第五課沉淀法生物工程下游技術

第五課沉淀法生物工程下游技術第一頁，共五十五頁，2022年，8月28日生物分離過程的一般流程原料液細胞分離(離心，過濾)細胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(沉淀/吸附/萃取)純化(層析)脫鹽(凝膠過濾)濃縮(超濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復性第二頁，共五十五頁，2022年，8月28日沉淀法的目的：通過沉淀達到濃縮的目的,從而降低了后續(xù)的生產(chǎn)費用和簡化了后續(xù)的生產(chǎn)工藝；沉淀方法可有選擇地沉淀所需成分或有選擇地沉淀雜質(zhì)，起到初步分離的作用；將蛋白質(zhì)由液態(tài)變成固態(tài)，避免了蛋白質(zhì)的降解，提高了其穩(wěn)定性；第三頁，共五十五頁，2022年，8月28日對于小分子生化物質(zhì)常采用等電點沉淀或形成復鹽沉淀。

如抗生素生產(chǎn)中，四環(huán)素可用等電點或尿素復鹽沉淀法，鏈霉素與苯甲胺縮合形成希夫堿沉淀，并在酸性條件下分解以制得成品。對于大分子生化物質(zhì)常采用鹽析、有機溶劑、等電點及親和沉淀方法。沉淀法的應用第四頁，共五十五頁，2022年，8月28日沉淀法的分類根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1）鹽析法；（2）等電點沉淀法；（3）有機溶劑沉淀法；（4）親和沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質(zhì)沉淀法；（6）復合鹽沉淀法等；（7）選擇性沉淀法。第五頁，共五十五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的溶解特性在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構的外表面。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成。第六頁，共五十五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域第七頁，共五十五頁，2022年，8月28日防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障⑴蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydrationshell)，⑵蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)水化層的厚度和δ電位與溶液性質(zhì)密切相關，如溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強度。第八頁，共五十五頁，2022年，8月28日鹽析法當中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象(salt-in)—低鹽濃度下，增加蛋白質(zhì)分子間靜電斥力，隨著中性鹽離子強度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大。（2）“鹽析”現(xiàn)象(salt-out)—高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降。

第九頁，共五十五頁，2022年，8月28日鹽析法原理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集（2）破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域（3）中和電荷，減少靜電斥力第十頁，共五十五頁，2022年，8月28日第十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質(zhì)的溶解度，g/L;I－離子強度，

I=1/2∑mizi2

mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數(shù)，圖中截距Ks—鹽析常數(shù)，圖中直線斜率Cohn經(jīng)驗式

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關系第十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日鹽析操作1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況，工業(yè)上常采用這種方法。2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性并且緩慢，鹽析效果好，故多用于結(jié)晶。第十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日鹽析作用要強需有較大的溶解度鹽溶液密度不高鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟例如：鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉

硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑。鹽析用鹽的選擇第十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日一般的規(guī)律為：半徑小的高價陰離子的鹽析作用較強。例如：陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+＞Mg2+

陰離子對蛋白質(zhì)溶解度的影響大于陽離子。第十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日1、鹽濃度）鹽濃度在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。

每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。影響鹽析效果的因素第十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日鹽析用鹽量的確定-飽和度：目標蛋白質(zhì)在鹽析沉淀操作之前，所需的中性鹽的濃度可通過實驗確定。對多數(shù)蛋白質(zhì)，當達到85%飽和度時，溶解度都小于0.lmg／L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。第十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日分段鹽析(fractionalsaltingout)硫酸銨的飽和度/%沉淀的蛋白質(zhì)硫酸銨的飽和度/%沉淀的蛋白質(zhì)20纖維蛋白質(zhì)>50白蛋白28～33優(yōu)球蛋白80肌紅蛋白33～50擬球蛋白可在較低飽和度下先除去雜蛋白，然后在較高的飽和度下，沉淀目標蛋白質(zhì)，稱為分段鹽析。分段鹽析時，可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，使共沉淀作用減至最低限度。表1血漿蛋白的分段鹽析結(jié)果第十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日第十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日2、蛋白質(zhì)種類和濃度組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，也越易沉淀。不同濃度的同種蛋白質(zhì)溶液要產(chǎn)生沉淀所要求的臨界鹽濃度不同。蛋白質(zhì)濃度大時，用鹽少，沉淀作用強，蛋白質(zhì)溶解損失小。

一般常將蛋白質(zhì)的含量控制在2～3%為宜。影響鹽析效果的因素第二十頁，共五十五頁，2022年，8月28日對起始濃度為30g/L的碳氧肌紅蛋白溶液，目標蛋白在硫酸銨飽和度為58-65％之間沉淀出來；當稀釋10倍時，飽和度達到66%時才開始沉淀，而相應的沉淀范圍為66-73%飽和度。第二十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日硫酸銨鹽析過程

目標蛋白的最適飽和度是多少？204060800100總蛋白目標蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度第二十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日3、pH值為提高鹽析效率，多將溶液pH值調(diào)到目標蛋白的等電點處。在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實際情況調(diào)整溶液pH值，以達到最好的鹽析效果。

影響鹽析效果的因素第二十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日在進行鹽折時，必須控制pH圖中直線都相互平行pH值第二十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日鹽析影響因素：4、溫度的影響在高鹽濃度下，大部分蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，鹽析可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。第二十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日鹽析法特點成本低，操作簡單、安全；在中性溫和的環(huán)境中，不會引起蛋白質(zhì)變性；鹽析后要透析或超濾去鹽；只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。第二十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日等電點沉淀法等電點沉淀：在低離子強度下，調(diào)pH至等電點，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀。

pH=pI第二十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日等電點沉淀法注意事項本法適用于疏水性較強的蛋白質(zhì)；

例如：酪蛋白在等電點時能形成粗大的凝聚物。但對一些親水性強的蛋白質(zhì)。如明膠，則在低離子強度的溶液中，調(diào)pH在等電點并不產(chǎn)生沉淀。蛋白質(zhì)的等電點易受鹽離子的影響發(fā)生變化；

自然界中，蛋白質(zhì)較易結(jié)合陰離子，使等電點向酸側(cè)移動。

低離子強度下，pH約等于等電點。第二十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日在調(diào)節(jié)等電點時，要注意防止酶的失活或蛋白變性。一般使用可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。蛋白質(zhì)在等電點附近鹽溶作用明顯，必須控制溶液較高的離子強度。等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，通常與其他沉淀方法結(jié)合使用；第二十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日定義：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。優(yōu)點：1）分辨能力比鹽析法高；2）沉淀不用脫鹽；3）離心收集較為容易；4）溶劑沸點較低，除去回收方便。缺點：1）容易引起變性失活；2）操作要求在低溫下進行；3）有機溶劑易揮發(fā)，需有防護。

有機溶劑沉淀法第三十頁，共五十五頁，2022年，8月28日有機溶劑沉淀法機理第三十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日有機溶劑沉淀法原理

A降低溶劑介電常數(shù)B破壞水化膜C相反力第三十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日表2一些有機溶劑的介電常數(shù)

溶劑介電常數(shù)溶劑介電常數(shù)水802.5M尿素8420%乙醇705M尿素9140%乙醇60丙酮2260%乙醇48甲醇33100%乙醇24丙醇232.5M甘氨酸137第三十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日常用的有機溶劑水溶性要好介電常數(shù)要小致變性作用要小毒性要小、揮發(fā)性適中容易獲取

常用的有機溶劑：乙醇、甲醇和丙酮

第三十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日

1、溫度

使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行，有機溶劑要預冷，并緩緩加入伴隨不斷攪拌，一是防止溶液局部升溫，二是為了防止局部過濃引起變性作用和分辨率下降。溫度還會影響有機溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力。

大多數(shù)蛋白質(zhì)在乙醇-水體系中溶解度隨溫度降低而減少，低溫對提高收率也是有利的。

有機溶劑沉淀法的影響因素第三十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日2、pH值：許多蛋白質(zhì)在等電點附近有較好的沉淀效果。

3、樣品濃度：樣品較稀時，將增加有機溶劑投入量，降低了樣品的回收率；樣品太濃，會增加共沉作用。一般認為蛋白質(zhì)的初濃度以0.5～2％為好，粘多糖則以1～2％較合適。

4、中性鹽濃度：較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。

一般中性鹽濃度以0.01～0.05mol/L為好，常用的中性鹽為氯化鈉等。有機溶劑沉淀法的影響因素第三十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日例：

調(diào)pH4.2上清液胰島素粗品溶液

30%丙酮沉淀（雜蛋白）上清液調(diào)pH6.0上清液Zn2+

胰島素鋅鹽↓第三十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日

舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶（米曲霉）菌體+水過濾水抽提清液

加乙醇（70%）攪拌α-淀粉酶↓

*pH影響

收率酶活

6.5pH

*

適宜的pH5.6~6.0

*

溫度影響

酶活

收率

1020T℃

*

適宜的溫度10~20℃

第三十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日水溶性非離子型聚合物機理：與有機溶劑相似，破壞蛋白質(zhì)的水化膜。常用非離子性聚合物：聚乙二醇（PEG）：是一種水溶性的高分子聚合物，分子量4,000以上的PEG可以用來沉淀蛋白質(zhì)。

還有葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯等。優(yōu)缺點：1.可在室溫下進行2.沉淀顆粒大，易于收集3.能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)4.PEG難去除用聚乙二醇等非離子性聚合物一般用來沉淀核酸（如質(zhì)粒）和酶。第三十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日多聚電解質(zhì)沉淀

機理：架橋與靜電，與絮凝劑類似。離子型多糖聚合物，酸性多糖、羧甲基纖維素、海藻酸鈉。合成的離子聚合物：聚丙烯酸聚苯乙烯季胺鹽聚甲基丙烯酸聚乙烯亞胺第四十頁，共五十五頁，2022年，8月28日此類沉析劑有以下三種：（1）高價金屬鹽：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+

與酸性基團結(jié)合；（2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質(zhì)等，與堿性基 團結(jié)合；（3）無機復合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等優(yōu)點：以上鹽類復合物的溶解度很低，極容易沉淀析出。缺點：容易導致活性蛋白的不可逆變性，需采用較溫和的條件。成鹽類復合物沉淀第四十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日１）金屬離子沉淀金屬離子的沉淀作用是由于它們能與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位（如羧基、氨基、咪唑基和巰基）起反應造成的。

例如Zn2+易與組氨酸殘基中咪唑基結(jié)合，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。第四十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強烈結(jié)合的一些金屬離子，如：Mn2+、Fe2+

、Ｃo2+、Ni2+

、Ｃu2+、Zn2+、

Cd2+;②能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的一些金屬離子，如：Ca2+

、Ba2+、Mg2+

、Pb2+;③能巰基化合物強烈結(jié)合的一些金屬離子，如：Ｈg2+

、Ag2+

、Pb2+。第四十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開。第四十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日分離核酸沉淀劑：酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉等目的：使核酸和蛋白質(zhì)分離，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸則存在于水溶液中。例如：在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振蕩一段時間、使蛋白質(zhì)在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，而蛋白質(zhì)在苯酚層中形成沉淀而被除去。第四十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日分離多糖沉淀劑：CTAB(十六烷基三甲基季銨鹽溴化物)CPC（十六烷基氯化吡啶）原理：季銨基團上的陽離子與多糖上的陰離子形成形成季銨絡合物，降低離子強度，絡合物析出，但當離子強度增加到一定范圍時，絡合物解離，最后溶解。第四十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日沉淀劑：三氯乙酸例如用2.5%三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽酶或細胞色素c粗提取液，均可除去大量雜蛋白，而對所提取的酶活力沒有影響。但使用前，必須對酶的酸堿穩(wěn)定性有足夠了解，使用時一般應注意環(huán)境條件溫和（如低溫段時間）分離蛋白質(zhì)第四十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日各種沉淀方法應用范圍鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化，有時也用于蛋白質(zhì)沉淀。等電點沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀。但單獨應用較少，多與其它方法結(jié)合使用。非離子聚合物沉淀法：用于分離生物大分子。生成鹽類復合物沉淀：多用于小分子物質(zhì)的沉淀。選擇性沉淀：多用于除去某些不耐熱的和在一定條件下易變性的雜蛋白。第四十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日親和沉淀

affinityprecipitation

原理：是一種將生物專一性識別與沉淀分離相結(jié)合的分離純化技術。

可逆性溶解聚合物在溶液中和目標分子專一性結(jié)合后，在一定條件下形成可逆性沉淀，從而使目標分子形成沉淀從固相分離出來。第四十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日可逆性溶解聚合物（solubleandinsolublepolymers，SIS）SIS上的功能基團可以直接和蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生親和沉淀，有時也需要將親和配基結(jié)合在SIS上。在物理條件（如pH值、離子強度、溫度等）改變時，待分離的生物分子和SIS發(fā)生可逆性沉淀。第五十頁，共五十五頁，2022年，8月28日SIS的種類pH值敏感型SIS：

聚合物的溶解性與自身所帶電荷多少相關，當它的凈電荷減少時，自身溶解度降低而沉淀。天然可逆性聚合物：脫乙酰殼聚糖（pH<6時可溶）、藻酸鹽；合成可逆性聚合物：甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的聚合物（EudragitS-100在4.5<pH<5.5時沉淀），異丁烯酸-異丁烯酸甲酯的共聚物等。第五十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日熱誘導型:改變溫度可以改變其溶解度。

其機理是SIS上的一部分功能基團與被分離的生物分子發(fā)生特異性結(jié)合，另一部分功能基團與水分子之間氫鍵，溫度升高氫鍵減