素銀杏黃酮銀杏內(nèi)酯白果內(nèi)酯蒽醌青蒿素超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶香豆素薄荷醇人參皂甙類胰島素紫杉醇地高辛利血平奎寧堿長春花堿尼古丁魚騰酮迷迭香酸紫草細胞黃連細胞玫瑰茄細胞，紫蘇細胞銀杏細胞銀杏細胞銀杏細胞巴戟天細胞黃花蒿細胞大蒜細胞番木瓜細胞番木瓜細胞胡桐細胞，薰衣草細胞薄荷細胞人參細胞苦瓜細胞紅豆杉細胞毛地黃細胞羅夫木細胞金雞納細胞長春花細胞煙草細胞魚藤細胞鼠尾草細胞，鞘心花細胞色素，消炎消炎、止瀉食用色素，抗氧化疏通血管，抗氧化治療心血管疾病治療大腦和神經(jīng)系統(tǒng)疾病抗菌消炎，抗腫瘤抗瘧疾，退熱藥抗氧化、抗輻射、抗衰老消炎，肉質(zhì)嫩化治療骨質(zhì)增生，血型檢測抗病毒，香精食用香精調(diào)節(jié)免疫功能，保健治療糖尿病抗腫瘤強心藥降血壓抗瘧疾治療白血病殺蟲殺蟲消炎，抗氧化第四頁，共七十一頁，2022年，8月28日長春新堿長春堿長春花細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿治療白血病第五頁，共七十一頁，2022年，8月28日銀杏細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮、萜類化合物第六頁，共七十一頁，2022年，8月28日紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇第七頁，共七十一頁，2022年，8月28日玫瑰茄等植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)色素洛神花第八頁，共七十一頁，2022年，8月28日什么是初級和次級代謝產(chǎn)物？初級代謝產(chǎn)物是指微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的、自身生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。通過初級代謝，能使營養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)物質(zhì)、具生理活性物質(zhì)或為生長提供能量，因此初級代謝產(chǎn)物，通常都是機體生存必不可少的物質(zhì)，只要在這些物質(zhì)的合成過程的某個環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，輕則引起生長停止，重則導(dǎo)致機體發(fā)生突變或死亡，是一種基本代謝類型。次級代謝產(chǎn)物

是指生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對該生物無明顯生理功能，或并非是該生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同種類的生物所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。第九頁，共七十一頁，2022年，8月28日一植物細胞培養(yǎng)的定義植物細胞培養(yǎng)（Plantcellculture）是在離體條件下，將分離的植物細胞通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。獲得的細胞群體可以作為制備有價值代謝產(chǎn)物的原料，也可以作為基礎(chǔ)研究的材料。同時植物細胞培養(yǎng)技術(shù)也是人工種子、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等的支撐技術(shù)。第十頁，共七十一頁，2022年，8月28日什么是植物細胞培養(yǎng)?與組織培養(yǎng)的區(qū)別?

植物細胞培養(yǎng)(plantcellculture):是指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)并使其增殖，獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。

1979年國際組織培養(yǎng)協(xié)會專業(yè)術(shù)語委員會建議：

組織培養(yǎng)：從機體內(nèi)取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，在體外進行培養(yǎng)，使之生存或生長成組織。

細胞培養(yǎng)：動植物細胞在體外條件下的存活或生長，此時細胞不再形成組織。第十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日植物組織培養(yǎng)⑴培養(yǎng)對象植物的各種組織、器官⑵培養(yǎng)目的獲得所需的植物組織和再生植株；快速繁殖。細胞培養(yǎng)⑴培養(yǎng)對象各種形式的植物細胞⑵培養(yǎng)目的獲得所需的細胞和各種所需的產(chǎn)物；進行生物轉(zhuǎn)化；將外源底物轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物。與植物組織培養(yǎng)的區(qū)別第十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日

二植物細胞特點問題1：與微生物相比，植物細胞有什么特點？細菌，真菌、植物細胞都有細胞壁細菌無成形的細胞核，真菌、植物細胞有成形的細胞核。植物細胞比微生物細胞大。第十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日植物細胞直徑一般約為10-200μm，平均直徑比微生物細胞大30-100倍。植物細胞很少以單一細胞形式懸浮生長，通常以一定細胞數(shù)的非均相細胞團方式存在。植物細胞具有纖維素細胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷。與微生物細胞相比，植物細胞生長速度慢，操作周期長，分批培養(yǎng)一般需要2-3周，半連續(xù)或連續(xù)培養(yǎng)時間一般長達2-3個月。植物細胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長，因此防止污染更困難。植物細胞培養(yǎng)一般需要光照，通過光合作用合成有機物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對細胞培養(yǎng)影響較大。第十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日三植物細胞培養(yǎng)歷史20世紀50年代，泰爾克（Talecke）和尼克爾（Nickell）證實植物細胞可生長在懸浮培養(yǎng)液中。隨后，人們發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的植物細胞具有合成代謝產(chǎn)物的能力。1956年，尼克爾（Nickell）和盧荻（Routin）申請了第一個用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)化學(xué)物質(zhì)的專利。20世紀80年代后期，紫草寧等細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次獲得了產(chǎn)業(yè)化（紫草寧可以用作創(chuàng)傷、燒傷以及痔瘡的治療藥）。第十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日四植物細胞培養(yǎng)技術(shù)（一）培養(yǎng)基植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無機鹽、維生素、植物生長激素、有機酸和一些復(fù)合物質(zhì)組成。目前應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MS、B5、N6等，具體內(nèi)容參見附錄。問題2：植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成有哪些？無機鹽：大量元素N\S\P\K\Ca\Mg等、微量元素有機物：糖類、氨基酸、維生素等調(diào)節(jié)物質(zhì)：激素與微生物培養(yǎng)基相比：需要大量無機鹽；多種維生素和激素；一般采用無機氮源；一般以蔗糖為碳源。第十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日生物酶懸浮分散、離心植物組織植物細胞

（二）植物單細胞分離與初步培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)首先需要從植物樣品制備單細胞問題3：植物組織培養(yǎng)、細胞融合時單個植物細胞是如何獲得的？1.酶解法選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細胞壁物質(zhì)（纖維素、果膠、多糖）降解，從而使細胞彼此分開，這種方法稱為酶解法。經(jīng)常采用的生物酶包括：纖維素酶、果膠酶、瓊脂酶等。第十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日（1）酶解法Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞。加酶過濾、離心第十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日（2）機械法第一種方法：用刀片刮葉片撕去下表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞第十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日第二種方法：葉片研碎、離心研碎成粉加研磨介質(zhì)過濾、離心第二十頁，共七十一頁，2022年，8月28日機械法和酶解法比較機械法酶解法細胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量低；細胞易破。細胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量高；細胞不易破。第二十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日3.愈傷組織法通過培養(yǎng)植物外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并使其大量增殖，再通過機械震蕩或者酶解的方法使細胞分離從而獲得游離的細胞。擴增培養(yǎng)、液體懸浮

植物細胞

誘導(dǎo)脫分化外植體第二十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日建立懸浮細胞培養(yǎng)系第二十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日愈傷組織法第二十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日

2.單細胞培養(yǎng)技術(shù)

1）平板培養(yǎng)法

指將一定量細胞接種到或混合到一薄層固體培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)的方法。此法是Bergman(貝格曼，1960)首創(chuàng)。平板培養(yǎng)的優(yōu)點是便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察,選擇單細胞株和篩選突變體。第二十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日細胞平板培養(yǎng)概念：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，接種在1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)。主要技術(shù)要點：

單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞，因此過濾時網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。

單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×105/ml。

植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為1-2mm。待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，用石蠟或封口膜將培養(yǎng)皿封嚴以防污染，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)3周即可長出肉眼可見的細胞團。第二十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法第二十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日看護培養(yǎng)（nursingculture）用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續(xù)分裂和增殖。這塊愈傷組織被稱為看護組織。由繆爾（Muir）于1953年創(chuàng)立。具體方法：將單個細胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織之上培養(yǎng)。優(yōu)點是：簡便、成功率高。缺點是不能在顯微鏡下直接觀察。2）看護培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)法第二十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日飼養(yǎng)層培養(yǎng)（Feederlayerculture）把處理過的（如X射線處理）無分裂能力或分裂很慢的細胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。第二十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日微室培養(yǎng)

概念：人工制造一個小室，將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法，稱微室培養(yǎng)。第三十頁，共七十一頁，2022年，8月28日1滴含單細胞培養(yǎng)液周圍加石蠟油凹穴載玻片旁邊加石蠟油蓋蓋玻片蓋蓋玻片平視圖置培養(yǎng)皿中26~28℃恒溫培養(yǎng)微室培養(yǎng)要求：

微室內(nèi)不能有氣泡。

微室的厚度最好不要超過20微米，蓋玻片的厚度要在左右。

觀察時要保持溫度和培養(yǎng)時一致。第三十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日

3）液體淺層靜置培養(yǎng)法

指將一定密度的懸浮細胞放在培養(yǎng)皿中形成一淺薄層，封口靜止培養(yǎng)。該方法優(yōu)點：易于補加新鮮培養(yǎng)基，便于鏡檢。第三十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日（三）繼代培養(yǎng)1.固體培養(yǎng)平板培養(yǎng)法是經(jīng)常采用的一種固體培養(yǎng)方式，將一定量細胞接種到或混合到裝有一薄層固體培養(yǎng)基（含瓊脂Agar）的培養(yǎng)皿內(nèi)進行培養(yǎng)。類似于微生物細胞的平板培養(yǎng)，具體步驟包括：單細胞懸浮液的制備、計數(shù)、調(diào)節(jié)細胞密度、培養(yǎng)基選擇、澆平板、接種培養(yǎng)。采用液體培養(yǎng)基進行細胞培2.液體培養(yǎng)養(yǎng)。第三十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日（四）植物細胞懸浮培養(yǎng)細胞懸浮培養(yǎng)（Cellsuspensionculture）是將細胞接種于液體培養(yǎng)基中并保持良好的分散狀態(tài)的培養(yǎng)方式。植物細胞懸浮培養(yǎng)主要在搖床和生物反應(yīng)器中進行，培養(yǎng)方法與微生物類似。優(yōu)點：1.可以增加細胞與培養(yǎng)液的接觸，促進營養(yǎng)的吸收。2.保證良好的混合狀態(tài)，從而獲得良好的氣體傳遞效果。3.可以達到較高的細胞濃度，容易放大培養(yǎng)。第三十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日振蕩培養(yǎng)箱第三十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器一般所說的生物反應(yīng)器是指細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，是為細胞生長提供合適的化學(xué)與物理環(huán)境并能檢測控制細胞生長的裝置。一般都有三部分組成：反應(yīng)罐、控制系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)。問題4.與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵罐相比，植物細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器有什么特點？第三十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日植物細胞培養(yǎng)的特殊要求植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器最初大多采用微生物反應(yīng)器。由于植物細胞與微生物細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，植物細胞較微生物細胞大，對剪切力耐受性差，而且對氧的要求相對微生物要低得多，因此微生物反應(yīng)器并不完全適合于植物細胞生長與生產(chǎn)。植物細胞培養(yǎng)具有周期長、細胞抗剪切能力弱、易團聚等特點。同時，植物細胞規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，而這些天然產(chǎn)物均為細胞次生代謝物。所以，植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計，不僅要考慮有利于細胞生長，同時還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離?？傮w上講，適合植物細胞的反應(yīng)器應(yīng)該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。光照的提供：外光源、內(nèi)光源，透明材料。結(jié)構(gòu)盡量簡單。第三十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日第三十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日機械攪拌式生物反應(yīng)器（Stirredtankrioreactor）一般由罐體、攪拌槳、控溫系統(tǒng)、氣路、傳感器等組成。依靠攪拌器使液體產(chǎn)生軸向流動和徑向流動。該生物反應(yīng)器的優(yōu)點是攪拌充分，供氧能力和混合效果較好。攪拌罐中產(chǎn)生的剪切力大，容易損傷細胞，直接影響細胞的生長和代謝，特別對于次級產(chǎn)物生成影響極大。需要對攪拌罐進行改進，包括改變攪拌形式、葉輪結(jié)構(gòu)與類型、空氣分布器等，力求減少產(chǎn)生的剪切力，同時滿足供氧與混合的要求。第三十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日不同葉輪產(chǎn)生剪切力大小順序為：渦輪狀葉輪＞平葉輪＞折葉漿＞螺旋狀葉輪第四十頁，共七十一頁，2022年，8月28日Kaman等采用帶有1個雙螺旋帶狀葉輪(helicalribbonimpeller)和3個表面擋板的攪拌罐，證明適于剪切力敏感的高密度細胞培養(yǎng)。離心槳生物反應(yīng)器采用三葉螺旋槳，同時采用微孔金屬絲網(wǎng)作為空氣分布器，能提供良好的混合狀態(tài)，具有比機械攪拌槳底的剪切力。第四十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日氣升式生物反應(yīng)器(Air-liftbioreactor)由氣升室、氣降室、除氣室和底部四部分組成。培養(yǎng)液循環(huán)的動力來自于氣升室、氣降室中因含氣量不同而在底部產(chǎn)生的壓力差，因而比鼓泡型有更均一的流動形式。根據(jù)反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)與氣體分布器的位置不同可分為內(nèi)環(huán)流和外環(huán)流兩種第四十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日第四十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日鼓泡式生物反應(yīng)器(Bubblecolumnbioreactor)又稱為鼓泡塔式反應(yīng)器，是最簡單的氣動式生物反應(yīng)器。氣體分布器一般位于底部中央，氣體從底部通過噴嘴或孔盤進入反應(yīng)器。它不含轉(zhuǎn)動部分，整個系統(tǒng)密閉，易于無菌操作。不同于氣升式生物反應(yīng)器，液體在反應(yīng)器內(nèi)部呈無規(guī)律的湍流狀態(tài)。培養(yǎng)過程中沒有機械能消耗，適合于培養(yǎng)對剪切力敏感的細胞。然而對高密度及粘度較大的培養(yǎng)物，反應(yīng)器的混合效率會降低。第四十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日其它類型生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器(Rotatingdrumbioreactor)因為轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動帶動培養(yǎng)罐轉(zhuǎn)動，促進了氣體交換與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，具有懸浮系統(tǒng)均一、低剪切力、防止細胞粘附在壁上的優(yōu)點，適合于高密度植物懸浮細胞的培養(yǎng)，已用于長春花、紫草的細胞懸浮培養(yǎng)。第四十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日（五）植物細胞固定化培養(yǎng)問題5：植物細胞固定化培養(yǎng)有什么優(yōu)點？細胞固定化培養(yǎng)（Cellimmobilizationculture）是指將游離的細胞包埋在支持物內(nèi)部或表面進行培養(yǎng)的一門技術(shù)。是在20世紀70年代的酶固定化催化技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。1979年，布洛德利斯（Brodelius）首次成功利用固定化的毛地黃、長春花細胞制備次級代謝產(chǎn)物。第四十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.細胞經(jīng)包埋后使所受的剪切力損傷減小，維持了細胞的穩(wěn)定性，適合脆弱的植物細胞的培養(yǎng)，同時也利于采用傳統(tǒng)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。2.懸浮細胞培養(yǎng)體系中細胞密度比較高時會因粘度增加引起傳質(zhì)困難。固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞密度遠高于懸浮培養(yǎng)，但并不會改變培養(yǎng)液流體性質(zhì)，利于傳質(zhì)。3.大多數(shù)植物次級代謝產(chǎn)物合成在生長停止后才大量合成。采用固定化培養(yǎng)可以將細胞生長與產(chǎn)物合成分成兩個階段。與細胞懸浮培養(yǎng)相比，植物細胞固定化培養(yǎng)具有以下優(yōu)點：第四十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日4.細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產(chǎn)物的積累。5.固定化增加了細胞與細胞間的接觸，促進了細胞間信息傳遞，利于代謝產(chǎn)物的合成。6.固定化細胞可以反復(fù)使用，可以方便地進行產(chǎn)物的連續(xù)性收獲，降低了成本。第四十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.固定化方法吸附、交聯(lián)、共價結(jié)合、包埋等。（1）吸附固定法通過物理吸附、離子吸附（依靠靜電引力固著在帶有異電荷的載體上）等方法使細胞固定在載體上。（2）共價結(jié)合法細胞表面的基團（如氨基、巰基、咪唑基、酚羥基等）和固相支持物表面的基團之間形成化學(xué)共價鍵連接，從而成為固定化細胞。第四十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日A將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細胞。優(yōu)點：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械力損傷，是目前采用較多的細胞固定方法。缺點：擴散限制，并非所有細胞都能處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到內(nèi)部。第五十頁，共七十一頁，2022年，8月28日（3）包埋法A凝膠包埋w/id_XMTM4MzI3NTI0.html問題5：與前面講過的哪個內(nèi)容相似？無菌空氣入口裝有細胞和褐藻酸鈉溶液的玻璃瓶細胞和褐藻酸鈉混合液形成膠體顆粒的噴射口 隔濾板裝有氯化鈣溶液的燒瓶第五十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日微囊化（Microencapsulation）是利用天然的或者合成的高分子材料作為囊壁材料將細胞包裹成微米級的微小球囊，形成的微囊膜是親水半透膜，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分以及代謝產(chǎn)物可以通過微囊膜進行交換。第五十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日在Ca2+離子等多價陽離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和陽離子之間形成離子鍵。因海藻酸鈣不溶于水，從而在細胞表面形成凝膠。如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等螯合劑處理將Ca2+離子除去，又能使膠體溶解釋放出細胞。當海藻酸鈣微囊用多聚賴氨酸處理后，使凝膠微球表面成膜，不會再被螯合劑溶解。再用檸檬酸去除鈣離子，球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài)，細胞懸浮在微囊內(nèi)。海藻酸鹽(Alginate)—多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)微囊化第五十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日瓊脂糖(Agarose)凝膠包埋將細胞懸浮于經(jīng)過滅菌處理的瓊脂糖中，不斷攪拌，待混合物凝結(jié)后，將包埋有細胞的瓊脂糖凝塊擠進無菌的金屬網(wǎng)中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。這種方法雖然簡單，但因制得的顆粒較大、形狀不規(guī)則。第五十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.固定化細胞的活力測定染色法例如：熒光素二乙酸酯（Fluoresceindiacetate,FDA）染料能被活細胞吸收，酶解脫去乙?；惯@種染料產(chǎn)生熒光。死亡的細胞沒有這種現(xiàn)象，因此可以判定固定化后的細胞是否具有活性。呼吸強度測定采用氧電極法測定細胞的呼吸作用來表示細胞的存活率。細胞生長和分解速率的測定細胞數(shù)量或重量的增加可以作為細胞活性的指標。由于植物細胞的聚集性特點，采用濕重或干重法比較方便實用。第五十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日3.固定化細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器對于固定化的植物細胞可以：（1）采用合適的機械攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、鼓泡式生物反應(yīng)器等進行培養(yǎng)。（2）也可將細胞直接吸附或包埋在特殊設(shè)計的生物反應(yīng)器內(nèi)的介質(zhì)表面或內(nèi)部進行培養(yǎng)。第五十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日流化床生物反應(yīng)器(Fluid-bedbioreactor)通過通入液體或氣體使固定化細胞懸浮于反應(yīng)器中。傳質(zhì)效率高，但是碰撞會破壞固定化細胞。第五十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日填充床生物反應(yīng)器(Pipe-conebio-filterreactor)細胞固定在支持物的內(nèi)部或表面，細胞固定不動，流體按照一定方向從反應(yīng)器中流過實現(xiàn)混合和傳質(zhì)?？梢允谴怪钡?，也可以是水平的。一種垂直的填充床生物反應(yīng)器示意圖如圖。優(yōu)點是單位體積細胞的容量大。缺點是混合效率低、易造成傳質(zhì)困難、固定床顆?；蛑С治锼槠瑫枞后w的流動。

空氣出口培養(yǎng)液出口 培養(yǎng)液 固定有細胞 的篩網(wǎng) 包埋有細胞 的顆粒 培養(yǎng)液入口 空氣入口第五十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日涓流床生物反應(yīng)器(Tricklebedbioreactor)又稱滴流床反應(yīng)器，細胞固定在反應(yīng)器內(nèi)部，氣體從下往上流動，而液體從上往下流動，由于流量小，只能在固定化細胞表面形成涓涓細流。與填充床生物反應(yīng)器不同，固定化細胞并不被流體浸沒，空隙被大量氣流占據(jù)，因此適合好氧細胞生長。第五十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日（六）植物細胞培養(yǎng)工藝(P57)細胞培養(yǎng)的操作方式：根據(jù)細胞培養(yǎng)時營養(yǎng)成分添加方式以及培養(yǎng)液與細胞的收集方式的不同，可以有：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種操作方式。第六十頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.分批式培養(yǎng)（Batchculture）是指細胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液體積不變，不添加營養(yǎng)成分，待細胞增長和產(chǎn)物積累到適當?shù)臅r間，一次性收獲細胞、產(chǎn)物和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。問題6：分批培養(yǎng)過程中，細胞的生長一般分為那幾個階段？五個階段：延遲期（1）、對數(shù)生長期（2）、減速期（3）、平臺期（4）和衰退期（5）。第六十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日（1）延遲（適應(yīng)）期（Lagphase）是細胞適應(yīng)新環(huán)境的階段。此時細胞很少分裂，營養(yǎng)物幾乎不消耗。延遲（適應(yīng)）期時間的長短與種齡、接種量大小及營養(yǎng)物質(zhì)新舊環(huán)境差異大小有關(guān)。采用有活力的種子、適當提高接種量有利于縮短延遲（適應(yīng)）期。（2）對數(shù)生長期(Exponentialgrowthphase)該階段，由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)比較充分，細胞生長不受限制，生長旺盛，細胞濃度隨時間呈指數(shù)增長。細胞濃度的變化率與細胞濃度成正比：dX dt=μX式中：X-細胞濃度；t-時間；μ-比生長速率。

式中：X-細胞濃度；t-時間；μ-比生長速率。第六十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.303lg????在對數(shù)生長期，比生長速率達到最大比生長速率μm并保持不變。將細胞濃度變化的對數(shù)值與時間作圖得到一直線，斜率就是μm。式中：X1、X2-時間為t1、t2時間的細胞濃度；μm-最大比生長速率。細胞濃度增長一倍的時間稱為倍增時間(d)。微生物細胞的倍增時間(d)較短：細菌一般為0.25-2h；哺乳動物細胞一般為15-200h，植物細胞倍增時間跨度大，草本類一般為1-3d，木本一般為2-10d。0.693

μmln2

μm=τd=

?X2? ?X1?t2?t1μm=第六十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日典型的分批培養(yǎng)過程特點：體積不變；營養(yǎng)逐漸消耗殆盡；細胞濃度增加后維持不變，逐漸死亡第六十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日（3）減緩期(Progressivedecelerationalphase)由于細胞濃度增高、營養(yǎng)物質(zhì)消耗、有害代謝產(chǎn)物積累，細胞生長受到抑制，生長速率逐漸下降，細胞生長進入減速期。（4）平臺期(Plateauphase)由于細胞濃度增高、營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗、有害代謝產(chǎn)物大量積累，細胞生長受到嚴重抑制，生長速率下降。生成的和死亡的細胞數(shù)量大致相當，細胞生長進入靜止期，細胞濃度達到最大值。（5）衰退期(Senescencephase)由于營養(yǎng)耗盡，有害物質(zhì)大量積累，細胞開始自溶、死亡。大多數(shù)分批培養(yǎng)都在進入衰亡期