復(fù)旦大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離及細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分別及細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間：實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)人：實(shí)驗(yàn)原理小鼠脾臟位于上腹部左后側(cè)，體積較大，長(zhǎng)條形，屬于外周免疫器官。外周血中淋巴細(xì)胞可經(jīng)再循環(huán)駐如脾臟等外周免疫器官的特定地域，因此富含各類(lèi)免疫細(xì)胞。免疫細(xì)胞的分別：采納紅細(xì)胞裂解法，是依據(jù)細(xì)胞對(duì)浸透壓變化的敏感度。紅細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，僅有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)于膨脹的耐受能力較差，因此絕大部分就會(huì)漲破，遇到破壞。是一種比較平和的去除紅細(xì)胞最簡(jiǎn)易易行的方法。實(shí)驗(yàn)資料：健康小鼠手術(shù)器材（剪刀、鑷子）、解剖板70%乙醇PBS緩沖液、紅細(xì)胞裂解液（ACK）%臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器離心計(jì)顯微鏡實(shí)驗(yàn)方法：取小鼠脾臟將小鼠頸椎脫位處死，用酒精消毒。用剪刀剪開(kāi)背部皮膚，再找到脾臟，用鑷子夾出脾臟并剪除四周組織。制備單個(gè)核細(xì)胞懸液將拿出的脾臟置于盛有3mlPBS緩沖液的平皿中，而后再置于尼龍指套中，用針芯輕輕碾壓使得單個(gè)核細(xì)胞懸浮于平皿中。汲取平皿中細(xì)胞懸液置于刻度離心管（15ml）中，以1500rpm離心10min，棄去上清液，加入ASK至2-3ml，輕輕吹打混勻并擱置2min，以破壞紅細(xì)胞。而后加入PBS緩沖液至10ml，以1500rpm離心10min。棄去上清液，用PBS緩沖液定容至2ml，吹打混勻即為小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液。計(jì)算細(xì)胞濃度稀釋十倍，隨機(jī)采納一個(gè)大方格計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)為324個(gè)，計(jì)算細(xì)胞濃度為4×7324×10×10=10/ml計(jì)算細(xì)胞活力在總計(jì)為324個(gè)細(xì)胞被騙數(shù)，死亡細(xì)胞有16個(gè)，計(jì)算細(xì)胞活力為：324-16/324×100%=%在理論范圍以?xún)?nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果研磨脾臟獲取細(xì)胞懸液本實(shí)驗(yàn)中將小鼠的脾臟放入尼龍指套內(nèi)，置于少許PBS液中緩慢研磨，獲取細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)尼龍指套不可以濾去全部結(jié)締組織，操作中會(huì)有結(jié)為絮狀團(tuán)塊的結(jié)締組織。這些結(jié)締組織在離心后會(huì)和細(xì)胞絞纏在一起，去除十分麻煩，并且會(huì)損失細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)在離心以前盡早用吸管吹打后當(dāng)心棄去（這樣損失的細(xì)胞比較少，造成較小的偏差）。研磨脾臟時(shí)的力度、時(shí)間、溫度都會(huì)影響細(xì)胞的活性。因此應(yīng)置于冰上快速、柔和地研磨，置于液體中防范干磨。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室室溫下碾磨，造成細(xì)胞破碎較多，影響最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。白細(xì)胞計(jì)數(shù)在使用血球計(jì)數(shù)板時(shí)，遇到了鏡下看不到計(jì)數(shù)板格子線(xiàn)的問(wèn)題:開(kāi)初，我們小組可以在鏡下觀察到細(xì)胞，但是細(xì)胞清楚時(shí)沒(méi)法找到計(jì)數(shù)板格子線(xiàn)。以后我們意識(shí)到，這可能是因?yàn)槌涑睾篑R上觀察，細(xì)胞還懸浮在液體中，和方格線(xiàn)不在同一個(gè)平面上。靜置2分鐘后再調(diào)焦觀察，只好隱約看到方格線(xiàn)。在頻頻調(diào)試中發(fā)現(xiàn)，減小光圈并降低光源亮度可以增添方格線(xiàn)的清楚度。其余，必定要注意在充池前對(duì)計(jì)數(shù)板的潔凈。我們小