熒光分析法英文版termpaper

單分子追蹤在生物體系中的研究應(yīng)為了深入理解生物體系中分子的相互作用過(guò)程與分子動(dòng)態(tài)，單分子動(dòng)態(tài)單分子檢測(cè)，動(dòng)態(tài)追蹤，熒光，活細(xì)胞單分子追蹤引單分子追蹤儀器方法概探針以及高選擇性的標(biāo)記方法；2.高空間分辨的儀器方法，如熒光共聚焦顯微STED顯微術(shù)等；3.根據(jù)研究對(duì)象與體系設(shè)計(jì)合適的分子檢測(cè)的精準(zhǔn)性與靈敏度有著顯著的提高，其中受激輻射耗盡（StimulatedEmissionDepletionSTED）顯微術(shù)也可以應(yīng)用在單分子動(dòng)態(tài)檢測(cè)中。STED技術(shù)于1994年由Stephen提出，該技術(shù)利用處于激發(fā)態(tài)的熒光分子與特定波長(zhǎng)單分子追蹤生物分子的應(yīng)用實(shí)異性的標(biāo)記方法[5]、利用具有各向異性的探針?lè)肿觿?dòng)態(tài)[6,7]以及通過(guò)熒光能量轉(zhuǎn)移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET）監(jiān)測(cè)特定分子的構(gòu)象變化[8,9]Groves課題利用貴金屬納米器件的表面局域等離子耦合效應(yīng)對(duì)熒光探針?lè)肿犹结樂(lè)肿拥墓庾V信號(hào)都具有很好的增強(qiáng)作用對(duì)膜表面兩個(gè)相互作用的蛋白分子進(jìn)行運(yùn)動(dòng)軌跡追蹤[4]。作者利用通過(guò)膠體蝕刻法和金屬沉降法了尺端具有很強(qiáng)的表面局域等離子耦合的作用使得作者所采用的熒光分子的熒棄了傳統(tǒng)的直接對(duì)靶分子在成像區(qū)域移動(dòng)路徑全程的方法轉(zhuǎn)而記錄了標(biāo)記有的靶分子在經(jīng)過(guò)納米天線區(qū)時(shí)光譜信號(hào)突然增強(qiáng)的瞬間根據(jù)時(shí)間序列排追蹤方法應(yīng)用于對(duì)兩種在細(xì)胞膜表面發(fā)生相互作用的蛋白——SOS蛋白與Ras配體蛋白的膜表面移動(dòng)性作為研究對(duì)象。SOSRas配體蛋白的結(jié)合促進(jìn)Ras蛋白釋放ADP、結(jié)合ATP，同時(shí)激活下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，該反應(yīng)過(guò)程Pavone組同樣對(duì)細(xì)胞膜表面蛋白的運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行的探究[5]。Pavone組的工作STED顯微鏡，實(shí)現(xiàn)光學(xué)空間超分辨，并成功地利用STED顯微鏡觀察細(xì)胞膜上膜脂分子被脂筏捕獲的過(guò)程[10]。早在1972年細(xì)胞膜流動(dòng)鑲嵌模型認(rèn)為細(xì)胞膜由許多動(dòng)態(tài)微區(qū)組成[11]，脂筏即是細(xì)胞膜上富含膽固醇與鞘脂分子、結(jié)構(gòu)較為固定、大小20nm-100nm之間的膜上微區(qū)[12,13]。脂筏的存在在先前的研究中已經(jīng)通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法側(cè)面AFMSEM、TEM等儀器方法盡管具有很高的分辨率，卻無(wú)法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像。相比熒光共聚焦顯微鏡，STED能夠顯著地減小聚焦光斑的大小，從而突破光學(xué)衍射分辨極限組實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜單分子追蹤的方法與傳統(tǒng)的路徑描繪追蹤方法思路不同，該工作直接定位一個(gè)聚焦光斑，記錄標(biāo)記了熒光的研究對(duì)象：磷脂酰乙醇胺SM則會(huì)被脂筏捕獲，導(dǎo)致擴(kuò)散速度顯著減慢，二者在運(yùn)動(dòng)模式上即會(huì)時(shí)，PESM分子的擴(kuò)散模式基本無(wú)法區(qū)別，均只能擬合為但運(yùn)動(dòng)模式；STED30nm，此時(shí)可以明顯辨別PESM則同時(shí)具有極快擴(kuò)散和緩慢擴(kuò)散FCSSTEDSMSM的受困與脂筏有關(guān)，作者加入膽固醇氧化酶以破壞細(xì)胞膜脂筏的正常形成，發(fā)現(xiàn)該情況下受困運(yùn)動(dòng)SM分子所占比例與擴(kuò)散時(shí)間均減60%、10ms15%、4ms，說(shuō)明膽固醇減少后，細(xì)胞膜表面的脂筏SMSM的受困運(yùn)動(dòng)與脂筏形SM擴(kuò)散時(shí)間與光斑面積大小的關(guān)SM的擴(kuò)散速度減小并非由于形成大分子復(fù)合物STED顯微鏡，同時(shí)也通過(guò)完備且恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)處理方式輔助確證了實(shí)驗(yàn)結(jié)論的可靠性[10]個(gè)不同的吸收波長(zhǎng)，在微分相差（DIC）顯微鏡下，使用對(duì)應(yīng)金納米棒兩個(gè)根據(jù)顯微鏡下金納米棒光斑亮暗程度，可以反推其實(shí)際的角度[7]。Fang課題組地將金納米棒限制在一個(gè)與其長(zhǎng)度接近的囊泡內(nèi)后進(jìn)入活細(xì)胞通過(guò)多共價(jià)固定在微管蛋白上，確保金納米棒的旋轉(zhuǎn)僅與微管的旋轉(zhuǎn)相關(guān)；之后在DIC顯總結(jié)與展生化分析領(lǐng)域研究的重點(diǎn)不僅實(shí)現(xiàn)單分子追蹤的實(shí)驗(yàn)具有多樣性與2.景噪音更低的儀器方法；3.在更為復(fù)雜的生物體系如活細(xì)胞組織甚至直接參考文Shotton,D.M.,Confocalscanningopticalmicroscopyanditsapplicationsforbiologicalspecimens.JournalofCellScience,1989.94(2):p.175-206.Ruckstuhl,T.,M.Rankl,andS.Seeger.ConfocalTIRFmicroscopyofsinglemolecules.inProceedingsofSPIE.2003.,S.W.andJ.Wiann,Breakingthediffractionresolutionlimitbystimulatedemission:stimulated-emission-depletionfluorescencemicroscopy.Opticsletters,1994.19(11):p.780-782.Lohmu?ller,T.,etal.,Singlemoleculetrackingonsupportedmembraneswitharraysofopticalnanoantennas.Nanoletters,2012.12(3):p.1717-1721.Calamai,M.andF.S.Pavone,Singlemoleculetrackingysisrevealsthatthesurfacemobilityofamyloidoligomersisdrivenbytheirconformationalstructure.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2011.133(31):p.12001-Wang,G.,etal.,Resolvingrotationalmotionsofnano-objectsinengineeredenvironmentsandlivecellswithgoldnanorodsanddifferentialinterferencecontrastmicroscopy.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2010.p.16417-Ha,J.W.,etal.,Differentialinterferencecontrastpolarizationanisotropyfortrackingrotationaldynamicsofgoldnanorods.ChemicalCommunications,2011.47(27):p.7743-7745.Hohng,S.,etal.,izinginformationcontentofsingle-moleculeFRETexperiments:multi-colorFRETandFRETcombinedwithortorque.ChemicalSocietyReviews,2014.Deindl,S.,etal.,ISWIRemodelersSlideNucleosomeswithCoordinatedMulti-Base-PairEntryStepsandSingle-Base-PairExitSteps.Cell,2013.152(3):p.Eggeling,C.,etal.,Directobservationofthenanoscaledynamicsofmembranelipidsinalivingcell.Nature,2009.457(7233):p.1159-1162.Singer,S.J.andG.L.Nicolson,Thefluidmosaicmodelofthestructureofcellmembranes.Science,1972.175(23):p.720-731.Brown,D.A.,Seeingisbelieving:visualizationofraftsinmodelmembranes.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2001.98(19):p.10517-Kusumi,A