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第20章毛細(xì)管電泳法28-2電介質(zhì)中帶電粒子在電場作用下向電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱為電泳electrophoresis。利用電泳現(xiàn)象進行分離分析的方法稱為電泳法。1930年,Tiselius電泳分離血清蛋白,獲1948年諾貝爾化學(xué)獎。20世紀(jì)60年代后,出現(xiàn)管狀電泳;1981年,Jorgenson和Lukacs使用毛細(xì)管分離丹?;被岖@得高柱效,并理論證明CE柱效正比于電場強度、反比于分子擴散系數(shù);1988年,CE商品化;近年來,出現(xiàn)CCE(芯片式)、CAE(陣列式)等28-3一、電滲和電滲率二、電泳和電泳淌度三、表觀淌度四、分離效率和譜帶展寬五、分離度20.1CE的基礎(chǔ)理論28-4當(dāng)液體兩端施加電壓時,會發(fā)生液體相對于固體表面的移動,這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲。電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流,EOF1、電滲流現(xiàn)象
當(dāng)固體與液體接觸時,固體表面由于某種原因帶一種電荷,則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷,在液-固界面形成雙電層,二者之間存在電位差。一、電滲和電滲率28-52、CE中的電滲現(xiàn)象與電滲流石英毛細(xì)管柱,內(nèi)充液pH>3時,表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷,形成雙電層。在高電場的作用下,帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動,由于這些陽離子實際上是溶劑化的,故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動,速度ν電滲流。28-63、CE中電滲流的大小電滲流的大小用電滲流速度uos表示,取決于電滲率或電滲淌度μos和電場強度E,即uos=μosE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢,即
μ=εξos/4πηε介電常數(shù);ζos毛細(xì)管壁的Zeta電勢;η黏度28-74、CE中電滲流的方向電滲流的方向取決于:毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)內(nèi)表面帶負(fù)電荷,溶液帶正電荷,電滲流流向陰極;內(nèi)表面帶正電荷,溶液帶負(fù)電荷,電滲流流向陽極;石英毛細(xì)管:帶負(fù)電荷,電滲流流向陰極;改變電滲流方向的方法:(1)毛細(xì)管改性:表面鍵合陽離子基團;(2)加電滲流反轉(zhuǎn)劑:內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑,將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷,溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽極。28-85、CE中電滲流的作用各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為:u+=uos+ueff
陽離子運動方向與電滲流一致;u-=uos-ueff陰離子運動方向與電滲流相反;u0=uos
中性粒子運動方向與電滲流一致;電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5~7倍,因此:任何粒子均隨電滲流朝一個方向移動作用:在CE中,控制電滲流非常重要可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離;改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性;電滲流的微小變化會直接影響結(jié)果的重現(xiàn)性;28-96、CE中電滲流的流形電荷均勻分布,整體移動,電滲流的流動為平流,塞式流動(譜帶展寬很?。灰合嗌V中的溶液流動為層流,拋物線流型,管壁處流速為零,管中心處的速度為平均速度的2倍(引起譜帶展寬較大)。28-107、CE中影響電滲流的因素電場強度的影響
電滲流速度和電場強度成正比,當(dāng)毛細(xì)管長度一定時,電滲流速度正比于工作電壓。毛細(xì)管材料的影響
不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同,產(chǎn)生的電滲流大小不同;28-11電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響溶液pH的影響對于石英毛細(xì)管,溶液pH增高時,表面電離多,電荷密度增加,管壁zeta電勢增大,電滲流增大,pH=7,達(dá)到最大;pH<3,完全被氫離子中和,表面電中性,電滲流為零。分析時,采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。陰離子的影響在其他條件相同,濃度相同而陰離子不同時,毛細(xì)管中的電流有較大差別,產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流,明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加,電滲流下降。28-1228-13溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高,使溶液的黏度下降,電滲流增大。溫度每變化1℃,將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%~3%;溫度變化來自于焦耳熱:毛細(xì)管溶液中有電流通過時,產(chǎn)生的熱量;CE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強度成正比。
28-14添加劑的影響加入濃度較大的中性鹽,如K2SO4,溶液離子強度增大,使溶液的黏度增大,電滲流減小。加入表面活性劑,可改變電滲流的大小和方向。如加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑,如十二烷基硫酸鈉(SDS),可以使壁表面負(fù)電荷增加,zeta電勢增大,電滲流增大;加入有機溶劑如甲醇、乙腈,使電滲流增大。28-1528-16二、電泳和電泳淌度電泳是指在電場作用下帶電離子在緩沖溶液中定向移動的現(xiàn)象。不同離子具有不同的遷移速度uep:電泳淌度μep:溶質(zhì)在給定的緩沖溶液中和單位電場強度下單位時間內(nèi)移動的距離,即單位電場下的電泳速度,也稱電泳遷移率。單位為m2/(V·s)28-17對于空心電泳毛細(xì)管,一個粒子的電泳淌度近似等于:凈電荷摩爾質(zhì)量可見:離子表面電荷密度不同,則電泳速度不同,從而實現(xiàn)分離。有效淌度μeff:考慮到離子活度系數(shù)、溶質(zhì)的離解程度的影響遷移速度uep:電場強度E、介質(zhì)特性、電離度、電荷數(shù)、大小和形狀等28-18三、表觀淌度表觀淌度uap:不考慮粒子相互作用的條件下,粒子在毛細(xì)管中的運動速度是電泳流和電滲流速度的矢量和。出峰次序:正離子、中性粒子、負(fù)離子。中性粒子均與電滲流速度相同,故不能相互分離.正離子μos
+
μeffuos
+ueff中性粒子μosuos負(fù)離子μos
-μeffuos
-
ueff28-19四、分離效率和譜帶展寬(一)理論板數(shù)和塔板高度tm為遷移時間:流出曲線最高點對應(yīng)的時間。Ld為進樣口到檢測器的距離1、2、28-20遷移時間tm計算公式:按照Giddings色譜柱效理論:若分子擴散是造成區(qū)帶展寬的唯一因素,則3、CE分離柱效方程式:特別適合分離生物大分子28-21(二)影響譜帶變寬的因素縱向擴散:擴散系數(shù)、遷移時間自熱:重要因素緣由:焦耳熱通過管壁擴散散熱在管內(nèi)形成拋物線型徑向溫度梯度,導(dǎo)致黏度梯度,引起遷移速度徑向不均,造成帶寬。滿足Edc1/3<1500時則不嚴(yán)重。石英導(dǎo)熱性好;小內(nèi)經(jīng)d、大外徑利于散熱;冷卻降溫恒溫;降低緩沖液濃度吸附:原因——陰陽離子作用、疏水作用??朔锎蠓肿映S猛繉犹幚砻?xì)管柱28-22五、分離度遷移速度差遷移速度平均值表明R是下列因素的函數(shù):①外加電壓V;②有效柱長與總長度之比;③電泳有效淌度差;④電滲淌度。28-2320.2CE的主要分離模式一、毛細(xì)管電泳的分類自由溶液與非自由溶液電泳型、色譜性、電泳/色譜型分離模式:P430表20-2二、毛細(xì)管區(qū)帶電泳:CZE背景——緩沖溶液分離——基于組分荷質(zhì)比差異操作條件——分離電壓、緩沖液及其pH、添加劑28-2420.2CE的主要分離模式三、膠束電動毛細(xì)管色譜:MEKC背景——膠束分離——電泳+色譜條件——膠束的親水性與疏水性,流動相選擇(緩沖液種類、濃度、pH、離子強度、添加劑)四、毛細(xì)管凝膠電泳:CGE背景——凝膠或篩分介質(zhì)分離——凝膠分子篩操作條件——因受pH影響,選擇性小于CZE28-2520.2CE的主要分離模式五、毛細(xì)管點色譜:CEC背景——CZE中的空管填充色譜固定相
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