魚類疫苗的現(xiàn)狀

魚類疫苗的現(xiàn)狀魚用疫苗是指能使魚類產(chǎn)生自動免疫的生物制劑。如加以嚴(yán)格區(qū)分，魚用疫苗可分為菌苗、疫苗和類毒素三類。菌苗是由細菌制備的，疫苗是由病毒制備的，類毒素則由外毒素所制成。魚用疫苗中，主要是菌苗和疫苗。按病原的活力來分，又可分為死苗和活苗。死苗又稱滅活疫苗。是將免疫性好的菌種和病毒種經(jīng)人工大量培養(yǎng)后，用物理或化學(xué)的方法將其殺死而制成。其特點是安全性能好，容易保存，但免疫性能不如活苗好，而且使用劑量大，目前在生產(chǎn)上使用的主要是死苗。活苗又稱弱毒疫苗。是用人工培養(yǎng)減弱的毒(菌)株或天然的弱毒苗株，經(jīng)大量繁殖后制成。這種弱毒疫苗進入機體內(nèi)后，仍能生長繁殖，一段時間后，因其毒力弱，故很快便被機體的抵抗力所撲滅。機體通過這一斗爭后，所獲得的免疫力比較堅強，免疫效果較滅活疫苗好，且使用劑量小，免疫產(chǎn)生快，免疫時間較長，這些是活苗的優(yōu)點。但因是活的微生物制品，較難保存，容易失效是其缺點。新型疫苗，近年來,隨著分子免疫學(xué)與基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展,新一代魚用疫苗的研究也從20世紀(jì)90年代開始起步。目前，國外研究進展較快，主要有亞單位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、基因工程疫苗等。與傳統(tǒng)的疫苗相比,新型疫苗具有安全、高效、可大量生產(chǎn)等優(yōu)點［1,2］亞單位疫苗亞單位疫苗是應(yīng)用某些化學(xué)試劑裂解細菌或病毒，驅(qū)除病原微生物中有害成分和對激發(fā)機體保護性免疫無用的成分，保留其中一種或幾種主要抗原成分所制成的一類疫苗。在獸醫(yī)領(lǐng)域，已有禽流感的血凝素疫苗、口蹄疫VP1疫苗以及結(jié)核桿菌、布氏桿菌等核糖體的亞單位疫苗［3］。在水產(chǎn)病防活領(lǐng)域，也有不少研究人員進行了這方面的研究，如Kuzyk等［4］已研究了針對大馬哈魚敗血癥的亞單位疫苗;在我國，孫建和等［5］通過化學(xué)方法交聯(lián)HEC毒素和多糖，在研制嗜水氣單胞菌亞單位疫苗方面做了一定的嘗試。與傳統(tǒng)疫苗相比，亞單位疫苗有抗體出現(xiàn)早、滴度高、持續(xù)時間長等優(yōu)點。不過，由于種種原因，許多水產(chǎn)動物疾病的亞單位疫苗都處于實驗室階段，應(yīng)用實踐較少。合成肽疫苗也稱為表位疫苗或第三代疫苗，是應(yīng)用人工方法設(shè)計、合成，或以基因工程制備具有保護作用的類似天然抗原決定簇的小肽制成的一類疫苗。確定病原體的抗原決定簇中使機體產(chǎn)生中和性抗體等保護性應(yīng)答成分的氨基酸序列是設(shè)計合成肽疫苗的前提。在魚類桿狀病毒中的G蛋白是一種重要的中和性抗原,由500多個氨基酸組成，在桿狀病毒的致病性中發(fā)揮著重要作用［6］。而針對傳染性造血器官壞死病毒(IHNV),Winton等［7］發(fā)現(xiàn)，將編碼G蛋白的部分基因克隆入大腸桿菌或殺鮭氣單胞菌的減毒株中表達通過浸浴法免疫可產(chǎn)生保護作用。也有試驗發(fā)現(xiàn)，由大腸桿菌表達的純化的IHNV核蛋白基因的產(chǎn)物或體外根據(jù)氨基酸序列合成的G蛋白不能在魚體內(nèi)誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)，而以包含IHNV的G蛋白細菌裂解產(chǎn)物免疫時,卻可以明顯提高魚體對此病的免疫力。到目前為止,魚用合成肽疫苗的研究基本處于試驗階段,具體的作用機制、免疫途徑以及免疫效果等都有待進一步研究。活載體疫苗這類疫苗以某種非致病性病毒或細菌(株)為載體來攜帶并表達其他致病性病原與保護性免疫相關(guān)的抗原基因。用這種重組體作為活疫苗進行預(yù)防接種時,病毒或細菌在其繁殖的細胞中產(chǎn)生外源蛋白，誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。Noonan等［8］將IHNV、病毒性出血敗血癥病毒(VHSV)和IPNV的抗原表位基因一G蛋白基因轉(zhuǎn)入殺鮭氣單胞菌的無毒株A440中,通過活菌苗A440感染大馬哈魚可使其產(chǎn)生針對這幾種桿狀病毒的保護性免疫反應(yīng)。基因缺失疫苗這是利用基因工程技術(shù)去掉病毒基因組中負(fù)責(zé)毒力基因中的某一片段,使其成為缺損病毒株所制成的一類疫苗。Marsden等［9］將殺鮭氣單胞菌的aroA基因刪除構(gòu)建了減毒活疫苗,Vanderheijden等將斑點叉尾鮰病毒的0RF50基因中刪除一段1200bp的序列成功構(gòu)建了減毒株V60。這種缺失突變株在自然條件下，不易返祖成強毒。所以，這種突變株是穩(wěn)定的,用這種方法制造出的弱毒疫苗株在安全性能下更加有保證,而且具有良好的免疫原性。DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗。它是將外源抗原基因插入細菌質(zhì)粒,構(gòu)建成重組質(zhì)粒,直接接種于動物機體，被導(dǎo)入宿主的靶細胞中,DNA則表達特異的蛋白抗原與宿主細胞MHC2I類或MHC2II類抗原分子結(jié)合，刺激免疫識別系統(tǒng)，從而引發(fā)特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，使動物獲得保護力的一種新型疫苗。目前，對魚用DNA疫苗的應(yīng)用研究主要集中在對鮭、鱒的IHNV、VHSV、鯉春病毒(SHRV)等傳染性病毒病的防治上。［17-21］Traxler等［10］以編碼IHNV糖蛋白的裸DNA免疫大西洋鮭,8周后用IHNV進行攻擊試驗，保護率可達40%?100%。Lorenzen等［11］針對VHSV糖蛋白構(gòu)建的DNA疫苗能誘導(dǎo)70%的虹鱒產(chǎn)生較高水平的免疫保護。Kim等［12］按照IHNV、SVCV、SHRV的糖蛋白基因構(gòu)建三種病毒的DNA疫苗，免疫虹鱒后進行的攻毒試驗發(fā)現(xiàn)三種疫苗均使虹鱒產(chǎn)生了對IHNV的免疫抵抗力。與常規(guī)疫苗相比,DNA疫苗主要有以下優(yōu)點:①在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與病原微生物自然感染相似，因而可產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答;②避開了病原微生物，無感染的潛在危險;③外源基因持續(xù)表達，免疫起長;④需要的免疫劑量低,每尾魚10?100“g的劑量即可獲得到良好的免疫效果［13］。當(dāng)然,DNA疫苗也存在安全性的方面的問題，而且DNA疫苗的接種多采用肌內(nèi)注射的方法，這種方法耗時且費力，而且不適用魚苗和經(jīng)濟價值較低的魚類，在實際生產(chǎn)中有一定的局限性［14］。因此，探索有效的免疫方法是DNA疫苗研究急需解決的問題活疫苗迄今為止，世界各國允許生產(chǎn)的無論是病毒還是細菌性魚用疫苗，均為滅活疫苗。然而，為了增強免疫效果的持續(xù)性，更有效地誘導(dǎo)受免魚的細胞免疫應(yīng)答，研究和開發(fā)魚用活疫苗是很有意義的。長期以來，為了避免用于制備活疫苗的病原菌在水體中擴散和毒力回歸的危險，各國均不敢使用魚用活疫苗。以往研制人體用和動物用活疫苗的方法主要是將病原體置于各種條件下培養(yǎng)，通過誘導(dǎo)其發(fā)生基因突變而確立弱毒株的。然而，采用這種方法研制成一種活疫苗不僅需要很長的時間，而且存在很大的盲目性。現(xiàn)在，應(yīng)用基因操作技術(shù)可以將病原體上的目的抗原基因克隆到非致病性病毒或細菌中，從而令這種既帶有目的抗原基因又沒有致病性的微生物充當(dāng)活疫苗的角色。由于病毒的感染防御抗原比較單純，目的抗原的發(fā)現(xiàn)和克隆均較細菌簡單，現(xiàn)在已有幾種疫苗的研究取得了實質(zhì)性的進展。因為致病菌的感染防御抗原較多，即使發(fā)現(xiàn)并克隆成功一個或者數(shù)個感染防御抗原，也難以刺激受免魚體產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答。此外，克隆到菌體內(nèi)的外源基因能否在受體菌中表達和穩(wěn)定地遺傳而不丟失，都是至關(guān)重要的問題。最近引起人們高度重視的還DNA疫苗。這種疫苗不只是利用病原體的抗原相關(guān)基因，而且可以利用受免魚體與免疫應(yīng)答有關(guān)的細胞因子的基因。由于這種DNA疫苗并不是致病菌，所以不存在復(fù)毒和病源擴散問題，安全性是有保證的。不過，如果病原體的有效抗原相關(guān)基因正是毒素基因的話,就仍然要面對DNA疫苗的弱毒化問題微囊疫苗疫苗在消化道內(nèi)被消化而失去抗原性,這是口服免疫接種法所面臨的最大問題。為了防止疫苗的抗原性在消化道內(nèi)被破壞,多年前,就有了商品化獸用微囊疫苗。最近有人試驗了將魚用疫苗用囊膜包被后再對魚類口服免疫接種,已經(jīng)在實驗室內(nèi)取得了較好的免疫效果。如果魚用微囊疫苗的研究獲得成功的話,那么,對魚類的口服免疫接種法將再度引起人們的關(guān)注。用微囊包被疫苗不僅可以防止受免魚體的消化系統(tǒng)對疫苗的破壞,還可以達到使疫苗緩慢釋放,從而延長對魚體免疫系統(tǒng)刺激時間的目的。如果能將微囊包被技術(shù)用于注射用疫苗的包被,就有可能避免在魚用疫苗中添加存在食品衛(wèi)生方面問題的弗氏佐劑。免疫效果的判定為了測定免疫接種后受免魚的免疫應(yīng)答水平,除采用活菌攻毒試驗外,還有多種方法可供采用。對于結(jié)構(gòu)較為單純的病毒性疫苗,測定受免魚血清中的中和抗體,就可能較為準(zhǔn)確地評價受免魚體的免疫防御水平了。但是,對于采用致病機制和結(jié)構(gòu)均比較復(fù)雜的細菌制備的細菌性疫苗,僅檢測1項或2項指標(biāo),是很難對受免魚體的免疫防御水平作出準(zhǔn)確評價的。這是因為研究者雖然可以通過檢測針對菌體外毒素的血清中的中和效價和針對菌體表面抗原的血清中的調(diào)理抗體效價以及測定巨噬細胞的特異性吞噬率、自然殺傷細胞的殺菌活性和嗜中性白細胞中活性氧的濃度等,作為評價受免魚免疫應(yīng)答水平的指標(biāo),但是,在接受抗原刺激后受免魚的免疫應(yīng)答是十分復(fù)雜的生理學(xué)過程,是在各種免疫細胞及其多種細胞因子的協(xié)同作用下完成的,因此,憑1項或者2項指標(biāo),不可能全面反映出這種復(fù)雜的免疫應(yīng)答狀況。不過,通過檢測上述指標(biāo)可以比較受免疫魚某種特異性或者非特異性免疫應(yīng)答的上升程度。為了準(zhǔn)確評價魚用疫苗的效果,除了要進行攻毒試驗外,還有必要結(jié)合疫苗在野外魚池中應(yīng)用的效果和各項免疫指標(biāo)進行綜合分析。受免魚的應(yīng)激狀態(tài)隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,高密度集約化養(yǎng)殖方式被廣泛采用,在我國的許多養(yǎng)殖場均出現(xiàn)了養(yǎng)殖池底堆積有大量有機物質(zhì),水體的富營養(yǎng)化和有害微生物的大量孽生等現(xiàn)象。在這種飼養(yǎng)條件下,