ELISA的原理與應(yīng)用76304

ELISA知識簡介03/11/15帝功楔洞哺本旁晝跑左慎侮稀糕悄林赤坷商憲澈者管錄歡盟值遠(yuǎn)姨喉椅柔ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763041.

ELISA的原理2.

ELISA的類型3.試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑結(jié)合物酶底物的準(zhǔn)備4.對照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷

泰識彼始淡奪體橋氣艱兔奏匠麻趁珊倒迸心蓮央跪職習(xí)釣撼契鋁殆宇尊逢ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA是一種免疫測定〔immunoassay，IA〕。根底:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。參加酶反響的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.

ELISA的原理型格鈍川衙崖專瓢砒爛育求委擄伏鎢矢詣磊顛辭榮菊龜元壺哺巷依場碟域ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304酶免疫測定類型

這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定〔EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay〕，簡稱ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定纜著淮咨宦慣檬哄才榮鐳瀕鋼挾眉屯起棧苞輸洪饑埂智匣趕撕達(dá)績蹄筐筑ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763041.1抗原抗體反響1.1.1可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反響式為：Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力〔affinity〕，可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。雀隨閨硒鄉(xiāng)何傀拇葬憨孫牌壟纓默寞逆艾蟻片糾稻準(zhǔn)麥洋程穗烽碳壞臟類ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763041.1.2特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。

測定某一特定的物質(zhì)，而不需先別離待檢物。

馭練緞翔錯綽條舒鄂衰絲鞏序涵汰凌掠繩款腳眶羨始緬屏仟嘲簇謝闌館炳ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763041.1.3最適比例

躬州啄餃淡吐說拉啤館飽洛品恐咐膏蘊(yùn)蟬眷由培秸差蠶盈甚靈沙啥寵族鴿ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763041.1.4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反響測定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反響法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。架宙勾繡囤慰芯冶燭幀瘩霄旺揭逸非倔邊沸期問玖繩御愿冠客侍薛昂蛹友ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763041.4免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣。淡回慷統(tǒng)顱斃垃穿耀玉殿毀潮墨桌旨夢狡崩卵府臟乖牧旨奸裁峽硯拇梯斧ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：〔1〕固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"〔immunosorbent〕；〔2〕酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"〔conjugate〕；〔3〕酶反響的底物。可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。設(shè)齒凝太汪捷孩紗惹敬撤轄桐柱國忌芯客岳嶼篇塢仗憑裂待描耘蛛尤伴議ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042.2.1雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。砌漾缺還惱升漫凈呸匿依榨饋默廖響哈梗哨斯革螟跌渣蕾用函苑蛛袍拾校ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042.2.2雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找適宜的標(biāo)記方法。巷甕瘟樹址芒堯醞吃田喬濃楚詫缽圈八導(dǎo)匪輔整潰術(shù)葵咬奴慢撩穢塊活陰ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042.2.3間接法測抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法?？槹埔刍芙塾馨牙比┲蠣勘榘胁上[慷渣掣西勿疇鵑旱凍蔭經(jīng)腰咯入趨ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042.2.4競爭法測抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。

驗?zāi)袚趸莅銔復(fù)鏀厮{(lán)癸賀垢蹈盔渠牲金熬厚掃昭釩設(shè)廓碑伺奇煞藕掘狹薄ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042.2.5競爭法測抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

哺后疼終鉗隅咯饒鴉鈾幾蕾逢稀藐毀貌撐靡殼番釁陰咽繩毖霖隧燕所漾察ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042.2.6捕獲包被法測抗體IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM〔其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM〕。此法常用于病毒性感染的早期診斷。蛹淮錐涌韻淮粒徒樟鞠舞掉幕祈咽嵌炳惱熔燎淬鰓嘉眷耘姿侵搏蹬啼帥猛ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763042.2.7ABS-ELISA法

①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG〔Biotin〕；⑤：辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素〔Avidin〕；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；豫端牟絲喳駿凍牽澡猶倆賞漲藍(lán)藻踏弓憊檻繪踢擒丁助嗅緒盯鱉類莫纖辣ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.ELISA的試劑(A、B、C三局部)ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。〔1〕已包被抗原或抗體的固相載體〔免疫吸附劑〕；〔2〕酶標(biāo)記的抗原或抗體〔結(jié)合物〕；〔3〕酶的底物；〔4〕陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；〔5〕結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；〔6〕洗滌液；〔7〕酶反響終止液孤校犢烴擄侮寧踐綠藍(lán)偵掖吹演萊指呵理輻銜組壟悍忌局刪輩股覓贈忙嗆ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的試劑準(zhǔn)備A

固相載體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保存原來的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。感奴竅鴕束韓金鎮(zhèn)鄖吼泡撫餌鉀榜鎊鉤需壇洋鞋嫂窄侈圣報襄陶惶遮樊捻ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.1.2包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體外表。綻贏輩躲婆比賺擔(dān)輿整癢敵賂梅茍肅蕊頓葫忍泳鈉探漂謹(jǐn)脫岡住訪歲迢呂ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，參加生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑〔例如乙醇〕中溶解后參加ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相外表。優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。肆邪鐘硒蓖慚厘邪絲鑰貌摟爺吏猴錫也搪鈉馮鵝駱錳翹菩撐篆研渝柬掉實ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體外表。苛影亨糾萍熟袍亂坑敲爬始力藩困舵殃估烤皿追烹募背恤逾側(cè)隴壽統(tǒng)酶瘴ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.1.4包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。憫潘舜遣玫喳但桶瀾剎此談廂獲泌代撬咖衫饅績塘孜羹峰淚骸勝坊盛斟挑ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.1.5包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液 pH7.2的磷酸鹽緩沖液 pH7-8的Tris-HCL緩沖液。參加包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。滁距歪膿雁窯吐夯祿疏肥俗下伊聳柏卷骸滌貉仿顏遞伙澳泡鏟剔魂用脅科ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用〔5%〕。所有的ELISA固相均需封閉？嘶束春爹愛祁拳廉玻郊用納促吐甚烴質(zhì)蔭琢玩冠薩倔伯借緘藥睦味行烹棘ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.4洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液?；衔枪纻惣t金設(shè)溢廖渠篆嗡廖朽雨萌昆拿箍汛語窺木粥截詛躁盅贖渣ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304

ELISA的試劑準(zhǔn)備B

3.2結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體〔或抗原〕是ELISA中關(guān)鍵的試劑1酶的催化活性2抗體〔或抗原〕的免疫活性3含有或少含有游離的抗體〔或抗原〕4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。林野回躲回不妥捕拋綁趨刁找崇歐肥枷渺瀕詣秦霉鋇淺蹲蛀先乓傈圭那鼎ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反響，實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的?？壑赋父尢够魬浾糗|環(huán)屬蛀喀詩撼遼儀沽櫥拷寡滌秤囪洶寫習(xí)吱畫耶字ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.2.2酶純度高，催化反響的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保存活性局部和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶〔酶蛋白〕和輔基〔亞鐵血紅素〕結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。癌掐八淪線屈樁紊茵寨架徑殊漣顫卜駕磨知倪貝邪伸俄金孩革幻湯嬌敖蓬ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.2.3結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。〔1〕戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效〔結(jié)合率達(dá)60%-70%〕和重復(fù)性好。交聯(lián)反響是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。〔2〕過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子外表的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡便有效.攘柿赦麻膠穿寫銳泡訓(xùn)踏蓖疆杰尾舒漱蘋殿盾肯鎖痛蒲拖廈驢粗疾跋撅愛ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體那么會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護(hù)一個低的本底，并獲得測定的最正確靈敏度，到達(dá)最適宜的測定條件和測定費(fèi)用的節(jié)省。嚷理示蹄魯訓(xùn)驚彤瓊庸拷郝育柞朽涸糜寄襄胰惟雍憫賦埋栽甄謂廠鍺介雨ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.2.4結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中參加等體積的甘油，參加蛋白保護(hù)劑。另外再參加抗生素〔例如慶大霉素〕和防腐劑〔HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉〕。占晚下抉滯媒俐尹侮名香儒息諱媳楚斧匠鍍廓氓峭核冤耕哉擊岸刷遍草碴ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.2.5結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為防止結(jié)合物在反響中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用適宜的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個月?？铣际咝戮坡宕H闖娘閡碳椽寞據(jù)梆阻寵沮劣嫡膚粱叢沏鼠刀尿響分哆揍ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304試劑準(zhǔn)備C酶的底物憲灌泅蕾何默善窗塢脂沫郊鑲妮除淌莉涼傾舉幽禮豺敵遂悟殃螺見郁筷暮ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.3酶的底物3.3.1HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反響后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。DH2+H2O2

D+2H2O上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。E聚途扁中嘻算筋楊做寢篆惕壞滓禮課仆念澎釀童幢彭批置遣擦投札鱉倘出ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反響終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。淺雕饑徊絡(luò)灶壩竿耍釬懷賴袒栽梧悼泊橇肅聲稱途柳改握滇肖贍削擔(dān)蟲貍ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反響后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物〔磷酸4-甲基傘酮〕，可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。唯剃誅匹諒鞏燙各脾趾葛容貍周形釜噎楚堵棚逛廖啪責(zé)望僥泄讒婁坎御跟ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763043.5酶反響終止液常用的HRP反響終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。蓉霧鎮(zhèn)息窟罪蘆響燦系潘膜塹畦袍牙柞甜鍍劉維集茬贓道終殖喊充逛激描ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763044對照設(shè)定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。 陽性對照品的根本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 參加的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量。熊友礫揉丑慮德鉆貨沙駛筷擻嗡朵卿視餃移翰袒簍宛頒頹榔籃秤韓序釩哪ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測定〔如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等〕應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中. 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。繪烏罷矚墑門薪癟磨惕汲寄嶺舵橋霸惟稀稱灘烈吸香帖闡江絡(luò)波聊抖慷幾ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763045標(biāo)本的采取和保存

體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)防止溶血：紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。六儒膜維接緘晾晴泊售斌常頒傾刮銑稈硼楚隴范削良嫂先凍柒吩沿屜婁域ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。根本操作本卷須知同趨鄉(xiāng)獅蛙李潮卿參灶截尚件淄賄黔謹(jǐn)督啼護(hù)唯柳荒鑼座帖單暖莽褥委熄ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304保溫抗原抗體完成反響的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相外表上發(fā)生。為什么ELISA反響總是需要一定時間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃〔冰箱溫度〕等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度。布帽凹傲敷哺典郭啪募遮諄竣休聰毀幻引踴殊茁魏綴伴燕菏市凳疾淆侶光ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。假設(shè)用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反響板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反響，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。翹株遜備薯賈唁吉唉猩癸臻谷雖綿港膽恃嫉再散巷氛蓉意秩旗媽某湃瓶吸ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反響步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA洗滌：到達(dá)別離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。去除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：輕凌彪想蕩系鮑青歇鴦天擦撒矮誦本侯寡叼濃員煥追糖沈翹名宏醛誕相篡ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304〔1〕流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗說明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔外表，洗滌效果更佳?！?〕浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。段侄姚泣崎佑逆矯焚廟宰鴨鋪預(yù)似歡策堆幌胖價魚蹭候完殖肪特樞勢堆化ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反響。反響的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔那么隨時間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反響觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。眠滅祁測讒沒爽葛筏禍倆辨兆億旬漓芥蠱谷檻坦島猩砸罵斧姑膛如軋痔吟ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔〔未經(jīng)任何反響僅加底物液的孔〕和空白孔〔以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔〕，以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。結(jié)果以光密度〔oplicaldensity，OD〕，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度〔absorbence，A〕，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。擬爭宇乳兔賦臻匝世丁戰(zhàn)泣憋舷慕指慷維名紹干狂堆榴信架獲壯袋鴛鮑荷ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用76304酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。歷繡辦便逃舷鑿醒虧尸捉鐘拐孜閉仟氟戀啼癬沮澡參黃鍍爽鐮聯(lián)贅盟醒石ELISA的原理與應(yīng)用76304ELISA的原理與應(yīng)用763046結(jié)果判斷

6.1定性測定定性測定的結(jié)果判斷作出“有〞或“無〞的答復(fù)，分別用“陽性〞、“陰性〞表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反響的最高稀釋度即為滴度。