實(shí)驗(yàn)四 線粒體的分離與觀察

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實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

用差速離心法分離動、植物細(xì)胞線粒體。

實(shí)驗(yàn)原理

線粒體(mitochondria)是真核細(xì)胞特有的，使能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞中的能源物質(zhì)——脂肪、糖、部分氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化，并通過耦聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細(xì)胞生理活動之需。對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是在離體的線粒體上進(jìn)行的。

制備線粒體采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差速離心的方法。在一給定的離心場中(對于所使用的離心機(jī)，就是選用一定的轉(zhuǎn)速)，球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間內(nèi)，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器中最先沉淀的是細(xì)胞核，其次是線粒體，其它更輕的細(xì)胞器和大分子可依次再分離。

懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細(xì)胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個(gè)操作過程應(yīng)注意使樣品保持4℃，避免酶失活。

線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B(JanusgreenB)是對線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。

I．雞肝線粒體的分離

實(shí)驗(yàn)用品

一、材料

雞肝臟

二、試劑

1.生理鹽水

2．1％詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。

3.0.25mol／L蔗糖+0.01mol／LTris-鹽酸緩沖液（ph7.4）：

0.1mol／L三羥甲基氨基甲烷(Tris)10ml

0.1mol／L鹽酸8.4ml

加重蒸水到100ml

加蔗糖到0.25mol／L。蔗糖為密度梯度離心用D(+)蔗糖

4.0.34mol／L蔗糖＋0.01mol／LTris-鹽酸緩沖液（ph7.4）

5.固定液：甲醇-冰醋酸(9：1)

6.姬姆薩染液：Giemsai粉0.5g，甘油33ml，純甲醇33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研缽內(nèi)研磨至無顆粒，再將剩余甘油到入混勻，56℃左右保溫2h令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。用時(shí)吸出少量用1/15mol／L磷酸鹽緩沖液作10～20倍稀釋。

1/15mol／L磷酸鹽緩沖液作(pH6.8)．

1／15mol／LKH2PO450ml

1／15mol／LNa2HPO450ml

三、器材

高速離心機(jī)、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍織物、玻璃勻漿器。

實(shí)驗(yàn)方法

1.制備大屬肝細(xì)胞勻漿。實(shí)驗(yàn)前雞空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血

水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，剪碎，用預(yù)冷到0~4℃的0．25mol／L緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0～4℃條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol／L緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應(yīng)分?jǐn)?shù)次添加，勻漿用雙層尼龍織物過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時(shí)間，整個(gè)分離過程不宜過長，以保持組分生理活性。

2.差速離心。先將9ml0.34mol／L緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心地加入9ml肝勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍控溫高速離心機(jī)按圖10-1順序進(jìn)行差速離心。

3.分離物鑒定。

(1)細(xì)胞核：取細(xì)胞核沉淀一滴涂片，入甲醇－冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆

薩染液(原液10~20倍稀釋)染色10min。自來水沖洗，吹干，鏡檢。結(jié)果：細(xì)胞核紫紅色，上面附著的少量胞質(zhì)為淺藍(lán)色碎片。

(2)線粒體：取線粒體沉淀涂片(注意勿太濃密)，不待干即滴加1％詹納斯綠B染液染20min

覆上蓋玻片，鏡檢。線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。

雞肝勻漿700×g離心10min

沉淀上清液

洗滌

10ml預(yù)冷的0.25mol／L緩沖蔗糖溶液2次，

每次1000×g離心15min合并

沉淀上清液

（細(xì)胞核及質(zhì)膜碎片）

10000×g離心10min

沉淀上清液

（線粒體）

洗滌

加10ml預(yù)冷的0.25mol／L蔗糖溶液2次，

每次1000×g離心15min

沉淀上清液

（純化的線粒體）

圖10-1差速離心順序圖

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

如果使用不帶冷凍控溫的普通高速離心機(jī)操作，應(yīng)盡量縮短操作時(shí)間、注意樣品的冷凍，保持其生理活性。

作業(yè)

將線粒體沉淀作一涂片，用姬姆薩染色，檢查是否混雜細(xì)胞核和胞質(zhì)碎片，估計(jì)分離所得線粒體的純度。根據(jù)你的實(shí)際體會，寫出操作注意事