上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)特征,細(xì)胞生物學(xué)論文

上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)特征,細(xì)胞生物學(xué)論文角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞的主要組成成分，具有廣泛的生物學(xué)特性。常見的鱗狀上皮細(xì)胞有皮膚和口腔黏膜上皮細(xì)胞，當(dāng)其出現(xiàn)大面積損傷時創(chuàng)口本身不能正常愈合，只能通過組織移植來補(bǔ)償缺損的組織面。皮膚或口腔黏膜是容易接觸一些藥物或材料刺激的組織，因而討論皮膚或口腔黏膜組織對于臨床藥物和材料的反響是重要的研究課題。體外細(xì)胞檢測模型一般來自患者的原代培養(yǎng)細(xì)胞或來自腫瘤、遺傳物質(zhì)突變的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，但原代細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞有限，傳代后組織特異性也逐步喪失，且組織來源不同的原代細(xì)胞培養(yǎng)所得出的測定數(shù)據(jù)差異較大，不是毒理學(xué)研究的理想細(xì)胞；轉(zhuǎn)化細(xì)胞容易獲得并易于維持，穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好，但其具有腫瘤細(xì)胞的特性，例如生長失去控制、接觸抑制喪失、細(xì)胞外形改變、核型異常等[1],也不是毒理學(xué)研究的理想模型，因而，急需建立新的外源性化合物安全性的評價模型。人胚胎干細(xì)胞〔hu-manembryonicstemcells,hESCs〕是健康和永生的單一胚胎細(xì)胞來源的人類樣本，既可真實(shí)反映人類生物學(xué)特征[2],又可通過單一胚胎細(xì)胞無限增殖和定向分化到達(dá)樣本高度標(biāo)準(zhǔn)化[3],可能成為預(yù)測受試物細(xì)胞毒性和遺傳毒性的體外替代實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚4],為體外安全性評價提供了新的希望。將hESCs誘導(dǎo)分化為角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞當(dāng)前暫無標(biāo)準(zhǔn)化方式方法，研究發(fā)現(xiàn)通過構(gòu)成擬胚體〔embryonicbody,EB〕的方式方法獲得的角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞增殖能力過低，不利于組織發(fā)育[5];2008年，Metallo等[6]用直接誘導(dǎo)法將hESCs誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，并比擬了EB法和直接誘導(dǎo)法誘導(dǎo)hESCs5周后獲得的細(xì)胞角蛋白〔cytokeratin,CK〕14的陽性表示出率〔15%vs.87%〕,發(fā)現(xiàn)直接誘導(dǎo)法具有顯著的優(yōu)勢。人永生化口腔上皮細(xì)胞系〔humanimmortalizedoralepithelialcells,HIOECs〕是用人乳頭瘤狀病毒E6、E7開放讀碼框架轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的正?？谇簧掀ぜ?xì)胞后建立的[7],HIOECs具有與口腔黏膜上皮細(xì)胞類似的形態(tài)和生化特性，所建模型可被用于評價藥物在口腔吸收機(jī)制的研究[8].人永生化皮膚角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞HaCaT是由成人皮膚轉(zhuǎn)染猴空泡病毒40〔simianvirus,SV40〕后發(fā)生自分化的未成瘤的永生化皮膚角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞系[9].本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦通過直接誘導(dǎo)法將hESCs誘導(dǎo)分化為上皮樣細(xì)胞[10],但尚不清楚所得到的上皮樣細(xì)胞能否仍保持正常的染色體核型，其進(jìn)一步分化是趨向于發(fā)展為皮膚上皮還是口腔黏膜上皮，以及能否作為將來毒理學(xué)的檢測模型。本研究對得到的上皮樣細(xì)胞進(jìn)行了染色體核型的分析，在基因水平上討論了由hESCs誘導(dǎo)K-hESCs經(jīng)過中多能性標(biāo)志物及上皮相關(guān)標(biāo)志物的表示出變化；并以人原代牙齦上皮細(xì)胞〔humangingivalepithelialcells,HGECs〕、HIOECs和HaCaT作為對照細(xì)胞，通過實(shí)時定量熒光PCR方式方法檢測了其誘導(dǎo)末期人胚胎干細(xì)胞源角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞〔keratinocytederivedfromhu-manembryonicstemcells,K-hESCs〕與對照細(xì)胞上皮相關(guān)標(biāo)志物基因表示出的差異性；在蛋白水平上，通過免疫組織化學(xué)方式方法討論了多種上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在K-hESCs和對照細(xì)胞中的表示出差異。1材料與方式方法1.1材料研究所用明膠、Matrigel購自美國BD公司，胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基〔mTeSR1〕購自美國StemCell公司，中性蛋白酶購自德國Roche公司，CK、波形蛋白〔vimentin,VIM〕抗體購自美國SantaCruz公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)皿購自美國Corning公司，通用型二步法檢測試劑盒購自美國GBI公司，TritonX-100購自美國Amresco公司，Gimsa染液購自北京Solarbio公司；其他研究所用材料全部購自美國Invitrogen公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng)1.2.1hESCs的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系H9〔H9-hESCs〕由新加坡國立大學(xué)提供，將其培養(yǎng)于Matri-gel上，培養(yǎng)液為胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，天天換液，細(xì)胞接近匯合時用1g/L的中性蛋白酶，37℃消化5min,機(jī)械刮除，800r/min離心5min,1∶6傳代。1.2.2HGECs的原代培養(yǎng)選擇擬行阻生牙鏟除術(shù)、無口腔黏膜疾病且冠周齦組織無炎癥表現(xiàn)的患者，術(shù)前征得患者同意，術(shù)中收集鏟除牙齒上附帶的牙齦組織，采用組織塊法在無血清上皮培養(yǎng)基〔de-finedkeratinocyteserum-freemediumandsupplement,D-KSFM〕中培養(yǎng)獲得HGECs.本研究獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)〔批準(zhǔn)號：PKUSSIRB-202010055〕.1.2.3HIOECs及HaCaT培養(yǎng)分別使用D-KSFM和含10%〔體積分?jǐn)?shù)〕血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HIOECs與HaCaT,傳代時均用胰酶37℃分別消化5min和1min,用含血清培養(yǎng)基中和，前者600r/min離心10min,后者1000r/min離心5min,1∶3傳代。1.3誘導(dǎo)hESCs分化為K-hESCs.H9-hESCs常規(guī)傳代后第2天，將hESCs完全培養(yǎng)基換成上皮分化誘導(dǎo)液〔體積分?jǐn)?shù)98%的DMEM/F12培養(yǎng)基，含有1N2補(bǔ)充成分、1mol/L維甲酸、25g/L骨構(gòu)成蛋白4〕,天天換液，連續(xù)誘導(dǎo)7天，第7天傳代。傳代時用1g/L的中性蛋白酶，37℃消化5min,機(jī)械刮除，D-KSFM重懸，200g離心4min,D-KSFM重懸輕吹勻，1∶3傳代至明膠鋪被的板子上，晃勻，隔天換液。P1代第10天時K-hESCs用胰酶37℃消化1min,含血清培養(yǎng)基中和，200g離心4min,D-KSFM重懸輕吹勻，1∶1傳代至明膠鋪被的板子上，晃勻，隔天換液。1.4Real-timePCR檢測方式方法。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,取2LRNA檢測純度和濃度，20L體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以GAPDH為內(nèi)參，PCR引物序列見表1,20L體系在7500實(shí)時PCR檢測儀〔美國ABI公司〕上行定量PCR檢測。1.5免疫細(xì)胞化學(xué)檢測將細(xì)胞均勻接種在無菌的載玻片上，待貼壁生長至適宜密度后，95%〔體積分?jǐn)?shù)〕乙醇固定30min,PBS沖洗，0.1%〔體積分?jǐn)?shù)〕Triton-X100室溫處理15min,PBS沖洗；10%〔質(zhì)量分?jǐn)?shù)〕H2O2室溫處理10min,PBS沖洗；滴加一抗，4℃過夜。第2天滴加二抗試劑，室溫孵育30min,PBS沖洗；DAB室溫顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。SOX2[SRY-relatedhigh-mobility-group〔HMG〕-boxprotein-2]、OCT4〔octamer-bindingtranscriptionfactor-4〕、CK1、P63以核內(nèi)有著色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，余以細(xì)胞漿內(nèi)有著色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。采用半定量分析斷定陽性表示出強(qiáng)度，無著色顆?；蜿栃约?xì)胞數(shù)少于5%為陰性〔-〕,著色且著色總面積在5%~10%為弱陽性〔+〕,著色總面積在11%-50%為中等陽性〔++〕,著色總面積大于50%者為強(qiáng)陽性〔+++〕.1.6二倍體檢測生長狀態(tài)良好的K-hESCs,參加0.012mg/L秋水仙素培養(yǎng)8h,收集細(xì)胞，參加預(yù)溫至37℃的0.075mmol/LKCl溶液5mL,置37℃15min,用3∶1甲醇冰醋酸固定3次，滴到預(yù)冷的載玻片上，70℃3h烤片。Gimsa染色10min,水洗，顯微鏡下觀察染色體并進(jìn)行核型分析。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用多組間比擬的單因素方差分析、成組設(shè)計(jì)多個樣本比擬的秩和檢驗(yàn)〔Kruskal-Wallis法〕及完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)分析方式方法，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)和鑒定2.1.1細(xì)胞形態(tài)原代培養(yǎng)的HGECs呈鋪路石樣嚴(yán)密排列的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞大小一致，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核清楚明晰〔圖1A〕;HIOECs為分散生長的多角形上皮樣細(xì)胞，細(xì)胞大小較一致，生長較慢〔圖1B〕;HaCaT細(xì)胞呈克隆狀聚集生長，細(xì)胞為多角形，長滿后也為鋪路石樣，生長較快〔圖1C〕.未分化的H9-hESCs在Matrigel上細(xì)胞成團(tuán)克隆狀生長，飽滿厚實(shí)，排列嚴(yán)密，形似鳥巢，細(xì)胞之間界線不清，胞體體積小，核大，有1個或幾個核仁，細(xì)胞增殖并保持未分化狀態(tài)〔圖1D〕.用上皮分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的P1代細(xì)胞以組織塊貼壁細(xì)胞為中心呈現(xiàn)克隆狀生長，細(xì)胞呈鋪路石狀，排列嚴(yán)密；以小圓形、多角形為主的上皮樣細(xì)胞，克隆的細(xì)胞較小且排列較嚴(yán)密，克隆周圍的細(xì)胞較大且大小較一致，細(xì)胞核清楚明晰〔圖1E〕,類似于HGECs,我們將其稱為人胚胎干細(xì)胞源角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞K-hESCs.從P1代第8天開場，克隆周圍的細(xì)胞開場收縮卷邊，細(xì)胞變大、變長且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡和顆粒，細(xì)胞間連接變稀疏，到第15天左右大多數(shù)細(xì)胞凋亡。P2代細(xì)胞貼壁量較少，分散生長，細(xì)胞增殖速度變慢，細(xì)胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為胞體變大、核模糊、出現(xiàn)空泡、死亡脫落〔圖1F〕.2.1.2細(xì)胞鑒定細(xì)胞免疫化學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的HGECs,CK表示出陽性〔圖2A〕,VIM表示出陰性〔圖2B〕;H9-hESCs的SOX2及OCT4表示出陽性〔圖2C和2D〕.9種上皮相關(guān)標(biāo)志物在hESCs、K-hESCs〔P0代及P1代〕和HaCaT中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見表2和圖3.2.2Real-timePCR結(jié)果在H9-hESCs誘導(dǎo)為K-hESCs的經(jīng)過中，胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)志物OCT4和NANOG基因的表示出直線下降，角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞干性標(biāo)志物CK18和p63基因的表示出整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，而CK14基因的表示出在P0代略微下降，在P1代呈不斷上升趨勢。H9-hESCs與P1代第7天時的K-hESCs相比，OCT4、NANOG、CK18、p63、CK14的表示出差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔配對t檢驗(yàn)，P分別為0.016、0.023、0.011、0.030、0.013,圖4〕.比擬角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞標(biāo)志物p63、CK18、CK14在K-hESCs〔P1代第7天時〕、HGECs、HIOECs及HaCaT中的基因表示出差異。由圖5可見，與K-hESCs相比，基因p63在HGECs和HIOECs中的表示出差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.245、P=0.439〕,但基因p63在HaCaT中的表示出遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于K-hESCs〔P=0.036〕;CK18在K-hESCs中表示出最高，但與HGECs、HIOECs、HaCaT相比，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F=0.575,P=0.640〕;CK14在HGECs中表示出最高，與K-hESCs相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.001,且其在HIOECs和HaCaT中的表示出與K-hESCs相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.001、P0.001〕.2.3二倍體檢測K-hESCs染色體核型為正常女性〔46,XX〕,無構(gòu)造異?！矆D6〕.3討論2006年誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞〔inducedpluripotentstemcells,iPS〕的出現(xiàn)被以為有宏大的潛在應(yīng)用價值，在建立體外病理模型方面有一定的方便性，但與胚胎干細(xì)胞相比，iPS要多經(jīng)歷分離、純化、擴(kuò)增、誘導(dǎo)去分化、挑選、建庫、擴(kuò)增等步驟才能誘導(dǎo)定向分化，這一體外經(jīng)過復(fù)雜而漫長，細(xì)胞傳代數(shù)過高對細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、表觀遺傳特性和生物學(xué)特性都構(gòu)成了極大的不穩(wěn)定，iPS細(xì)胞即被證明帶有本身的表觀遺傳印記和端粒異常，有數(shù)百個基因存在異常表示出[11-13].本文旨在建立健康安全評價檢測模型，對細(xì)胞本身的正常性要求較高，因而，以為胚胎干細(xì)胞較iPS更具優(yōu)勢。上皮細(xì)胞主要包括上皮干細(xì)胞及其子代短暫擴(kuò)大細(xì)胞、終末分化細(xì)胞。華而不實(shí)干細(xì)胞存在于上皮基底層，有無限的增殖潛能，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)；短暫擴(kuò)大細(xì)胞具有低的自我更新能力和高的終末分化可能性，短暫擴(kuò)大細(xì)胞僅分裂增殖3~5次即到終末分化狀態(tài)。處于不同分化階段的細(xì)胞具有不同的表型。1整合素〔integrin-1〕的表示出是維持角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞未分化狀態(tài)所需要的，1整合素能夠區(qū)分角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞干細(xì)胞和短暫擴(kuò)大細(xì)胞。Michel等[14]對CK19和1整合素進(jìn)行研究后提出，細(xì)胞經(jīng)染色后，若CK19和1整合素同時呈陽性且具有未完全分化狀態(tài)特征的干細(xì)胞，則可視為角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞的祖細(xì)胞。P63主要與上皮細(xì)胞的分化和增殖有關(guān)，之前被以為是干細(xì)胞標(biāo)志物，但近期的研究表示清楚，P63在體內(nèi)不僅表示出于基底層而且還表示出于基底上層，即表示出于正在增殖的和有增殖能力的細(xì)胞[15],因而推斷P63更應(yīng)該是短暫擴(kuò)大細(xì)胞而非干細(xì)胞標(biāo)志物[16-18].CK18在細(xì)胞進(jìn)入分化和復(fù)層前，持續(xù)地在單層細(xì)胞中表示出，有些細(xì)胞CK18的表示出下調(diào)被CK14取代[19].CK14早期表示出時可作為復(fù)層細(xì)胞的基底細(xì)胞標(biāo)志物表示出于單層細(xì)胞上[19].CK10通常表示出于角化復(fù)層鱗狀上皮的基底上層，即終末分化時將要角化的細(xì)胞，為角化標(biāo)志，其表示出與上皮細(xì)胞角化狀態(tài)密切相關(guān)。低相對分子質(zhì)量CK〔AE1〕對腺上皮表示出敏感性較高，高相對分子質(zhì)量CK〔AE3〕對鱗狀上皮表示出敏感性較高。本研究誘導(dǎo)hESCs分化而成的K-hESCs呈現(xiàn)正常的46條女性染色體核型。Real-timePCR檢測結(jié)果表示清楚，在基因水平上，單層上皮干細(xì)胞標(biāo)志物CK18、短暫擴(kuò)大細(xì)胞標(biāo)志物p63的表示出呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，復(fù)層上皮基底層標(biāo)志物CK14呈現(xiàn)先略微降低后上升的趨勢，提示K-hESCs經(jīng)歷了由hESCs向單層上皮干細(xì)胞分化繼而轉(zhuǎn)向復(fù)層上皮終末分化發(fā)展的趨勢。免疫組織化學(xué)染色顯示，K-hESCs在分化經(jīng)過中，CK18、P63表示出先上升后下降，CK14表示出增加，與基因水平一致；除此之外，單層細(xì)胞表皮干細(xì)胞標(biāo)志物CK19、1整合素的表示出增高，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物〔上皮干細(xì)胞標(biāo)志物〕波形蛋白〔VIM〕及角化標(biāo)志物CK1、CK10的表示出增高，能夠推斷P1代第7天時K-hESCs正處于角化細(xì)胞祖細(xì)胞階段，其鱗狀上皮標(biāo)志物AE3的免疫組織化學(xué)表示出高于腺上皮的標(biāo)志物AE1的表示出，提示所得角化細(xì)胞祖細(xì)胞更偏向于鱗狀上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞。Real-timePCR檢測結(jié)果顯示，P1代第7天時K-hESCs上皮干細(xì)胞標(biāo)志物CK18的基因表示出與HGECs、HIOECs、HaCaT相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕,而復(fù)層上皮細(xì)胞基底層標(biāo)志物CK14的表示出顯著低于HGECs、HIOECs、HaCaT〔P0.01〕,提示P1代第7天時K-hESCs處于未完全成熟階段。P1代第7天時K-hESCs的p63表示出與HGECs及HIOECs差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕,而與HaCaT有明顯差異〔P0.01〕,提示P1代第7天時K-hESCs可能更偏向于將來分化為口腔黏膜上皮。綜上，本研究可在體外有效誘導(dǎo)hESCs分化為上皮樣角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞K-hESCs,誘導(dǎo)所得P1代第7天時的K-hESCs具有正常核型，類似于單層鱗狀上皮干細(xì)胞向終末分化初始階段的角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞，該階段細(xì)胞由上皮干細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)被激活，處于分化初始高增殖活力階段，有望作為口腔臨床藥物的毒理檢測模型。以下為參考文獻(xiàn)[1]RolletschekA,BlyszczukP,WobusAM.Embryonicstemcell-derivedcardiac,neuronalandpancreaticcellsasmodelsystemstostudytoxicologicaleffects[J].ToxicolLett,2004,149〔1-3〕:361-369.[2]AmitM,CarpenterMK,InokumaMS,etal.Clonallyderivedhu-manembryonicstemcelllinesmaintainpluripotencyandprolifera-tivepotentialforprolongedperiodsofculture