琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制

琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制制作人：萬倩吳雪李建勛張沛露范鎏問題：琥珀酸脫氫酶是哪個代謝途徑中的酶，該酶位于細胞的什么部位？催化什么化學反響？實驗方案是如何設計檢查該酶的活性狀況？何為競爭性抑制？本次試驗中選擇的抑制劑是什么？如何設計實驗方案檢測該酶被抑制的程度？實驗目的：1學習動物的處死與組織勻漿的方法23學習離心機的使用方法進一步理解酶的競爭性抑制原理離心別離的原理：將處于懸浮狀態(tài)的細胞，細胞器，病毒和生物大分子等稱為“顆粒〞，每個顆粒都有一定大小，形狀，密度和質(zhì)量。當離心機轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和方向有關。實驗原理：競爭性抑制是指分子結(jié)構與底物相似的抑制劑可與底物競爭性結(jié)合酶的活性中心，抑制酶的活性。競爭性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及于底物的相比照例。草酸與琥珀酸分子結(jié)構相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。在體內(nèi)琥珀酸脫下的2H經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，最后與氧結(jié)合生成水，并釋放能量。在體外那么可用甲稀蘭作為受H體，甲稀蘭接受琥珀酸脫下的2H而被復原為甲白，由藍色變?yōu)闊o色。在甲稀蘭含量一定的條件下，藍色消退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活性，因此，可以依據(jù)藍色消退的時間來判斷該酶活性被抑制的程度。琥珀酸在琥珀酸脫氫酶作用下脫氫生成延胡索酸，F(xiàn)AD接受兩個氫原子生成FADH2，然后再將氫傳遞給CoQ，生成CoQH2，此后的傳遞和NADH氧化呼吸鏈相同

注：器材：試劑：小白鼠，研缽，手術剪，手術鑷子，2ml移液管，10ml離心管，低速離心機pH7.4磷酸緩沖液0.25%琥珀酸鈉溶液0.5%草酸鈉溶液0.01%甲稀蘭溶液生理鹽水實驗試劑與器材實驗操作肝糜液的制備：用頸椎脫臼法處死小白鼠，立即剖腹將肝臟全部取出，用生理鹽水洗凈肝臟，充分研碎至糊狀，然后分批參加少量磷酸緩沖液，邊加邊磨，總共參加7ml，攪拌后離心約5分鐘〔3000rpm〕,將上清液倒入另一試管鐘備用，此即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液。另取5支試管，標號，按下表操作試劑1號管2號管3號管4號管5號管0.25%琥珀酸鈉液（ml）0.5—0.520.50.5%草酸鈉溶液（ml）—0.50.50.52蒸餾水（ml）221.5——肝糜液（ml）11111甲稀蘭（ml）0.20.20.20.20.2操作：搖勻，靜置于37℃的水浴中，注意觀察各試管的顏色變化。記錄各管顏色消退的順序和時間，并進行分析。本卷須知：肝臟一定要充分研磨至糊狀，以使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液中。離心時注意離心管一定要精確平衡，并將重量相同的離心管對稱放置?！灿锰炱骄芷胶怆x心管和它們的內(nèi)容物，假設有套筒，離心管應與套筒一起平衡，否那么輕者造成離心機損壞，重者會引起人員傷亡〕〔平衡后應對稱放置，不能錯位，以免因離心所產(chǎn)生的離心力不對稱而損壞離心軸〕離心結(jié)束后拿取離心管時動作要輕柔，不能震蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁。反響開始后，反響液必須靜止，不能再搖動。思考題:〔1〕為什么反響開始后，反響液必須精致，不能再搖動？〔2〕本實驗為何選擇肝臟來提取琥珀酸脫氫酶?本實驗成功的關鍵是什么？〔3〕抑制劑還可以選用什么物質(zhì)？〔4〕本實驗在設計上存在著某些缺陷，指出存在的缺陷與改進方案。臨床意義：琥珀酸脫氫酶〔Succinatedehydrogenase，簡稱SDH〕，黃素酶類，是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，屬膜結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標志酶。作為參與三羧酸循環(huán)的關鍵酶，琥珀酸脫氫酶是反映線粒體功能的標志酶〔markerenzyme〕之一，其活性一般可作為評價三羧酸循環(huán)運