微生物學實驗12 微生物數(shù)量的測定

實驗十二微生物數(shù)量的測定微生物的生長通常以群體的生長作為指標。群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或者細胞物質(zhì)的增加。測定微生物數(shù)量的主要方法：顯微鏡直接計數(shù)法（不辨死活）P51光電比濁法（不用于顏色太深的樣品）P86平板菌落計數(shù)法（形成菌落的微生物）P32測定細胞重量法（測定絲狀真菌生長量）測定細胞總氮量或總碳量（適于濃度較高的樣品）。。。。。。

目的要求了解血細胞計數(shù)板的構(gòu)造、計數(shù)原理和計數(shù)方法；掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能。顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種方法。直接計數(shù)法優(yōu)缺點優(yōu)點：直觀、快速、操作簡單。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)；不適于對運動細菌的計數(shù)。常用計菌器常用計數(shù)器有血細胞計數(shù)板、Petroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等。各種計數(shù)板的計數(shù)原理相同，只是血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀察，只能計數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；而后兩種計菌器，可以使用油鏡觀察，因此可以直接計數(shù)細菌。

血球計數(shù)板Petroff-Hauser計菌器Hawksley計菌器血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)。每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格。無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。計數(shù)方法計算：1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*25*104*B=50000*A*B1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*16*104*B=32000*A*B其中B為稀釋倍數(shù)。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常數(shù)5個中方格的總菌數(shù)A，然后求每個中方格的平均值，再乘上大方格（計數(shù)室）中方格的數(shù)量(25或16)，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，再換算成每毫升菌液中微生物細胞的數(shù)量。注意事項對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。對于壓線酵母，按照數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則計數(shù)實驗器材活材料：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培養(yǎng)液。其他器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、電吹風、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。實驗方法

1、用無菌生理鹽水將待測菌稀釋成適當濃度的菌懸液（以每個小方格中5～10個菌為宜）。2、取潔凈的血球計數(shù)板一塊（事先鏡檢），蓋上一塊蓋玻片。3、將菌懸液搖勻，用無菌吸頭吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴加，讓菌懸液利用毛細滲透作用充滿計數(shù)區(qū)。4、加樣后靜止5min，將計數(shù)板置顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)區(qū)，然后換高倍鏡計數(shù)。（光不宜太強，需要使用濾光片）5、計數(shù)完畢，將血球計數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，用電吹風吹干，鏡檢確認計數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉淀。6.作業(yè)：結(jié)果（填表）P55清洗時切勿用刷子等硬物，也不可用酒精燈火焰烘烤取樣時要搖勻菌液，加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生清洗時切勿用刷子等硬物，也不可用酒精燈火焰烘烤了解光電比濁計數(shù)法的原理。學習、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法。目的要求光電比濁計數(shù)法基本原理當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與吸光度成正比，而吸光度或透光度可以精確測出。因此，可用一系列已知細菌數(shù)量的菌懸液測定吸光度，作出吸光度-菌數(shù)標準曲線。然后，以待測樣品液所測得的吸光度，即可從標準曲線中查出對應(yīng)的菌數(shù)。光電比濁計數(shù)法優(yōu)缺點優(yōu)點：簡便、快速，可用于多個樣品同時測定測定。缺點：吸光度受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及選用的波長的影響；對于不同微生物的菌懸液要選擇相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線；對于顏色太深的樣品或產(chǎn)生具有吸光特性物質(zhì)的細菌不能用此法。器材菌種釀酒酵母培養(yǎng)液儀器或其他用具分光光度計，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸頭，無菌生理鹽水等。操作步驟標準曲線的制作測定樣品吸光度每毫升細胞數(shù)光密度值標準曲線的制作1、血細胞計數(shù)板直接計數(shù)：首先直接計數(shù)釀酒酵母菌懸液原液細胞數(shù)。（2×108菌/mL）2、稀釋菌液：將上述已知濃度的釀酒酵母菌懸液用無菌生理鹽水分別稀釋成為（依次2倍稀釋）：1×108、5×107、2.5×107、1.25×107、6.25×106、3.125×106菌/mL的菌懸液。3、測OD值：以無菌生理鹽水作為對照，于波長560nm處用1cm比色皿測定上述各菌液的OD值。4、以每毫升菌數(shù)為橫坐標，所測OD值為縱坐標，繪制標準曲線。操作步驟振蕩混勻原液3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml2-12-22-32-42-5+待測樣品的測定1、稀釋：將待測菌懸液用無菌生理鹽水適當稀釋。2、測定：在560nm波長測定稀釋后菌懸液的吸光度。3、計算：根據(jù)所測得的吸光值，從標準曲線查得每毫升的含菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)就得到原液中細菌數(shù)。4、作業(yè)：繪制標準曲線，將比濁法所測結(jié)果同直接計數(shù)結(jié)果作比較。722型分光光度計操作方法開機預熱：接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋，預熱10至15分鐘。選擇波長：將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時，需選用較高檔）。選擇合適的波長。調(diào)零：將空白液倒入比色皿中（不少于3/4），用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，光面對準光路。將吸光度設(shè)置為0％，確認；將透光度設(shè)置為100％，確認。測定：將樣品加入另一個比色皿，放入樣品室，讀取吸光度。關(guān)機：測定完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。

平板菌落計數(shù)法掌握平板菌落計數(shù)的的原理和方法目的要求基本原理將待測菌液經(jīng)過適當稀釋，涂布在平皿上，經(jīng)培養(yǎng)后可以長出肉眼可見的菌落；統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計算出樣品中細胞的濃度。該方法能直接反應(yīng)樣品中活細胞的數(shù)量，可用于生物制品、食品、水質(zhì)等檢測。每毫升樣品中菌落形成單位數(shù)（CFU）=每皿菌落平均數(shù)×1/取樣體積數(shù)×稀釋倍數(shù)操作步驟稱取10g土樣振蕩10min90ml9ml9ml9ml9ml9ml0.1ml0.1ml0.1ml1ml1ml1ml1ml1ml10-110-210-310-410-510-6倒培養(yǎng)基2×制備土壤稀釋液→涂平皿→培養(yǎng)→計數(shù)每毫升樣品中菌落形成單位數(shù)（CFU）=每皿菌落平