藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則

附件1藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述安全藥理學(xué)（SafetyPharmacology）主要是研究藥物在治療范圍內(nèi)或治療范圍以上的劑量時(shí)，潛在的不期望出現(xiàn)的對(duì)生理功能的不良影響，即觀察藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響。根據(jù)需要進(jìn)行追加和/或補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究。追加的安全藥理學(xué)研究（Follow-upSafetyPharmacologyStudies）：根據(jù)藥物的藥理作用、化學(xué)結(jié)構(gòu)，預(yù)期可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。如果對(duì)已有的動(dòng)物和/或臨床試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生懷疑，可能影響人的安全性時(shí)，應(yīng)進(jìn)行追加的安全藥理學(xué)研究，即對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)進(jìn)行深入的研究。補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究（SupplementalSafetyPharmacologyStudies）：評(píng)價(jià)藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)以外的器官功能的影響，包括對(duì)泌尿系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)和其他器官組織的研究。安全藥理學(xué)的研究目的包括以下幾個(gè)方面：確定藥物可能關(guān)系到人安全性的非期望藥理作用；評(píng)價(jià)藥物在毒理學(xué)和/或臨床研究中所觀察到的藥物不良反應(yīng)和/或病理生理作用；研究所觀察到的和/或推測(cè)的藥物不良反應(yīng)機(jī)制。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物和化學(xué)藥物。二、基本原則（一）試驗(yàn)方法應(yīng)根據(jù)藥物的特點(diǎn)和臨床使用的目的，合理地進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選用適當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)證的方法，包括科學(xué)而有效的新技術(shù)和新方法。某些安全藥理學(xué)研究可根據(jù)藥效反應(yīng)的模型、藥代動(dòng)力學(xué)的特征、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬等來(lái)選擇試驗(yàn)方法。試驗(yàn)可采用體內(nèi)和/或體外的方法。（二）研究的階段性安全藥理學(xué)研究貫穿在新藥研究全過(guò)程中，可分階段進(jìn)行。在藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)前，應(yīng)完成對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)影響的核心組合（CoreBattery）試驗(yàn)的研究。追加和/或補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究視具體情況，可在申報(bào)臨床前或生產(chǎn)前完成。（三）執(zhí)行GLP的要求藥物的安全性評(píng)價(jià)研究必須執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP）。安全藥理學(xué)研究原則上須執(zhí)行GLP。對(duì)一些難以滿足GLP要求的特殊情況，也要保證適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)管理和數(shù)據(jù)保存。核心組合試驗(yàn)應(yīng)執(zhí)行GLP。追加的或/和補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究應(yīng)盡可能地最大限度遵循GLP規(guī)范。（四）受試物中藥、天然藥物：受試物應(yīng)采用能充分代表臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由。應(yīng)注明受試物的名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，否則應(yīng)提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質(zhì)量穩(wěn)定性及均勻性。當(dāng)給藥時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)考察配制后體積是否存在隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而膨脹造成終濃度不準(zhǔn)的因素。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、有效期、規(guī)格及生產(chǎn)單位?；瘜W(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對(duì)穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。受試物應(yīng)注明名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、有效期、規(guī)格和生產(chǎn)單位等，并符合試驗(yàn)要求。在藥物研發(fā)的過(guò)程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變化，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性研究。化學(xué)藥物試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析，并提供樣品分析報(bào)告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析。三、基本內(nèi)容（一）試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本要求1.生物材料生物材料有以下幾種：整體動(dòng)物，離體器官及組織，體外培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞片段、細(xì)胞器、受體、離子通道和酶等。整體動(dòng)物常用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬、非人靈長(zhǎng)類等。動(dòng)物選擇應(yīng)與試驗(yàn)方法相匹配，同時(shí)還應(yīng)注意品系、性別及年齡等因素。生物材料選擇應(yīng)注意敏感性、重現(xiàn)性和可行性，以及與人的相關(guān)性等因素。體內(nèi)研究建議盡量采用清醒動(dòng)物。如果使用麻醉動(dòng)物，應(yīng)注意麻醉藥物的選擇和麻醉深度的控制。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)符合國(guó)家對(duì)相應(yīng)等級(jí)動(dòng)物的質(zhì)量規(guī)定要求，并具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明。2.樣本量試驗(yàn)組的組數(shù)及每組動(dòng)物數(shù)的設(shè)定，應(yīng)以能夠科學(xué)合理地解釋所獲得的試驗(yàn)結(jié)果，恰當(dāng)?shù)胤从秤猩飳W(xué)意義的作用，并符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求為原則。小動(dòng)物每組一般不少于10只，大動(dòng)物每組一般不少于6只。動(dòng)物一般雌雄各半。3.劑量體內(nèi)安全藥理學(xué)試驗(yàn)要對(duì)所觀察到的不良反應(yīng)的劑量反應(yīng)關(guān)系進(jìn)行研究，如果可能也應(yīng)對(duì)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行研究。一般情況下，安全藥理學(xué)試驗(yàn)應(yīng)設(shè)計(jì)3個(gè)劑量，產(chǎn)生不良反應(yīng)的劑量應(yīng)與動(dòng)物產(chǎn)生主要藥效學(xué)的劑量或人擬用的有效劑量進(jìn)行比較。由于不同種屬的動(dòng)物對(duì)藥效學(xué)反應(yīng)的敏感性存在種屬差異，因此安全藥理學(xué)試驗(yàn)的劑量應(yīng)包括或超過(guò)主要藥效學(xué)的有效劑量或治療范圍。如果安全藥理學(xué)研究中缺乏不良反應(yīng)的結(jié)果，試驗(yàn)的最高劑量應(yīng)設(shè)定為相似給藥途徑和給藥時(shí)間的其他毒理試驗(yàn)中產(chǎn)生毒性反應(yīng)的劑量。體外研究應(yīng)確定受試物的濃度-效應(yīng)關(guān)系。若無(wú)明顯效應(yīng)時(shí)，應(yīng)對(duì)濃度選擇的范圍進(jìn)行說(shuō)明。4.對(duì)照一般可選用溶媒和/或輔料進(jìn)行陰性對(duì)照。如為了說(shuō)明受試物的特性與已知藥物的異同，也可選用陽(yáng)性對(duì)照藥。5.給藥途徑整體動(dòng)物試驗(yàn)，首先應(yīng)考慮與臨床擬用途徑一致，可以考慮充分暴露的給藥途徑。對(duì)于在動(dòng)物試驗(yàn)中難以實(shí)施的特殊的臨床給藥途徑，可根據(jù)受試物的特點(diǎn)選擇，并說(shuō)明理由。6.給藥次數(shù)一般采用單次給藥。但是若主要藥效學(xué)研究表明該受試物在給藥一段時(shí)間后才能起效，或者重復(fù)給藥的非臨床研究和/或臨床研究結(jié)果出現(xiàn)令人關(guān)注的安全性問(wèn)題時(shí)，應(yīng)根據(jù)具體情況合理設(shè)計(jì)給藥次數(shù)。7.觀察時(shí)間結(jié)合受試物的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性、受試動(dòng)物、臨床研究方案等因素選擇觀察時(shí)間點(diǎn)和觀察時(shí)間。（二）主要研究?jī)?nèi)容1.核心組合試驗(yàn)：安全藥理學(xué)的核心組合試驗(yàn)的目的是研究受試物對(duì)重要生命功能的影響。中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)通常作為重要器官系統(tǒng)考慮，也就是核心組合試驗(yàn)要研究的內(nèi)容。根據(jù)科學(xué)合理的原則，在某些情況下，可增加或減少部分試驗(yàn)內(nèi)容，但應(yīng)說(shuō)明理由。1.1中樞神經(jīng)系統(tǒng)定性和定量評(píng)價(jià)給藥后動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能、行為改變、協(xié)調(diào)功能、感覺(jué)/運(yùn)動(dòng)反射和體溫的變化等，以確定藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響?？蛇M(jìn)行動(dòng)物的功能組合試驗(yàn)。1.2心血管系統(tǒng)測(cè)定給藥前后血壓（包括收縮壓、舒張壓和平均壓等）、心電圖（包括QT間期、PR間期、QRS波等）和心率等的變化。建議采用清醒動(dòng)物進(jìn)行心血管系統(tǒng)指標(biāo)的測(cè)定（如遙測(cè)技術(shù)等）。如藥物從適應(yīng)癥、藥理作用或化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于易于引起人類QT間期延長(zhǎng)類的化合物，例如：抗精神病類藥物、抗組織胺類藥物、抗心律失常類藥物和氟喹諾酮類藥物等，應(yīng)進(jìn)行深入的試驗(yàn)研究，觀察藥物對(duì)QT間期的影響。對(duì)QT的研究見(jiàn)相關(guān)指導(dǎo)原則。1.3呼吸系統(tǒng)測(cè)定給藥前后動(dòng)物的各種呼吸功能指標(biāo)的變化，如呼吸頻率、潮氣量、呼吸深度等。2.追加和/或補(bǔ)充的安全藥理學(xué)試驗(yàn)當(dāng)核心組合試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)、流行病學(xué)、體內(nèi)外試驗(yàn)以及文獻(xiàn)報(bào)道提示藥物存在潛在的與人體安全性有關(guān)的不良反應(yīng)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行追加和/或補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究。追加的安全藥理學(xué)試驗(yàn)是除了核心組合試驗(yàn)外，反映受試物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的深入研究。追加的安全藥理學(xué)試驗(yàn)根據(jù)已有的信息，具體情況具體分析選擇追加的試驗(yàn)內(nèi)容。補(bǔ)充的安全藥理學(xué)試驗(yàn)是，出于對(duì)安全性的關(guān)注，在核心組合試驗(yàn)或重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中未觀察泌尿腎臟系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等相關(guān)功能時(shí)，需要進(jìn)行的研究。2.1追加的安全藥理學(xué)試驗(yàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)：對(duì)行為、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)生化、視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)和/或電生理等指標(biāo)的檢測(cè)。心血管系統(tǒng)：對(duì)心輸出量、心肌收縮作用、血管阻力等指標(biāo)的檢測(cè)。呼吸系統(tǒng)：對(duì)氣道阻力、肺動(dòng)脈壓力、血?dú)夥治龅戎笜?biāo)的檢測(cè)。2.2補(bǔ)充的安全藥理學(xué)試驗(yàn)泌尿腎臟系統(tǒng)：觀察藥物對(duì)腎功能的影響，如對(duì)尿量、比重、滲透壓、pH、電解質(zhì)平衡、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和血生化（如尿素、肌酐、蛋白質(zhì)）等指標(biāo)的檢測(cè)。自主神經(jīng)系統(tǒng)：觀察藥物對(duì)自主神經(jīng)系統(tǒng)的影響，如與自主神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)受體的結(jié)合，體內(nèi)或體外對(duì)激動(dòng)劑或拮抗劑的功能反應(yīng)，對(duì)自主神經(jīng)的直接刺激作用和對(duì)心血管反應(yīng)、壓力反射和心率等指標(biāo)的檢測(cè)。胃腸系統(tǒng)：觀察藥物對(duì)胃腸系統(tǒng)的影響，如胃液分泌量和pH、胃腸損傷、膽汁分泌、胃排空時(shí)間、體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、體外回腸收縮等指標(biāo)的測(cè)定。2.3其他研究在其他相關(guān)研究中，尚未研究藥物對(duì)下列器官系統(tǒng)的作用但懷疑有影響的可能性時(shí)，如潛在的藥物依賴性、骨骼肌、免疫和內(nèi)分泌功能等的影響，則應(yīng)考慮藥物對(duì)這方面的作用，并作出相應(yīng)的評(píng)價(jià)。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)根據(jù)詳細(xì)的試驗(yàn)記錄，選用合適的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性和定量分析。應(yīng)結(jié)合藥效、毒理、藥代以及其他研究資料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為臨床研究設(shè)計(jì)提出建議。五、參考文獻(xiàn)1．ICH.ICHGuidanceforIndustryICHS7A：SafetyPharmacologyStudiesforHumanPharmaceuticals.2001.2．ICH.ICHGuidanceforIndustryICHS7B：SafetyPharmacologyStudiesforassessingthepotentialfordelayedventricularrepolarization（QTintervalprolongation）byHumanPharmaceuticals.2005.3．國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥、天然藥物一般藥理研究學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則，2005.4．國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物一般藥理研究學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則，2004.附件2藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述急性毒性（Acutetoxicity）是指藥物在單次或24小時(shí)內(nèi)多次給予后一定時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)[1、2]。狹義的單次給藥毒性研究（Singledosetoxicitystudy）是考察單次給予受試物后所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)[2]。本指導(dǎo)原則所指為廣義的單次給藥毒性研究，可采用單次或24小時(shí)內(nèi)多次給藥的方式獲得藥物急性毒性信息。擬用于人體的藥物通常需要進(jìn)行單次給藥毒性試驗(yàn)（見(jiàn)注釋1）。單次給藥毒性試驗(yàn)對(duì)初步闡明藥物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義。單次給藥毒性試驗(yàn)所獲得的信息對(duì)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和某些藥物臨床試驗(yàn)起始劑量的選擇具有重要參考價(jià)值，并能提供一些與人類藥物過(guò)量所致急性中毒相關(guān)的信息[1]。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物和化學(xué)藥物。二、基本原則（一）試驗(yàn)管理用于支持藥品注冊(cè)的單次給藥毒性試驗(yàn)必須執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP）。（二）具體問(wèn)題具體分析單次給藥毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)該在對(duì)受試物認(rèn)知的基礎(chǔ)上，遵循“具體問(wèn)題具體分析”的原則。對(duì)于化學(xué)藥，應(yīng)根據(jù)受試物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)、同類化合物情況、適應(yīng)癥和用藥人群特點(diǎn)、試驗(yàn)?zāi)康牡冗x擇合適的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，并結(jié)合其他藥理毒理研究信息對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)。對(duì)于中藥和天然藥物，還應(yīng)考慮到其與化學(xué)藥的不同特點(diǎn)，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)各自不同的情況進(jìn)行針對(duì)性設(shè)計(jì)。（三）隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)單次給藥毒性試驗(yàn)應(yīng)符合動(dòng)物試驗(yàn)的一般基本原則，即隨機(jī)、對(duì)照和重復(fù)。三、基本內(nèi)容（一）受試物中藥、天然藥物：受試物應(yīng)采用能充分代表臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由。應(yīng)注明受試物的名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，否則應(yīng)提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質(zhì)量穩(wěn)定性及均勻性。當(dāng)給藥時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)考察配制后體積是否存在隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而膨脹造成終濃度不準(zhǔn)的因素。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、有效期、規(guī)格及生產(chǎn)單位。化學(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對(duì)穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。受試物應(yīng)注明名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、有效期、規(guī)格和生產(chǎn)單位等，并符合試驗(yàn)要求。在藥物研發(fā)的過(guò)程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變化，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性研究。化學(xué)藥物試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析，并提供樣品分析報(bào)告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析。（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1、3、4]1.種屬：不同種屬的動(dòng)物各有其特點(diǎn)，對(duì)同一受試物的反應(yīng)可能會(huì)有所不同。從充分暴露受試物毒性的角度考慮，采用不同種屬的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)可獲得較為充分的安全性信息。因此，對(duì)于化學(xué)藥，單次給藥毒性試驗(yàn)應(yīng)采用至少兩種哺乳動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，一般應(yīng)選用一種嚙齒類動(dòng)物和一種非嚙齒類動(dòng)物。若未采用非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)闡明其合理性。對(duì)于中藥、天然藥物，根據(jù)具體情況，可選擇嚙齒類和/或非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)[參見(jiàn)附錄（二）]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)符合國(guó)家對(duì)相應(yīng)等級(jí)動(dòng)物的質(zhì)量規(guī)定要求，并具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明。2.性別：通常采用兩種性別的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，雌雄各半。若采用單性別動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)闡明其合理性。3.年齡：通常采用健康成年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。如果受試物擬用于或可能用于兒童，必要時(shí)應(yīng)采用幼年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。4.動(dòng)物數(shù)：應(yīng)根據(jù)動(dòng)物種屬和研究目的確定所需的動(dòng)物數(shù)5.體重：試驗(yàn)中的每批動(dòng)物初始給藥時(shí)的體重差異不宜過(guò)大，嚙齒類動(dòng)物初始給藥時(shí)體重不應(yīng)超過(guò)或低于平均體重的20%。（三）給藥途徑給藥途徑不同，受試物的吸收速度、吸收率和暴露量會(huì)有所不同。通常情況下給藥途徑應(yīng)至少包括臨床擬用途徑。如不采用臨床擬用途徑，應(yīng)說(shuō)明理由。（四）試驗(yàn)方法與給藥劑量[1、3、4]單次給藥毒性試驗(yàn)的重點(diǎn)在于觀察動(dòng)物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。選擇合適的方法，根據(jù)不同的試驗(yàn)方法選擇合適的劑量（注釋2）。原則上，給藥劑量應(yīng)包括從未見(jiàn)毒性反應(yīng)的劑量到出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)的劑量，或達(dá)到最大給藥量。不同動(dòng)物和給藥途徑下的最大給藥容量可參考相關(guān)文獻(xiàn)及根據(jù)實(shí)際情況來(lái)確定。根據(jù)所選擇的試驗(yàn)方法，必要時(shí)應(yīng)設(shè)置空白和/或溶媒（輔料）對(duì)照組?？紤]到胃內(nèi)容物會(huì)影響受試物的給藥容量，而嚙齒類動(dòng)物禁食時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響到受試物的腸道內(nèi)吸收和藥物代謝酶活性，從而影響毒性的暴露。因此，動(dòng)物經(jīng)口給藥前一般應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間的禁食，不禁水。（五）觀察時(shí)間與指標(biāo)[1、3、4、5]給藥后，一般連續(xù)觀察至少14天，觀察的間隔和頻率應(yīng)適當(dāng)，以便能觀察到毒性反應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間、動(dòng)物死亡時(shí)間等。如果毒性反應(yīng)出現(xiàn)較慢或恢復(fù)較慢，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)觀察時(shí)間。觀察指標(biāo)包括臨床癥狀（如動(dòng)物外觀、行為、飲食、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等）、死亡情況（死亡時(shí)間、瀕死前反應(yīng)等）、體重變化（給藥前、觀察期結(jié)束時(shí)各稱重一次，觀察期間可多次稱重，動(dòng)物死亡或?yàn)l死時(shí)應(yīng)稱重）等。記錄所有的死亡情況，出現(xiàn)的癥狀以及癥狀的起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間，體重變化等。所有的試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行大體解剖。試驗(yàn)過(guò)程中因?yàn)l死而安樂(lè)死的動(dòng)物、死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行大體解剖，其他動(dòng)物在觀察期結(jié)束后安樂(lè)死并進(jìn)行大體解剖。當(dāng)組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。在一些情況下，為獲得更為全面的急性毒性信息，可設(shè)計(jì)多個(gè)劑量組，觀察更多的指標(biāo)，如血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、組織病理學(xué)檢查等，以更好地確定毒性靶器官或劑量反應(yīng)關(guān)系[2、5]。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（一）根據(jù)所觀察到的各種反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及嚴(yán)重程度等，分析各種反應(yīng)在不同劑量時(shí)的發(fā)生率、嚴(yán)重程度。對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行歸納分析，判斷每種反應(yīng)的劑量－反應(yīng)及時(shí)間－反應(yīng)關(guān)系。（二）判斷出現(xiàn)的各種反應(yīng)可能涉及的組織、器官或系統(tǒng)[參考附錄（一）]等。（三）根據(jù)大體解剖中肉眼可見(jiàn)的病變和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷可能的毒性靶器官。應(yīng)出具完整的組織病理學(xué)檢查報(bào)告，檢查報(bào)告應(yīng)詳細(xì)描述，尤其是有異常變化的組織。對(duì)于有異常變化者，應(yīng)附有相應(yīng)的組織病理學(xué)照片。（四）說(shuō)明所使用的計(jì)算方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，必要時(shí)提供所選用方法合理性的依據(jù)。（五）根據(jù)各種反應(yīng)在不同劑量下出現(xiàn)的時(shí)間、發(fā)生率、劑量-反應(yīng)關(guān)系、不同種屬動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)室的歷史背景數(shù)據(jù)、病理學(xué)檢查結(jié)果以及同類藥物的特點(diǎn)，判斷所出現(xiàn)的反應(yīng)與藥物的相關(guān)性。判斷受試物引起的毒性反應(yīng)性質(zhì)、嚴(yán)重程度、可恢復(fù)性以及安全范圍；根據(jù)毒性可能涉及的部位，綜合大體解剖和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷毒性靶器官。單次給藥毒性試驗(yàn)的結(jié)果可作為后續(xù)毒理試驗(yàn)劑量選擇的參考，也可提示一些后續(xù)毒性試驗(yàn)需要重點(diǎn)觀察的指標(biāo)。五、名詞解釋最大給藥量（Maximalfeasibledose，MFD）：指動(dòng)物單次或24小時(shí)內(nèi)多次（2~3次）給藥所采用的最大給藥劑量。最大耐受量（Maximaltolerancedose，MTD）：是指動(dòng)物能夠耐受的而不引起動(dòng)物死亡的最高劑量。半數(shù)致死量（Medianlethaldose，LD50）：預(yù)期引起50%動(dòng)物死亡的劑量，該值是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所推算出的結(jié)果。六、參考文獻(xiàn)1．CDER,FDA.Guidanceforindustry:singledoseacutetoxicitytestingforpharmaceuticals(Final).1996.2．CHMP，EMA.Questionsandanswersonthewithdrawalofthe“Noteforguidanceonsingledosetoxicity”.2010.3．CordierA.Singledosetoxicity:Industryperspectives.In:P.F.D’ArcyandD.W.G.Harronedited,ProceedingsoftheFirstInternationalConferenceonHarmonization.Brussels:1991,189-191.4．Outcome-Singledosetoxicity.In:P.F.D’ArcyandD.W.G.Harronedited,ProceedingsoftheFirstInternationalConferenceonHarmonization.Brussels:1991,184.5．ICHM3(R2).NonclinicalSafetyStudiesfortheConductofHumanClinicalTrialsandMarketingAuthorizationforPharmaceuticals.2009.6．BlazkaME,HayesAW.Acutetoxicityandeyeirritancy.In:HayesAWedited,Principlesandmethodsoftoxicology.Fifthedition,2007:1132-1150.七、注釋注釋1：急性毒性的充分信息也可從其他來(lái)源獲得[2、5]，需要說(shuō)明的是，這些信息應(yīng)是從執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP）的試驗(yàn)中獲得。注釋2：試驗(yàn)方法不同，所采用的給藥劑量不同。可參考相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。但應(yīng)注意，由于中藥、天然藥物的預(yù)期臨床用藥劑量通常較大，因此單次給藥毒性試驗(yàn)方法中所規(guī)定的劑量限度（如上下法中的2000mg/kg或5000mg/kg的劑量限度）僅適用于化學(xué)藥，中藥、天然藥物的劑量設(shè)計(jì)應(yīng)綜合考慮多方面因素進(jìn)行確定。由于大多數(shù)中藥、天然藥物的急性毒性可能相對(duì)較低，中藥、天然藥物常常采用最大給藥量（或最大耐受量法）進(jìn)行急性毒性研究。八、附錄（一）一般觀察與指征[6]以下列出了一些常見(jiàn)的觀察指征及其可能涉及的組織、器官和系統(tǒng)。單次給藥毒性試驗(yàn)中，可能需要對(duì)該表格中列出的全部或部分指征進(jìn)行觀察。該表格僅作為結(jié)果分析評(píng)價(jià)的參考，其他科學(xué)、合理的分析均是可以接受的。觀察指征可能涉及的組織、器官或系統(tǒng)Ⅰ.鼻孔呼吸阻塞，呼吸頻率和深度改變，體表顏色改變A呼吸困難：呼吸困難或費(fèi)力，喘息，通常呼吸頻率減慢1.腹式呼吸：膈膜呼吸，吸氣時(shí)膈膜向腹部偏移CNS呼吸中樞，肋間肌麻痹，膽堿能神經(jīng)麻痹2.喘息：吸氣很困難，伴隨有喘息聲CNS呼吸中樞，肺水腫，呼吸道分泌物蓄積，膽堿能功能增強(qiáng)B呼吸暫停：用力呼吸后出現(xiàn)短暫的呼吸停止CNS呼吸中樞，肺心功能不全C紫紺：尾部、口和足墊呈現(xiàn)青紫色肺心功能不全，肺水腫D呼吸急促：呼吸快而淺呼吸中樞刺激，肺心功能不全E鼻分泌物：紅色或無(wú)色肺水腫，出血Ⅱ.運(yùn)動(dòng)功能：運(yùn)動(dòng)頻率和特征的改變A自發(fā)活動(dòng)、探究、梳理、運(yùn)動(dòng)增加或減少軀體運(yùn)動(dòng)，CNSB嗜睡：動(dòng)物嗜睡，但可被針刺喚醒而恢復(fù)正常活動(dòng)CNS睡眠中樞C正位反射（翻正反射）消失：動(dòng)物體處于異常體位時(shí)所產(chǎn)生的恢復(fù)正常體位的反射消失CNS，感覺(jué)，神經(jīng)肌肉D麻痹：正位反射和疼痛反應(yīng)消失CNS，感覺(jué)E僵?。罕３衷藙?shì)不變CNS，感覺(jué)，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)F共濟(jì)失調(diào)：動(dòng)物行走時(shí)無(wú)法控制和協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，但無(wú)痙攣、局部麻痹、輕癱或僵直CNS，感覺(jué)，自主神經(jīng)G異常運(yùn)動(dòng):痙攣，足尖步態(tài)，踏步，忙碌，低伏CNS，感覺(jué)，神經(jīng)肌肉H俯臥：不移動(dòng)，腹部貼地CNS，感覺(jué)，神經(jīng)肌肉I震顫：包括四肢和全身的顫抖和震顫神經(jīng)肌肉，CNSJ肌束震顫：包括背部、肩部、后肢和足趾肌肉的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)肌肉，CNS，自主神經(jīng)Ⅲ.驚厥（癲癇發(fā)作）：隨意肌明顯的不自主收縮或痙攣性收縮A陣攣性驚厥：肌肉收縮和松弛交替性痙攣CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)B強(qiáng)直性驚厥：肌肉持續(xù)性收縮，后肢僵硬性伸展CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)C強(qiáng)直性-陣攣性驚厥：兩種驚厥類型交替出現(xiàn)CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)D窒息性驚厥：通常是陣攣性驚厥并伴有喘息和紫紺CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)E角弓反張:背部弓起、頭向背部抬起的強(qiáng)直性痙攣CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)Ⅳ.反射A角膜性眼瞼閉合反射：接觸角膜導(dǎo)致眼瞼閉合感覺(jué)，神經(jīng)肌肉B基本條件反射:輕輕敲擊耳內(nèi)表面，引起外耳抽搐感覺(jué)，神經(jīng)肌肉C正位反射：翻正反射的能力CNS，感覺(jué)，神經(jīng)肌肉D牽張反射：后肢被牽拉至從某一表面邊緣掉下時(shí)縮回的能力感覺(jué)，神經(jīng)肌肉E對(duì)光反射：瞳孔反射；見(jiàn)光瞳孔收縮感覺(jué)，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)F驚跳反射：對(duì)外部刺激（如觸摸、噪聲）的反應(yīng)感覺(jué)，神經(jīng)肌肉Ⅴ.眼檢指征A流淚：眼淚過(guò)多，淚液清澈或有色自主神經(jīng)B縮瞳：無(wú)論有無(wú)光線，瞳孔縮小自主神經(jīng)C散瞳：無(wú)論有無(wú)光線，瞳孔擴(kuò)大自主神經(jīng)D眼球突出：眼眶內(nèi)眼球異常突出自主神經(jīng)E上瞼下垂：上瞼下垂，針刺后不能恢復(fù)正常自主神經(jīng)F血淚癥：眼淚呈紅色自主神經(jīng)，出血，感染G瞬膜松弛自主神經(jīng)H角膜渾濁，虹膜炎，結(jié)膜炎眼睛刺激Ⅵ.心血管指征A心動(dòng)過(guò)緩：心率減慢自主神經(jīng)，肺心功能不全B心動(dòng)過(guò)速：心率加快自主神經(jīng)，肺心功能不全C血管舒張：皮膚、尾、舌、耳、足墊、結(jié)膜、陰囊發(fā)紅，體熱自主神經(jīng)、CNS、心輸出量增加，環(huán)境溫度高D血管收縮：皮膚蒼白，體涼自主神經(jīng)、CNS、心輸出量降低，環(huán)境溫度低E心律不齊：心律異常CNS、自主神經(jīng)、肺心功能不全，心肌梗塞Ⅶ.流涎A唾液分泌過(guò)多：口周毛發(fā)潮濕自主神經(jīng)Ⅷ豎毛A毛囊豎毛組織收縮導(dǎo)致毛發(fā)蓬亂自主神經(jīng)Ⅸ.痛覺(jué)缺失A對(duì)痛覺(jué)刺激（如熱板）反應(yīng)性降低感覺(jué)，CNSⅩ.肌張力A張力低下：肌張力全身性降低自主神經(jīng)B張力過(guò)高：肌張力全身性增高自主神經(jīng)Ⅺ.胃腸指征排便(糞)A干硬固體，干燥，量少自主神經(jīng)，便秘，胃腸動(dòng)力B體液丟失，水樣便自主神經(jīng)，腹瀉，胃腸動(dòng)力嘔吐A嘔吐或干嘔感覺(jué)，CNS,自主神經(jīng)（大鼠無(wú)嘔吐）多尿A紅色尿腎臟損傷B尿失禁自主感覺(jué)神經(jīng)Ⅻ.皮膚A水腫：液體充盈組織所致腫脹刺激性，腎功能衰竭，組織損傷，長(zhǎng)時(shí)間靜止不動(dòng)B紅斑：皮膚發(fā)紅刺激性，炎癥，過(guò)敏（二）不同情況的中藥、天然藥物單次給藥毒性試驗(yàn)的要求由于中藥、天然藥物的特殊性，在具體進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)可參照以下要求進(jìn)行；如不按以下要求進(jìn)行，應(yīng)充分說(shuō)明理由。1.未在國(guó)內(nèi)上市銷售的從中藥、動(dòng)物、礦物等物質(zhì)中提取的有效成分及其制劑，新發(fā)現(xiàn)的藥材及其制劑，新的中藥材代用品、藥材新的藥用部位及其制劑，未在國(guó)內(nèi)上市銷售的從中藥、動(dòng)物、礦物等物質(zhì)中提取的有效部位制成的制劑，未在國(guó)內(nèi)上市銷售的中藥、天然藥物注射劑。以上情況，由于其物質(zhì)基礎(chǔ)較傳統(tǒng)中藥發(fā)生了明顯改變，或應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)較少，一般采用嚙齒類和非嚙齒類兩種動(dòng)物，全面考察受試物的急性毒性反應(yīng)情況。如不按以上要求進(jìn)行，應(yīng)說(shuō)明理由。2.未在國(guó)內(nèi)上市銷售的非注射給藥的中藥、天然藥物復(fù)方制劑。如該復(fù)方制劑處方組成符合中醫(yī)藥理論，有一定的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，一般情況下，可采用一種動(dòng)物、按臨床擬用途徑進(jìn)行急性毒性反應(yīng)的觀察。如該復(fù)方制劑為天然藥物復(fù)方制劑，建議采用嚙齒類和非嚙齒類兩種動(dòng)物，按臨床擬用途徑進(jìn)行急性毒性反應(yīng)的觀察；如不按以上要求進(jìn)行，應(yīng)闡明其合理性。如以上制劑處方中含有天然藥物、有效成分或化學(xué)藥品，則應(yīng)當(dāng)對(duì)上述藥用物質(zhì)進(jìn)行急性毒性的相互作用研究。3.改變國(guó)內(nèi)已上市銷售中藥、天然藥物給藥途徑（不包括由非注射劑改為注射劑）的制劑?？蓛H采用一種動(dòng)物，比較改變前后兩種不同給藥途徑的急性毒性反應(yīng)。4.改變國(guó)內(nèi)已上市銷售藥品劑型或改變生產(chǎn)工藝但不改變給藥途徑的中藥、天然藥物復(fù)方制劑。如生產(chǎn)工藝的改變會(huì)引起物質(zhì)基礎(chǔ)的明顯改變，或?qū)λ幬锏奈?、利用可能產(chǎn)生明顯影響，建議采用一種動(dòng)物，按臨床擬用途徑比較改變前后的急性毒性反應(yīng)。5.增加新的適應(yīng)癥或者功能主治的品種。如需延長(zhǎng)用藥周期或增加劑量者，應(yīng)結(jié)合原有毒理學(xué)資料及處方組成等情況確定是否還需要進(jìn)行單次給藥毒性試驗(yàn)以及相應(yīng)的試驗(yàn)內(nèi)容。附件3藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)是描述動(dòng)物重復(fù)接受受試物后的毒性特征，它是非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)可以：①預(yù)測(cè)受試物可能引起的臨床不良反應(yīng)，包括不良反應(yīng)的性質(zhì)、程度、量效和時(shí)效關(guān)系、以及可逆性等；②判斷受試物重復(fù)給藥的毒性靶器官或靶組織；③如果可能，確定未觀察到臨床不良反應(yīng)的劑量水平（NoObservedAdverseEffectLevel，NOAEL）；④推測(cè)第一次臨床試驗(yàn)（FirstinHuman,FIH)的起始劑量，為后續(xù)臨床試驗(yàn)提供安全劑量范圍；⑤為臨床不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)及防治提供參考。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物和化學(xué)藥物。二、基本原則藥物安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)必須執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP），藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)是藥物研發(fā)體系的有機(jī)組成部分，試驗(yàn)設(shè)計(jì)要重視與其他藥理毒理試驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究結(jié)果的關(guān)聯(lián)性，要關(guān)注同類藥物臨床使用情況、臨床適應(yīng)癥和用藥人群、臨床用藥方案，還要結(jié)合受試物理化性質(zhì)和作用特點(diǎn)，使得重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果與其他藥理毒理試驗(yàn)研究互為說(shuō)明、補(bǔ)充或/和印證。三、基本內(nèi)容（一）受試物中藥、天然藥物：受試物應(yīng)采用能充分代表臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由。應(yīng)注明受試物的名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，否則應(yīng)提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質(zhì)量穩(wěn)定性及均勻性。當(dāng)給藥時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)考察配制后體積是否存在隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而膨脹造成終濃度不準(zhǔn)的因素。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、有效期、規(guī)格及生產(chǎn)單位。化學(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對(duì)穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。受試物應(yīng)注明名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、有效期、規(guī)格和生產(chǎn)單位等，并符合試驗(yàn)要求。在藥物研發(fā)的過(guò)程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變化，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性試驗(yàn)?；瘜W(xué)藥物試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析，并提供樣品分析報(bào)告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析。（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)通常采用兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類。理想的動(dòng)物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：①對(duì)受試物的代謝與人體相近；②對(duì)受試物敏感；③已有大量歷史對(duì)照數(shù)據(jù)，來(lái)源、品系、遺傳背景清楚。在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)前應(yīng)采用合適的試驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬或品系進(jìn)行選擇。通常，嚙齒類動(dòng)物首選大鼠、非嚙齒類動(dòng)物首選Beagle犬，特殊情況下可選用其他種屬或品系動(dòng)物進(jìn)行重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)，必要時(shí)選用疾病模型動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)符合國(guó)家對(duì)相應(yīng)等級(jí)動(dòng)物的質(zhì)量規(guī)定要求，具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明。一般選擇正常、健康、性成熟動(dòng)物，同性別體重差異應(yīng)在平均體重的20%之內(nèi)。應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)期限和臨床擬用人群確定動(dòng)物年齡，一般大鼠為6～9周齡，Beagle犬6～12月齡，猴3～5歲，動(dòng)物年齡應(yīng)盡量接近，應(yīng)注明開(kāi)始給藥時(shí)動(dòng)物年齡。每個(gè)劑量組動(dòng)物數(shù)，嚙齒類一般不少于15只/性別（主試驗(yàn)組10只，恢復(fù)組5只），非嚙齒類一般不少于5只/性別（主試驗(yàn)組3只，恢復(fù)組2只）。（三）給藥方案1.給藥劑量：重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)原則上至少應(yīng)設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組，以及1個(gè)溶媒（或輔料）對(duì)照組，必要時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和/或陽(yáng)性對(duì)照組；高劑量原則上使動(dòng)物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，低劑量原則上相當(dāng)或高于動(dòng)物藥效劑量或臨床使用劑量的等效劑量，中劑量應(yīng)結(jié)合毒性作用機(jī)制和特點(diǎn)在高劑量和低劑量之間設(shè)立，以考察毒性的劑量-反應(yīng)關(guān)系。2.給藥途徑：原則上應(yīng)與臨床擬用途徑一致，如不一致則應(yīng)說(shuō)明理由。3.給藥頻率：原則上重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中動(dòng)物應(yīng)每天給藥，特殊類型的受試物就其毒性特點(diǎn)和臨床給藥方案等原因，可根據(jù)具體藥物的特點(diǎn)設(shè)計(jì)給藥頻率。4.試驗(yàn)期限：建議分階段進(jìn)行重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)以支持不同期限的臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)期限的選定可以根據(jù)擬定的臨床療程、適應(yīng)癥、用藥人群等進(jìn)行設(shè)計(jì)。一般重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)期限與所支持的臨床試驗(yàn)及上市申請(qǐng)的關(guān)系詳見(jiàn)附錄（一）。（四）檢測(cè)指標(biāo)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)詳見(jiàn)附錄（二）。此外，還應(yīng)結(jié)合受試物的特點(diǎn)及其他試驗(yàn)中已觀察到的改變或背景信息（如關(guān)于處方組成成分毒性的文獻(xiàn)報(bào)道等），在不影響正常毒性觀察和檢測(cè)的前提下增加合理的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)指標(biāo)的歷史背景數(shù)據(jù)在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中具有重要的參考意義。在結(jié)束動(dòng)物安樂(lè)死時(shí)進(jìn)行一次全面檢測(cè)；當(dāng)試驗(yàn)期限較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)及相關(guān)信息選擇合適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行階段性檢測(cè)；試驗(yàn)期間對(duì)瀕死或死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)采集標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分析瀕死或死亡的原因；恢復(fù)期結(jié)束時(shí)進(jìn)行一次全面的檢測(cè)。給藥前應(yīng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，嚙齒類動(dòng)物應(yīng)不少于5天，非嚙齒類動(dòng)物不少于2周。在適應(yīng)性飼養(yǎng)時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行外觀體征、行為活動(dòng)、攝食情況和體重檢查，非嚙齒類動(dòng)物至少應(yīng)進(jìn)行2次體溫、血液學(xué)、血液生化學(xué)和至少1次心電圖檢測(cè)。給藥期間，根據(jù)試驗(yàn)期限的長(zhǎng)短和受試物的特點(diǎn)確定檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)次數(shù)。原則上應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)，并反映出觀測(cè)指標(biāo)或參數(shù)變化與試驗(yàn)期限的關(guān)系。給藥結(jié)束，對(duì)主試驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)的大體解剖，稱重主要臟器并計(jì)算臟器系數(shù)；進(jìn)行組織病理學(xué)檢查并出具完整的病理學(xué)檢查報(bào)告，如發(fā)現(xiàn)有異常變化，應(yīng)附有相應(yīng)的組織病理學(xué)照片。非嚙齒類動(dòng)物對(duì)照組和各給藥組主要臟器組織均應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；嚙齒類動(dòng)物對(duì)照組、高劑量組、尸檢異常動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)檢查，如高劑量組動(dòng)物某一組織發(fā)生病理改變，需要對(duì)其他劑量組動(dòng)物的相同組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；通常需要制備骨髓涂片，以便當(dāng)受試物可能對(duì)動(dòng)物造血系統(tǒng)有影響時(shí)進(jìn)行骨髓檢查。給藥結(jié)束后，繼續(xù)觀察恢復(fù)期動(dòng)物，以了解毒性反應(yīng)的可逆性和可能出現(xiàn)的遲發(fā)毒性；應(yīng)根據(jù)受試物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)、靶器官毒性反應(yīng)和恢復(fù)情況確定恢復(fù)期的長(zhǎng)短，一般情況下應(yīng)不少于4周。（五）伴隨毒代動(dòng)力學(xué)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)應(yīng)伴隨進(jìn)行藥物毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，具體內(nèi)容參照相應(yīng)指導(dǎo)原則。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的最終目的在于預(yù)測(cè)人體可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。只有通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)分析和全面評(píng)價(jià)才能夠清楚描述動(dòng)物的毒性反應(yīng)，并推斷其與人體的相關(guān)性。重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果的分析和評(píng)價(jià)是重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的必要組成部分。（一）試驗(yàn)結(jié)果的分析分析重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果，判斷動(dòng)物是否發(fā)生毒性反應(yīng)及毒性靶器官，描述毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度（包括毒性反應(yīng)的起始時(shí)間、程度、變化規(guī)律和消除時(shí)間），如果有動(dòng)物死亡應(yīng)分析死亡原因，確定安全范圍，并探討可能的毒性作用機(jī)制。1.正確理解試驗(yàn)數(shù)據(jù)的意義在對(duì)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，應(yīng)正確理解均值數(shù)據(jù)和個(gè)體數(shù)據(jù)的意義。嚙齒類動(dòng)物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中組均值的意義通常大于個(gè)體動(dòng)物數(shù)據(jù)的意義，實(shí)驗(yàn)室歷史背景數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以為結(jié)果的分析提供參考；非嚙齒類動(dòng)物單個(gè)動(dòng)物的試驗(yàn)數(shù)據(jù)往往具有重要的毒理學(xué)意義，是試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量較少、個(gè)體差異較大的原因。此外，非嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果必須與給藥前數(shù)據(jù)、對(duì)照組數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室歷史背景數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，要考慮文獻(xiàn)數(shù)據(jù)參考價(jià)值有局限性。在分析重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)綜合考慮數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義，正確利用統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)有助于確定試驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義，要考慮具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并不一定代表具有生物學(xué)意義；在判斷生物學(xué)意義時(shí)要考慮參數(shù)變化的劑量-反應(yīng)關(guān)系、其他關(guān)聯(lián)參數(shù)的改變、與歷史背景數(shù)據(jù)的比較等因素；分析試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，須對(duì)出現(xiàn)的異常數(shù)據(jù)應(yīng)判斷是否由受試物毒性引起并給予科學(xué)解釋。2.正確判斷毒性反應(yīng)給藥組和對(duì)照組之間檢測(cè)結(jié)果的差異可能來(lái)源于受試物有關(guān)的毒性、動(dòng)物對(duì)藥物的適應(yīng)性改變或正常的生理波動(dòng)，也可能源于試驗(yàn)操作失誤和動(dòng)物應(yīng)激。在分析試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)關(guān)注參數(shù)變化的劑量－反應(yīng)關(guān)系、組內(nèi)動(dòng)物的參數(shù)變化幅度和性別差異，同時(shí)綜合考慮多項(xiàng)毒理學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，分析其中的關(guān)聯(lián)和受試物作用機(jī)制，以正確判斷藥物的毒性反應(yīng)。單個(gè)參數(shù)的變化往往并不足以判斷化合物是否引起毒性反應(yīng)，可能需要進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的試驗(yàn)。此外，毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)可以為毒性反應(yīng)和毒性靶器官的判斷提供重要的參考依據(jù)。（二）動(dòng)物毒性反應(yīng)對(duì)于臨床試驗(yàn)的意義將重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果外推至人體時(shí)，不可避免地會(huì)涉及到受試物在動(dòng)物和人體內(nèi)毒性反應(yīng)之間的差異。首先，不同物種、同物種不同種屬或個(gè)體之間對(duì)于某一受試物的毒性反應(yīng)可能存在差異；其次，由于在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中通常采用較高的給藥劑量，受試物可能在動(dòng)物體內(nèi)呈非線性動(dòng)力學(xué)代謝過(guò)程，從而導(dǎo)致與人體無(wú)關(guān)的毒性反應(yīng)；另外，重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)難以預(yù)測(cè)一些在人體中發(fā)生率較低的毒性反應(yīng)或僅在小部分人群中出現(xiàn)的特異質(zhì)反應(yīng)；同時(shí)有些毒性反應(yīng)目前在動(dòng)物中難以觀察，如頭痛、頭昏、頭暈、皮膚搔癢、視物模糊等。鑒于以上原因，動(dòng)物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的結(jié)果不一定完全再現(xiàn)于人體臨床試驗(yàn)。但如果沒(méi)有試驗(yàn)或文獻(xiàn)依據(jù)證明受試物對(duì)動(dòng)物的毒性反應(yīng)與人體無(wú)關(guān)，在進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)時(shí)必須首先假設(shè)人最為敏感，重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中動(dòng)物的毒性反應(yīng)將會(huì)在臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)。進(jìn)行深入的作用機(jī)制研究將有助于判斷動(dòng)物和人體毒性反應(yīng)的相關(guān)性。（三）綜合評(píng)價(jià)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)是藥物非臨床安全性研究的有機(jī)組成部分，是藥物非臨床毒理學(xué)研究中綜合性最強(qiáng)、獲得信息最多和對(duì)臨床指導(dǎo)意義最大的一項(xiàng)毒理學(xué)試驗(yàn)。對(duì)其結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)結(jié)合受試物的藥學(xué)特點(diǎn)，藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和其他毒理學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果，以及已取得的臨床試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。對(duì)于重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)最終應(yīng)落實(shí)到受試物的臨床不良反應(yīng)、臨床毒性靶器官或靶組織、安全范圍、臨床需重點(diǎn)檢測(cè)的指標(biāo)，以及必要的臨床監(jiān)護(hù)或解救措施。五、參考文獻(xiàn)1.化學(xué)藥物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局，2005.3.2.中藥、天然藥物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局，2005.3.3.周宗燦.毒理學(xué)基礎(chǔ).第二版.北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2000.4.秦伯益.新藥評(píng)價(jià)概論.第二版人民衛(wèi)生出版社，1998.5.Guidanceonnonclinicalsafetystudiesfortheconductofhumanclinicaltrialsandmarketingauthorizationforpharmaceuticals,ICH/M3(R2)2009.6.6.Guidelineonrepeateddosetoxicity,EMA2010.3.7.Redbook2000=4\*ROMANIV.C,FDA2003，2007.8.Noteforguidanceontoxicokinetics:Theassessmentofsystemicexposureintoxicitystudies,ICH/S3A2007.六、注釋（一）試驗(yàn)期限的考慮試驗(yàn)期限應(yīng)與擬開(kāi)展的臨床試驗(yàn)期限和上市要求相匹配；通過(guò)較短試驗(yàn)期限的毒性試驗(yàn)獲得的信息，可以為較長(zhǎng)試驗(yàn)期限的毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供給藥劑量、給藥頻率、觀察指標(biāo)等方面的參考；同時(shí)，臨床試驗(yàn)中獲得的信息有助于設(shè)計(jì)較長(zhǎng)試驗(yàn)期限的動(dòng)物毒性試驗(yàn)方案，降低藥物開(kāi)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。以不同試驗(yàn)期限的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)支持不同用藥期限的臨床試驗(yàn)及上市評(píng)價(jià)時(shí)，重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)內(nèi)容都應(yīng)完整、規(guī)范，結(jié)果分析評(píng)價(jià)強(qiáng)調(diào)客觀性、注重科學(xué)性。擬試驗(yàn)的臨床適應(yīng)癥如有若干項(xiàng)，應(yīng)按最長(zhǎng)療程的臨床適應(yīng)癥來(lái)確定重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)期限。（二）劑量設(shè)計(jì)的考慮劑量設(shè)計(jì)應(yīng)考慮之前進(jìn)行的各項(xiàng)試驗(yàn)所評(píng)價(jià)的終點(diǎn)、受試物的理化性質(zhì)和生物利用度等；局部給藥應(yīng)保證充分的接觸時(shí)間。高劑量應(yīng)出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，或達(dá)到最大給藥量（MaximumFeasibleDose,MFD），或系統(tǒng)暴露量達(dá)到臨床系統(tǒng)暴露量的50倍（基于AUC）。如需要在試驗(yàn)中途改變給藥劑量，應(yīng)說(shuō)明劑量調(diào)整理由，完整記錄劑量調(diào)整過(guò)程。（三）不同情況中藥、天然藥物的試驗(yàn)要求考慮到中藥、天然藥物各類藥物處方來(lái)源、立題依據(jù)等差別，在具體進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)可參照以下要求進(jìn)行。這些要求僅是一般要求，應(yīng)遵循新藥開(kāi)發(fā)的客觀規(guī)律，具體試驗(yàn)結(jié)合受試物特點(diǎn)考慮需開(kāi)展的試驗(yàn)，進(jìn)行個(gè)性化的設(shè)計(jì)。1．未在國(guó)內(nèi)上市銷售的從中藥、動(dòng)物、礦物等物質(zhì)中提取的有效成分及其制劑，新發(fā)現(xiàn)的藥材及其制劑，新的中藥材代用品、藥材新的藥用部位及其制劑，未在國(guó)內(nèi)上市銷售的從中藥、動(dòng)物、礦物等物質(zhì)中提取的有效部位制成的制劑，未在國(guó)內(nèi)上市銷售的中藥、天然藥物注射劑。以上情況，由于其物質(zhì)基礎(chǔ)較傳統(tǒng)中藥發(fā)生了明顯改變，或應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)較少，為全面考察受試物的重復(fù)給藥毒性反應(yīng)情況，應(yīng)采用嚙齒類和非嚙齒類兩種動(dòng)物進(jìn)行重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。2．未在國(guó)內(nèi)上市銷售的由中藥、天然藥物組成的非注射給藥的復(fù)方制劑可先進(jìn)行一種動(dòng)物（嚙齒類）的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有明顯毒性時(shí)，為進(jìn)一步研究毒性情況，再采用第二種動(dòng)物（非嚙齒類）進(jìn)行試驗(yàn)。若該類處方中含有毒性藥材[見(jiàn)注釋（四）]、無(wú)法定標(biāo)準(zhǔn)藥材或有十八反、十九畏等配伍禁忌時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行兩種動(dòng)物（嚙齒類和非嚙齒類）的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。天然藥物組成的非注射給藥的復(fù)方制劑臨床試驗(yàn)前采用嚙齒類和非嚙齒類兩種動(dòng)物進(jìn)行重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。3．改變國(guó)內(nèi)已上市銷售藥品給藥途徑（不包括由非注射劑改為注射劑）的制劑、不改變給藥途徑的非注射給藥改劑型制劑和改工藝制劑，建議增設(shè)一個(gè)原給藥途徑、原劑型或原工藝的高劑量對(duì)照組，先進(jìn)行一種動(dòng)物（嚙齒類）的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。如發(fā)現(xiàn)與原給藥途徑、原劑型或原工藝制劑不同的明顯毒性反應(yīng)或更嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)行另一種動(dòng)物（非嚙齒類）的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。4．增加新的適應(yīng)癥或者功能主治的品種如需延長(zhǎng)用藥期限或增加劑量者，應(yīng)結(jié)合原品種的申報(bào)資料及處方組成的情況，確定是否需進(jìn)行重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。（四）中藥毒性藥材品種毒性藥材：系指收入國(guó)務(wù)院《醫(yī)療用毒性藥品管理辦法》的中藥品種。即：砒石、砒霜、水銀、生馬錢子、生川烏、生草烏、生白附子、生附子、生半夏、生南星、生巴豆、斑蝥、青娘蟲(chóng)、紅娘蟲(chóng)、生甘遂、生狼毒、生藤黃、生千金子、生天仙子、鬧羊花、雪上一枝蒿、紅升丹、白降丹、蟾酥、洋金花、紅粉、輕粉、雄黃。另外，凡在近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的有毒性作用的藥材（原材料）或在復(fù)方中含有明顯有毒組分的，均按毒性藥材處理。七、附錄（一）試驗(yàn)期限支持藥物臨床試驗(yàn)最長(zhǎng)臨床試驗(yàn)期限重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的最短期限嚙齒類動(dòng)物非嚙齒類動(dòng)物2周2周2周2周～6個(gè)月同臨床試驗(yàn)同臨床試驗(yàn)>6個(gè)月6個(gè)月9個(gè)月1、2支持藥物上市申請(qǐng)臨床擬用期限嚙齒類動(dòng)物非嚙齒類動(dòng)物2周1個(gè)月1個(gè)月2周～1個(gè)月3個(gè)月3個(gè)月1個(gè)月～3個(gè)月6個(gè)月6個(gè)月>3個(gè)月6個(gè)月9個(gè)月1、2注：非嚙齒類動(dòng)物不超過(guò)6個(gè)月期限的試驗(yàn)可接受情況：當(dāng)免疫原性或耐受性問(wèn)題使更長(zhǎng)期限的試驗(yàn)難以進(jìn)行時(shí)；重復(fù)、短期用藥（即便臨床試驗(yàn)期限6個(gè)月以上）的疾病，如偏頭痛、勃起障礙、單純性皰疹等的反復(fù)間歇給藥時(shí)；擬用于危及生命的疾?。ㄈ邕M(jìn)展性疾病、輔助使用的腫瘤化療藥）時(shí)。2．如果兒童為主要擬用藥人群，而已有毒理學(xué)或藥理學(xué)研究結(jié)果提示可能發(fā)生發(fā)育毒性，應(yīng)考慮在幼年動(dòng)物上進(jìn)行長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。該試驗(yàn)應(yīng)采用合適年齡和種系的動(dòng)物，試驗(yàn)觀察指標(biāo)應(yīng)針對(duì)發(fā)育方面的毒性，試驗(yàn)期限犬12個(gè)月、大鼠6個(gè)月。12個(gè)月的犬試驗(yàn)期限應(yīng)涵蓋其發(fā)育的全過(guò)程。這些幼年動(dòng)物的長(zhǎng)期試驗(yàn)可用于替代標(biāo)準(zhǔn)的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)和單獨(dú)的幼年動(dòng)物試驗(yàn)。（二）檢測(cè)指標(biāo)項(xiàng)目類別指標(biāo)1.臨床觀察外觀、體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便性狀、給藥局部反應(yīng)、死亡情況等。2.攝食量、體重、眼科檢查3.體溫和心電圖檢測(cè)（非嚙齒動(dòng)物）4.血液學(xué)檢測(cè)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞容積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類、血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間等。5.血液生化學(xué)檢測(cè)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、堿性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮(尿素)、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽紅素、總膽固醇、甘油三酯、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、鉀離子濃度、氯離子濃度、鈉離子濃度。6.尿液觀察和分析尿液外觀、比重、pH值、尿糖、尿蛋白、尿膽紅素、尿膽原、酮體、潛血、白細(xì)胞。7．組織病理學(xué)檢查的臟器組織=1\*GB2⑴需稱重并計(jì)算臟器系數(shù)的器官腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、胸腺、脾臟、睪丸、附睪、卵巢、子宮、甲狀腺（含甲狀旁腺）1。=2\*GB2⑵需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查的組織或器官腎上腺、主動(dòng)脈、骨（股骨）、骨髓（胸骨）、腦（至少3個(gè)水平）、盲腸、結(jié)腸、子宮和子宮頸、十二指腸、附睪、食管、眼、膽囊（如果有）、哈氏腺（如果有）、心臟、回腸、空腸、腎臟、肝臟、肺臟（附主支氣管）、淋巴結(jié)（一個(gè)與給藥途徑相關(guān)，另一個(gè)在較遠(yuǎn)距離）、乳腺、鼻甲2、卵巢和輸卵管、胰腺、垂體、前列腺、直腸、唾液腺、坐骨神經(jīng)、精囊（如果有）、骨骼肌、皮膚、脊髓（3個(gè)部位：頸椎、中段胸椎、腰椎）、脾臟、胃、睪丸、胸腺（或胸腺區(qū)域）、甲狀腺（含甲狀旁腺）、氣管、膀胱、陰道、所有大體觀察到異常的組織、組織腫塊和給藥部位。注：1.僅在非嚙齒類動(dòng)物稱重。2.針對(duì)吸入給藥的給藥制劑。附件4藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述刺激性、過(guò)敏性、溶血性是指藥物制劑經(jīng)皮膚、粘膜、腔道、血管等非口服途徑給藥，對(duì)用藥局部產(chǎn)生的毒性（如刺激性和局部過(guò)敏性等）和/或?qū)θ懋a(chǎn)生的毒性（如全身過(guò)敏性和溶血性等），為臨床前安全性評(píng)價(jià)的組成部分。藥物的原形及其代謝物、輔料、有關(guān)物質(zhì)及理化性質(zhì)（如pH值、滲透壓等）均有可能引起刺激性和/或過(guò)敏性和/或溶血性的發(fā)生，因此藥物在臨床應(yīng)用前應(yīng)研究其制劑在給藥部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示臨床應(yīng)用時(shí)可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、毒性靶器官、安全范圍。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物、化學(xué)藥物。二、基本原則（一）試驗(yàn)管理根據(jù)《藥品注冊(cè)管理辦法》，藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究必須執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（GLP）。（二）隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)的原則。（三）整體性、綜合性原則應(yīng)根據(jù)受試物特點(diǎn)，充分考慮和結(jié)合藥學(xué)、藥效學(xué)、其他毒理學(xué)及擬臨床應(yīng)用情況等綜合評(píng)價(jià)，體現(xiàn)整體性、綜合性的原則。（四）具體問(wèn)題具體分析應(yīng)在遵循安全性評(píng)價(jià)普遍規(guī)律的基礎(chǔ)上，具體問(wèn)題具體分析，結(jié)合受試物的特點(diǎn)，在闡明其研究方法或技術(shù)科學(xué)、合理的前提下進(jìn)行規(guī)范性試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面分析評(píng)價(jià)。三、基本內(nèi)容（一）受試物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1．受試物中藥、天然藥物：受試物應(yīng)能充分代表臨床試驗(yàn)樣品或上市藥品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由。應(yīng)注明受試物的名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，否則應(yīng)提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質(zhì)量穩(wěn)定性及均勻性。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、規(guī)格及生產(chǎn)單位?；瘜W(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對(duì)穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。受試物應(yīng)注明名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報(bào)告。試驗(yàn)中所用輔料、溶媒等應(yīng)標(biāo)明批號(hào)、規(guī)格和生產(chǎn)單位，并符合試驗(yàn)要求。在藥品研發(fā)的過(guò)程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變化，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性研究?；瘜W(xué)藥物試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析，并提供樣品分析報(bào)告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析。2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物應(yīng)符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定的等級(jí)要求，并具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證。動(dòng)物種屬的選擇根據(jù)觀察指標(biāo)和模型合理性確定，如刺激性試驗(yàn)應(yīng)選擇與人類皮膚、粘膜等反應(yīng)比較相近的動(dòng)物，如兔、小型豬等。（二）刺激性試驗(yàn)刺激性是指非口服給藥制劑給藥后對(duì)給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥反應(yīng)，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性試驗(yàn)是觀察動(dòng)物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)。1．給藥部位一般應(yīng)選擇與臨床給藥相似的部位，并觀察對(duì)可能接觸到受試物的周圍組織的影響。2．給藥途徑一般應(yīng)與臨床用藥途徑一致，否則應(yīng)加以說(shuō)明。3．對(duì)照組以溶媒和/或賦形劑作為陰性對(duì)照，必要時(shí)采用已上市制劑作對(duì)照。4．給藥濃度、劑量與體積可選擇幾種不同濃度，至少應(yīng)包括臨床擬用最高濃度。如果技術(shù)上難以達(dá)到臨床擬用最高濃度，如皮膚刺激性試驗(yàn)，在給藥面積不變的情況下，可通過(guò)改變給藥頻次進(jìn)行劑量調(diào)整，而不應(yīng)通過(guò)增加厚度來(lái)達(dá)到增加給藥量的目的。設(shè)計(jì)給藥濃度、劑量與體積時(shí)，應(yīng)根據(jù)臨床用藥情況，并考慮受試動(dòng)物給藥部位的解剖和生理特點(diǎn)，保證受試物在給藥部位的有效暴露。5．給藥頻率與周期應(yīng)根據(jù)臨床用藥情況，一般給藥周期最長(zhǎng)不超過(guò)4周。建議進(jìn)行恢復(fù)期觀察，同時(shí)評(píng)價(jià)給藥局部及周圍組織毒性反應(yīng)的可逆性。6．觀察指標(biāo)6.1肉眼觀察應(yīng)詳細(xì)描述局部反應(yīng)，包括紅斑、水腫、充血程度及范圍，計(jì)分表示。同時(shí)觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、行為、體征等。6.2組織病理學(xué)檢查應(yīng)詳細(xì)描述給藥部位的病理變化，并半定量分析、判斷。提供相應(yīng)的組織病理學(xué)照片。7．試驗(yàn)方法具體可參考附錄中常用方法和相關(guān)文獻(xiàn)。8．統(tǒng)計(jì)方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮囼?yàn)方法選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法。（三）過(guò)敏性試驗(yàn)過(guò)敏性又稱超敏反應(yīng)，指機(jī)體受同一抗原再刺激后產(chǎn)生的一種表現(xiàn)為組織損傷或生理功能紊亂的特異性免疫反應(yīng)。過(guò)敏性試驗(yàn)是觀察動(dòng)物接觸受試物后的全身或局部過(guò)敏反應(yīng)。1．試驗(yàn)方法進(jìn)行何種過(guò)敏性試驗(yàn)應(yīng)根據(jù)藥物特點(diǎn)、臨床適應(yīng)癥、給藥方式、過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生機(jī)制、影響因素等確定。通常局部給藥發(fā)揮全身作用的藥物（如注射劑和透皮吸收劑等）需考察Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)，如注射劑需進(jìn)行主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)（ActiveSystemicAnaphylaxis,ASA）和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)（PassiveCutaneousAnaphylaxis,PCA），透皮吸收劑需進(jìn)行主動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)（ActiveCutaneousAnaphylaxis,ACA）。吸入途徑藥物應(yīng)采用豚鼠吸入誘導(dǎo)和刺激試驗(yàn)。粘膜給藥應(yīng)結(jié)合受試物的特點(diǎn)參照經(jīng)皮給藥過(guò)敏性試驗(yàn)方法進(jìn)行。如受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)生其他過(guò)敏反應(yīng)的化合物相同或相似者建議考慮采取適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)方法以考察其是否能引起其他過(guò)敏反應(yīng)（如光過(guò)敏性反應(yīng)等）。Ⅱ和Ⅲ型過(guò)敏反應(yīng)可結(jié)合在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中觀察，如癥狀、體征、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及相關(guān)的病理組織學(xué)改變等。經(jīng)皮給藥制劑（包括透皮劑）應(yīng)進(jìn)行IV型過(guò)敏反應(yīng)試驗(yàn)，包括豚鼠最大化試驗(yàn)（Guinea-PigMaximizationTest,GPMT）或豚鼠封閉斑貼試驗(yàn)（BuehlerTest）或其他合理的試驗(yàn)方法如小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（MurineLocalLymphNodeAssay,LLNA）等。2．劑量設(shè)計(jì)建議選擇多個(gè)劑量，至少應(yīng)包括臨床最高給藥濃度。3．對(duì)照組應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，必要時(shí)采用已上市制劑作對(duì)照。4．統(tǒng)計(jì)方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮囼?yàn)方法選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法。（四）溶血性試驗(yàn)溶血性是指藥物制劑引起的溶血和紅細(xì)胞凝聚等反應(yīng)。溶血性反應(yīng)包括免疫性溶血與非免疫性溶血。溶血性試驗(yàn)是觀察受試物是否能夠引起溶血和紅細(xì)胞凝聚等。1.適用范圍凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他局部用藥制劑均應(yīng)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)。2.試驗(yàn)方法溶血試驗(yàn)包括體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)，常規(guī)采用體外試管法評(píng)價(jià)藥物的溶血性，若結(jié)果為陽(yáng)性，應(yīng)與相同給藥途徑的上市制劑進(jìn)行比較研究，必要時(shí)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)或結(jié)合重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)，應(yīng)注意觀察溶血反應(yīng)的有關(guān)指標(biāo)（如網(wǎng)織紅細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)、膽紅素、尿蛋白，腎臟、脾臟、肝臟繼發(fā)性改變等），如出現(xiàn)溶血時(shí)，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步研究。（五）光毒性（光刺激性）試驗(yàn)光敏反應(yīng)是用藥后皮膚對(duì)光線產(chǎn)生的不良反應(yīng)，包括光毒性反應(yīng)和光過(guò)敏反應(yīng)，均由受試物所含的感光物質(zhì)引起，產(chǎn)生光敏反應(yīng)需同時(shí)滿足以下條件：吸收自然光線（波長(zhǎng)范圍為290～700nm），吸收UV/可見(jiàn)光后產(chǎn)生活性物質(zhì)，在光暴露組織（如皮膚，眼睛等）有充分的暴露。光毒性是由光誘導(dǎo)的非免疫性的皮膚對(duì)光的反應(yīng)，是指藥物吸收的光能量在皮膚中釋放導(dǎo)致皮膚損傷的作用。光毒性反應(yīng)是光敏反應(yīng)中最常見(jiàn)的一種反應(yīng)，其臨床表現(xiàn)與曬傷相似，表現(xiàn)為紅斑、水腫、皮膚瘙癢和色素沉著，嚴(yán)重者可產(chǎn)生局部壞死、潰爛或表皮脫落。皮膚給藥光毒性試驗(yàn)的目的是觀察受試物接觸皮膚或應(yīng)用后遇光照射是否有光毒性反應(yīng)。若受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或某些組成（包括藥物和賦形劑）文獻(xiàn)報(bào)道有光毒性作用，或其化學(xué)結(jié)構(gòu)與已知光敏劑相似，或曾有報(bào)道其具有或可疑具有光毒性作用，建議進(jìn)行皮膚給藥光毒性試驗(yàn)。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（一）詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法，受試物、試驗(yàn)分組、給藥劑量、動(dòng)物數(shù)、用藥次數(shù)、毒性反應(yīng)、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)情況及時(shí)間、死亡動(dòng)物數(shù)等，對(duì)不同劑量（或濃度）下某種反應(yīng)發(fā)生情況及嚴(yán)重程度進(jìn)行表述，分析毒性反應(yīng)的量效關(guān)系和可能的時(shí)效關(guān)系及可逆性，判斷藥物相關(guān)性，提供安全范圍等。（二）刺激性試驗(yàn)應(yīng)重視給藥濃度、體積、速度、次數(shù)與有效暴露時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響。注射劑的給藥濃度、速度及次數(shù)與藥物的血管刺激性密切相關(guān)，建議根據(jù)受試物的性質(zhì)、臨床用藥情況，采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎM最大可能地暴露毒性，如可適當(dāng)增加濃度，或通過(guò)增加給藥次數(shù)等。過(guò)敏試驗(yàn)應(yīng)注意給藥劑量和給藥速度對(duì)過(guò)敏反應(yīng)的影響，靜脈注射激發(fā)應(yīng)保證足量、一次性快速地將受試物注射入動(dòng)物體內(nèi)。經(jīng)皮給藥的受試物應(yīng)保證在局部的有效暴露濃度和時(shí)間。（三）重視組織病理學(xué)檢查，并提供相應(yīng)的照片。（四）由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的局限性，如目前仍無(wú)理想的Ⅱ和Ⅲ型過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型；光過(guò)敏性動(dòng)物模型的臨床意義尚不明確等，因此一些藥物的過(guò)敏性臨床前評(píng)價(jià)可采取靈活的方式，建議采用多種方法如BT、小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)等。（五）在溶血性試驗(yàn)中，若出現(xiàn)紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象，應(yīng)判定是真凝聚還是假凝聚。若體外出現(xiàn)可疑溶血現(xiàn)象，應(yīng)采用其他方法進(jìn)一步試驗(yàn)，以確定或排除受試物的溶血作用。利用分光光度法進(jìn)行溶血性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)注意離心速度及溫度對(duì)結(jié)果的影響。此外，因不同的注射劑顏色及深淺不同，若其色澤對(duì)血紅素的最大吸收有干擾，則應(yīng)注意排除非藥物因素。（六）結(jié)合藥物的制劑特點(diǎn)、藥理作用其他毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果、以及臨床信息等綜合分析和評(píng)價(jià)。五、參考文獻(xiàn)1．FDAGuidanceforIndustrySkinirritationandsensitizationtestingofgenerictransdermaldrugproducts．2．FDAGuidanceforIndustryPhotosafetytesting．3．FDAGuidanceforIndustryImmunotoxicologyevaluationofinvestigationnewdrug．4.EPAHealtheffectstestguidelinesOPPTS870.7800Immunotoxicity．5．EPAHealtheffectstestguidelinesOPPTS870.2500Acutedermalirritation．6．EPAHealtheffectstestguidelinesOPPTS870.2600Skinsensitization．7．OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No406,July1992)．8．EPAHealtheffectstestguidelinesOPPTS870.2400Acuteeyeirritation．9．EMANon-clinicallocaltolerancetestingofmedicinalproducts．10．ISO10993-10:2002(E)Biologicalevaluationofmedicaldevices-Part10-Testsforirritationanddelayed-typehypersensitivity．11．日本厚生省日本新藥毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則1989版．12．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局新藥（西藥）臨床及臨床前研究指導(dǎo)原則匯編．13．徐叔云卞如濂陳修藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)．14．陳奇中藥藥理研究方法學(xué)．15．皮膚用藥的毒性試驗(yàn)和粘膜用藥的毒性試驗(yàn).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局《中藥新藥研究指南》1994年209，213．16．袁伯俊王治喬皮膚用藥毒性試驗(yàn).《新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐》北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997年152．17．劉建文其他毒性試驗(yàn).《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第三版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002年234．18.PrinciplesandmethodsofToxicology.Fourthedition,editedbyA.WallaceHayes,Taylor&Francis,Philadelphia.2001.19.EMA；NoteforGuidanceonNon-clinicalLocalToleranceTestingofMedicinalProducts.20．FDA；GuidanceforIndustryBotanicalDrugProducts．21．FDA；GuidanceforIndustryLabelingGuidanceforOTCTopicalDrugProductsfortheTreatmentofVaginalYeastInfections(VulvovaginalCandidiasis)．22.FDA；GuidanceforIndustryBacterialVaginosis-DevelopingAntimicrobialDrugsforTreatment．23．PreclinicalDevelopmentHandBook-Toxicology.EditedbyShayneCoxGad,Copyright?2008byJohnWiley&Sons,Inc．六、附錄本附錄收載的試驗(yàn)方法僅供參考。應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的科學(xué)合理的試驗(yàn)方法，不僅限于此附錄。（一）刺激性試驗(yàn)方法1．血管刺激性試驗(yàn)通常選兔，每組不少于3只。設(shè)生理鹽水和/或溶媒對(duì)照，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。給藥部位根據(jù)臨床擬用途徑確定，一般選用耳緣靜脈。可設(shè)多個(gè)給藥濃度，至少包括臨床最大擬用濃度，給藥容積、速率和期限一般根據(jù)臨床擬用法用量，并根據(jù)動(dòng)物情況進(jìn)行調(diào)整，給藥體積不可太低。多次給藥時(shí)間一般不超過(guò)7天。根據(jù)受試藥物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間和剖檢時(shí)間，至少觀察72小時(shí)。應(yīng)對(duì)部分動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。恢復(fù)期動(dòng)物根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察14～21天進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷受試物的血管刺激性及刺激性恢復(fù)情況。2.肌肉刺激性試驗(yàn)通常選兔，也可選用大鼠。每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對(duì)照或/和溶媒對(duì)照組，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間,觀察期結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)部分動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。分別在左右兩側(cè)股四頭肌內(nèi)注射給藥，觀察給藥后不同時(shí)間的局部反應(yīng)，如充血、紅腫等。給藥后48～72小時(shí)剖檢觀察注射局部的刺激反應(yīng)，按表1計(jì)算相應(yīng)的反應(yīng)級(jí)，并進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。根據(jù)表1計(jì)算肌肉刺激性總反應(yīng)級(jí)，計(jì)算平均值，按表2判定刺激等級(jí)。若各股四頭肌反應(yīng)級(jí)的最高與最低之差大于2，應(yīng)另取動(dòng)物重新試驗(yàn)。表1肌肉刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)刺激反應(yīng)反應(yīng)級(jí)無(wú)明顯變化0輕度充血，范圍在0.5×1.0cm以下1中度充血，范圍在0.5×1.0cm以上2重度充血，伴有肌肉變性3出現(xiàn)壞死，有褐色變性4出現(xiàn)廣泛性壞死5表2平均分值和等級(jí)平均分值等級(jí)0.0～0.4無(wú)0.5～1.4輕微1.5～2.4輕度2.5～3.4中度3.5～4.4重度4.5及以上嚴(yán)重3．皮膚刺激性試驗(yàn)通常選兔、小型豬，否則應(yīng)闡明合理性。兔每組不低于4只。一般應(yīng)進(jìn)行相同備皮面積的正常皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗(yàn)。采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，將受試物直接涂于備皮處，敷料覆蓋固定。貼敷時(shí)間至少4小時(shí)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時(shí)間相同，給藥期限一般不超過(guò)4周。破損皮膚試驗(yàn)中皮膚破損程度以損傷表皮層為限。在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察皮膚反應(yīng)。根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間。通常單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)為去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時(shí)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，為每次去除藥物后1小時(shí)以及每次給藥前，以及末次貼敷去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時(shí)。如存在持久性損傷，有必要延長(zhǎng)觀察期限以評(píng)價(jià)恢復(fù)情況和時(shí)間，延長(zhǎng)期一般不超過(guò)2周。對(duì)出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性的動(dòng)物應(yīng)在觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并提供病理照片。單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，計(jì)算各組每一時(shí)間點(diǎn)皮膚反應(yīng)積分的平均值，按表3進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，首先計(jì)算每一觀察時(shí)間點(diǎn)各組積分均值，然后計(jì)算觀察期限內(nèi)每天每只動(dòng)物刺激積分均值，按表4進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。表3皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)刺激反應(yīng)分值紅斑無(wú)紅斑0輕度紅斑（勉強(qiáng)可見(jiàn)）1中度紅斑（明顯可見(jiàn)）2重度紅斑3紫紅色紅斑到輕度焦痂形成4水腫無(wú)水腫0輕度水腫（勉強(qiáng)可見(jiàn)）1中度水腫（明顯隆起）2重度水腫（皮膚隆起1mm，輪廓清楚）3嚴(yán)重水腫（皮膚隆起1mm以上并有擴(kuò)大）4最高總分值8表4皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分值評(píng)價(jià)0～0.49無(wú)刺激性0.5～2.99輕度刺激性3.0～5.99中度刺激性6.0～8.00重度刺激性4.粘膜刺激性試驗(yàn)4.1眼刺激性試驗(yàn)通常選兔，每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。動(dòng)物眼睛滴入受試物，保證藥物充分暴露。給藥期限應(yīng)根據(jù)臨床擬用方法確定。多次給藥時(shí)每天給藥次數(shù)應(yīng)不少于臨床用藥頻率。應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠^察時(shí)間。通常單次給藥為給藥后1、2、4、24、48和72小時(shí)；多次給藥眼刺激試驗(yàn)為每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時(shí)。如存在持久性損傷，有必要延長(zhǎng)觀察期限，一般不超過(guò)21天。一般采用裂隙燈進(jìn)行眼刺激反應(yīng)檢查，也可根據(jù)刺激性反應(yīng)情況采用其他的合適器械。在整個(gè)觀察過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行熒光素鈉染色檢查。每次檢查都應(yīng)記錄眼部異常反應(yīng)，根據(jù)表5計(jì)算分值。根據(jù)表6判斷刺激程度。表5眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)眼刺激反應(yīng)分值角膜無(wú)混濁0散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見(jiàn)1半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清2出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細(xì)節(jié)不清，瞳孔大小勉強(qiáng)可見(jiàn)3角膜不透明，虹膜無(wú)法辨認(rèn)4虹膜正常0皺褶明顯加深、充血、腫脹，角膜周圍輕度充血，瞳孔對(duì)光仍有反應(yīng)1出血/肉眼可見(jiàn)壞死/對(duì)光無(wú)反應(yīng)（或其中一種）2結(jié)膜充血（指瞼結(jié)膜和球結(jié)膜）血管正常0血管充血呈鮮紅色1血管充血呈深紅色，血管不易分辨2彌漫性充血呈紫紅色3水腫無(wú)水腫0輕微水腫（含眼瞼）1明顯水腫伴部分眼瞼外翻2水腫至眼瞼近半閉合3水腫至眼瞼超過(guò)半閉合4分泌物無(wú)分泌物0少量分泌物1分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分泌物使整個(gè)眼區(qū)潮濕或粘著3最大總積分16表6眼刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分值評(píng)價(jià)0~3無(wú)刺激性4~8輕度刺激性9~12中度刺激性13~16重度刺激性4.2滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗(yàn)可選用兔、豚鼠或大鼠。給藥后觀察動(dòng)物全身狀況（如呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)）及局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀）等。單次給藥24小時(shí)后或多次給藥停藥后24小時(shí)處死動(dòng)物，觀察呼吸道局部（鼻、喉、氣管、支氣管）粘膜組織有無(wú)充血、紅腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。4.3陰道刺激性試驗(yàn)通常選用大鼠、兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動(dòng)物種屬的最大給藥量。給藥頻率根據(jù)臨床應(yīng)用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少4小時(shí)。觀察內(nèi)容：陰道部位、臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和陰道分泌物（如血、粘液）等，給藥后動(dòng)物死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無(wú)充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行陰道和生殖系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查等。4.4直腸刺激性試驗(yàn)通常選兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動(dòng)物種屬的最大可行量。給藥頻率根據(jù)臨床擬用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少2~4小時(shí)，必要時(shí)可封閉一定時(shí)間。觀察內(nèi)容：包括肛門區(qū)域和肛門括約肌，給藥后臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和糞便（如血、粘液），給藥后死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無(wú)充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行肛周組織的病理組織學(xué)檢查。4.5口腔用藥、滴耳劑等刺激性試驗(yàn)可參照上述試驗(yàn)，給藥途徑為口腔、外耳道給藥，觀察對(duì)口腔和喉粘膜，以及對(duì)外耳道和鼓膜等的影響?？谇挥盟幗ㄗh用金黃倉(cāng)鼠，觀察受試物對(duì)頰粘膜的刺激性。5．皮膚給藥光毒性試驗(yàn)成年白色豚鼠，雌雄各半。每組動(dòng)物數(shù)至少6只。應(yīng)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床用藥濃度。試驗(yàn)前動(dòng)物備皮涂敷藥物。給藥30分鐘后覆蓋固定，UV光源照射（UVA波長(zhǎng)為320-400nm，如含UVB，其劑量不得超過(guò)0.1J/cm2）。試驗(yàn)結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表7計(jì)算評(píng)分。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和≥2的動(dòng)物數(shù)≥1只時(shí)，判為受試物具有光毒性。表7皮膚反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)紅斑和焦痂形成分值水腫形成分值無(wú)紅斑0無(wú)水腫0非常輕的紅斑，勉強(qiáng)可見(jiàn)1非常輕度水腫，勉強(qiáng)可見(jiàn)1明顯的紅斑2輕度水腫（邊緣清晰）2中度至重度的紅斑3中度水腫（皮膚隆起約1mm）3重度紅斑（鮮紅色）至輕度焦痂形成（深層損傷）4重度水腫（皮膚隆起大于1mm，并超過(guò)涂受試物的區(qū)域）4（二）過(guò)敏性試驗(yàn)方法1．主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)（ASA）通常選用體重為300400克的豚鼠。每組動(dòng)物數(shù)至少6只。設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床擬用最高劑量或濃度。陰性對(duì)照組給予同體積的溶媒，陽(yáng)性對(duì)照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽(yáng)性物質(zhì)。選擇容易產(chǎn)生抗體的給藥途徑，如腹腔、靜脈或皮下注射，隔日一次，共給藥3次，給藥體積0.5ml，末次注射后第14天、第21天分別快速靜脈注射致敏劑量的2倍進(jìn)行攻擊。即刻觀察動(dòng)物反應(yīng)至30分鐘，包括癥狀的出現(xiàn)及消失時(shí)間，一般應(yīng)觀察3小時(shí)。致敏期間每日觀察動(dòng)物的癥狀，首末次致敏和激發(fā)當(dāng)日測(cè)定動(dòng)物體重。按表9判斷過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生程度，計(jì)算發(fā)生率。表8過(guò)敏反應(yīng)癥狀0正常7呼吸急促14步態(tài)不穩(wěn)1不安寧8排尿15跳躍2豎毛9排糞16喘息3發(fā)抖10流淚17痙攣4搔鼻11呼吸困難18旋轉(zhuǎn)5噴嚏12哮鳴音19潮式呼吸6咳嗽13紫癜20死亡表9全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)0-過(guò)敏