動物細胞的微囊化培養(yǎng)

第四章動物細胞的微囊化培養(yǎng)動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!

動物細胞雖可像微生物細胞一樣，在人工控制條件的生物反應器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細胞相比，有顯著差別：①動物細胞比微生物細胞大得多，無細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應環(huán)境能力差②倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時須用抗生素③培養(yǎng)過程需氧量少(氧傳質(zhì)系數(shù)KLa大于10h-1即可滿足每毫升107個細胞的生長)④培養(yǎng)過程中細胞相互粘連以集群形式存在⑤原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高。

動物細胞培養(yǎng)的一般特點動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的困難1、動物細胞生長速率慢，產(chǎn)物的生產(chǎn)率也低，從而造成產(chǎn)物濃度也低。2、動物細胞培養(yǎng)基成分復雜，價格昂貴。3、動物細胞沒有細胞壁，易受機械攪拌所引起的剪切力的影響。4、常規(guī)的細胞培養(yǎng)方法也不太適用于大規(guī)模培養(yǎng)。上述這些限制造成了大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)所需費用高，技術(shù)難度大（規(guī)模越大、影響也越大）。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!隨著生物工程的發(fā)展，使得很多原先只有動物體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可由重組微生物生產(chǎn)，如重組大腸桿菌表達和生產(chǎn)人胰島素和人生長激素。然而，由于微生物細胞缺乏蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾機制，由重組微生物產(chǎn)生的不少蛋白質(zhì)分子不具有所期待的生物學功能和活力。動物細胞的大規(guī)模的培養(yǎng)確有不小的困難，但它的優(yōu)點也是很明顯的、誘人的，關(guān)鍵是如何提高細胞在反應器內(nèi)的密度，提高細胞的穩(wěn)定性以及生產(chǎn)率。動物細胞的固定化以及培養(yǎng)是解決問題的有效途徑。優(yōu)缺點動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!微囊（Microcapsules）技術(shù)是一種利用天然的或合成的高分子成膜材料（囊材）把液體或固體（囊心物）包嵌形成直徑1~5000μm（通常為5~250μm）微小膠囊的技術(shù)。

微囊的制備技術(shù)起源于20世紀50年代，在70年代中期得到迅猛發(fā)展，并且出現(xiàn)了許多微囊化產(chǎn)品和工藝。微囊技術(shù)可廣泛用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥、飼料、化妝品、染料等領(lǐng)域。

動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!2、定位聚合反應

在定位聚合反應中，高分子單體和預聚物置于油相中，通過提高溫度或者使用具有表面活性的酸性催化劑來引發(fā)界面聚合反應。如果活性成分為固體，在單體或預聚物加入之前先將固體活性成分溶解在與水不互溶的有機溶劑中。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!4、微囊懸浮液噴霧干燥法微囊的懸浮液可用噴霧干燥制成微囊粒劑，一般需要另外的分散劑來滿足在水中再分散的需要。含有活性物質(zhì)和高分子的料漿也可進行噴霧干燥，使高分子在固體囊芯顆粒周圍形成膜或囊壁。活性物質(zhì)的料漿必須在合適的分散劑作用下先預磨成較細的顆粒。一旦噴霧干燥除去水分，就能得到粉粒狀產(chǎn)品，平均粒徑在100-300μm之間。粒徑大小取決于噴霧干燥器的尺寸、干燥室的噴嘴種類、料漿流量、干燥溫度等因素。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!6、溶劑蒸發(fā)法

需要微囊化的活性物質(zhì)和形成囊壁材料的高分子同時溶解在具有揮發(fā)性、與水不互溶的有機溶劑中，活性物質(zhì)和高分子也必須互不相溶。高分子和活性成分的溶液在表面活性劑的作用下預先乳化。然后通過加熱或減壓蒸餾除去溶劑，溶劑蒸發(fā)后，高分子被分離出來并在乳液粒子表面形成連續(xù)的膜。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!2）微載體

微載體細胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)貼壁依賴性細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對細胞無毒害作用的材料支撐的顆粒(微載體)，使細胞在微載體表面附著和生長，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細胞提供了極大的附著表面，1g微載體其比表面積可達6000cm2，從而可實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。

動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!采用微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點：

①比表面積大，單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高；②采用均勻懸浮培養(yǎng)，無營養(yǎng)物或產(chǎn)物梯度；③可用簡單顯微鏡觀察微載體表面的生長情況；④細胞收獲過程相對簡單，勞動強度??；⑤培養(yǎng)基利用率高，占地面積小；⑥放大容易，國外已有公司以1000L規(guī)模培養(yǎng)人的二倍體細胞來生產(chǎn)β-干擾素。但其缺點：是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細胞；接種密度高；微載體吸附力弱，不適合培養(yǎng)懸浮型細胞。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!①比表面積大，是實心微載體的幾倍甚至幾十倍；②細胞在孔內(nèi)生長，受到保護，剪切損傷??；③與包埋法相比，傳質(zhì)尤其是傳氧效果好；④兩種類型細胞都適用；⑤細胞三維生長，細胞密度是實心微載體10倍以上，有的可108個/mL；⑥適用于長期維持培養(yǎng)，細胞生長情況依然良好；⑦微載體濃度高，實心載體在培養(yǎng)液中濃度增大到一定時，細胞密度反而下降；而大孔微載體在濃度較高時，表面碰撞增加，能促使細胞在孔內(nèi)生長；⑧最適合于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預言，大孔微載體技術(shù)將成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!1）海藻酸鈣凝膠

海藻酸鈣凝膠包埋法是將動物細胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1mm內(nèi)含動物細胞的海藻酸鈣膠珠，分離洗滌后即可用于培養(yǎng)。此法操作時條件溫和，對活細胞損傷小。但固定后機械強度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細胞，國外已有專門的振動噴嘴設備可供使用。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!3）血纖維蛋白

將動物細胞與血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白，將動物細胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進細胞貼壁，因此兩種類型的細胞都適于培養(yǎng)。而且基質(zhì)高度多孔，允許大分子物質(zhì)的自由擴散。但機械強度差，對剪切力很敏感。

動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!四、微囊化

微囊化培養(yǎng)技術(shù)其要點是：在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)。生長介質(zhì)為1.4%海藻酸鈉溶液，半透膜由多聚賴氨酸形成。培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應器系統(tǒng)。實驗證實，采用批式和連續(xù)灌注式培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體，在7-27d微囊內(nèi)抗體濃度可達1250-5300mg/L。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!固定化方法的選擇一、培養(yǎng)規(guī)模

由于各種固定化系統(tǒng)可以獲得相同的細胞密度，且細胞的產(chǎn)率主要取決于細胞的擴散，因此反應器的體積是培養(yǎng)規(guī)模放大的主要決定因素。雖然微載體系統(tǒng)可以提供最大的單元操作，但其他系統(tǒng)也可以通過增加單元套數(shù)而獲得放大。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!三、所培養(yǎng)的細胞類型

大多數(shù)固定化系統(tǒng)都適用于貼壁型細胞的培養(yǎng)。而在吸附非貼壁型細胞時，由于吸附力弱，易出現(xiàn)細胞泄露。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!固定化培養(yǎng)存在的問題固定化細胞培養(yǎng)的細胞密度較一般懸浮培養(yǎng)高10-100倍，但同時也帶來了如何保證足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞問題。(2)細胞群體在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力的丟失或產(chǎn)物活性的降低依然是細胞培養(yǎng)領(lǐng)域深感棘手的問題。包埋在凝膠或微囊中死亡的細胞會對其他細胞產(chǎn)生污染和毒害作用。(3)培養(yǎng)基及固定化基質(zhì)價格昂貴，生產(chǎn)成本高居不下。尤其是高效的微載體細胞培養(yǎng)介質(zhì)，銷售價格一直呈上漲趨勢。(4)目前對細胞代謝和生長動力學的研究以及在線監(jiān)測水平還遠不足以設計出確定的優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)，從而導致昂貴培養(yǎng)基的浪費。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!節(jié)動物細胞的微囊化微囊化是固定化技術(shù)中的一種，是用一層親水性的半透膜將酶、輔酶、蛋白質(zhì)等生物大分子或動植物細胞包圍在珠狀的微囊里，從而使得酶等生物大分子和細胞不能從微囊里逸出，而小分子的物質(zhì)、培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)可以自由出入半透膜，達到催化或培養(yǎng)的目的。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!微囊化細胞的模式圖動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!二、動物細胞微囊化方法需滿足條件：1、微囊化的過程要溫和，快速，不損傷細胞，盡可能在液體狀態(tài)和生理條件下制備。2、微囊化所用的試劑和膜材料必須對細胞無毒害作用。3、微囊化所形成的膜必須能夠使營養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物自由通過，膜的孔徑可以控制。4、膜應具有足夠的機械強度以抵抗培養(yǎng)過程中的攪拌，不至于使微囊破裂動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!動物細胞與海藻酸溶液混合，經(jīng)過微囊化發(fā)生器滴入CaCl2溶液中，形成凝膠微珠，然后用聚賴氨酸溶液處理微球表面，最后再用檸檬酸去除微珠的鈣離子，這樣，微珠內(nèi)部的海藻酸成液態(tài)，動物細胞懸浮其中，而微珠表面由于受到聚賴氨酸的處理而不再溶解，形成一層薄膜，動物細胞就被這層膜包在微囊里了，形成細胞微囊。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!制備微囊化動物細胞要經(jīng)過以下幾步（海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊）

1、無菌收集動物細胞，離心后再生理鹽水洗滌。2、離心收集細胞，并加入海藻酸溶液混合均勻，使成懸浮液。3、將懸浮液裝入微囊發(fā)生器中制成微滴。4、微滴加到CaCl2溶液中形成微膠珠。5、凝膠珠用生理鹽水洗去殘留的CaCl2.6、凝膠珠懸浮于聚賴氨酸溶液中，使之形成膜。7、凝膠珠再用CaCl2溶液洗，用CHES緩沖液固化。8、凝膠珠用生理鹽水洗滌以后，再用ALG溶液處理。9、生理鹽水洗滌后的凝膠珠加0.05mg/l檸檬酸溶液處理，使半透膜內(nèi)的ALG成液態(tài)，然后用生理鹽水沖洗。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!微囊半透膜的孔徑是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、代謝物進行膜內(nèi)外交換、截留一定分子量蛋白在囊內(nèi)的關(guān)鍵，如何選擇是一重要問題。微囊的膜是多陰離子的海藻酸與多陽離子的聚賴氨酸相互作用而形成的。研究表明，此半透膜的孔徑主要由聚賴氨酸的分子量決定，一般來說用高分子量的聚賴氨酸(PLL)覆膜孔徑大，PLL分子量低、孔徑小，通常使用相對分子量為40000-80000的PLL。研究還表明，PLL溶液的濃度及處理時間、溶液的PH及使用溫度也都會影響膜的孔徑。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!細胞的活性在進行微囊化時要注意到保持動物細胞的存活率，這與微囊化時間的長短、溫度、溶液的pH、保持溶液等滲等都有著密切的關(guān)系，需特別注意。微囊化時動物細胞在海藻酸溶液中的初始濃度也與存活率有關(guān)，不同的細胞，所用濃度不同，一般在104～106個/ml動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!（2）脫乙酰幾丁質(zhì)/海藻酸鈉微囊用1g/L的脫乙酰幾丁質(zhì)（pH6.5)代替PLL/ALG法中的PLL，在脫乙酰幾丁質(zhì)與海藻酸鈉反應20min后，再用0.05mol/L檸檬酸鈉處理，使微囊內(nèi)重新液化。膜的孔徑受脫乙酰幾丁質(zhì)溶液的離子強度的影響，此法同樣也存在強度不夠的問題。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!（4）脫乙酰幾丁質(zhì)/羧甲基纖維素（CMC）微囊利用脫乙酰幾丁質(zhì)與CMC的靜電作用形成半透膜使細胞微囊化的方法。將含有細胞的羥甲基纖維素鈉鹽（CMC）溶液經(jīng)微囊發(fā)射器噴射入脫乙酰幾丁質(zhì)溶液中，反應2-5min，然后倒入磷酸緩沖液中以減少幾丁質(zhì)的粘度，用離心的方法收集微囊、培養(yǎng)。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!第二節(jié)微囊化細胞的培養(yǎng)動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!在微囊內(nèi)，很多動物細胞，不管是懸浮細胞還是貼壁細胞都能良好地生長。據(jù)報道，僅雜交瘤細胞就有100多種已被微囊化培養(yǎng)。重組成纖細胞HBS-1在貼壁生長時，細胞呈棱形單層生長，而微囊化后形態(tài)發(fā)生了很大的變化，由棱形變成了球形，并且呈三向?qū)嶓w生長，逐漸成團，與動物體內(nèi)的組織形態(tài)很相識，這可能反應了微囊的微環(huán)境比較接近動物體內(nèi)的環(huán)境。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!4、微囊的體積和工作總體積之比：通常在（1：10）～（1：2）的范圍內(nèi)。他們間的比值大則生產(chǎn)等量產(chǎn)品可減少生物反應器的體積。對大規(guī)模生產(chǎn)是非常有利的。5、可以加大攪拌速度和通氣量，但要注意不破壞微囊。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!一、生產(chǎn)藥物上的應用1、單克隆抗體的生產(chǎn)動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!3、干擾素的生產(chǎn)Jarvis和Grdina通過試劑和病毒方法誘導微囊化FS-1和Namalwa細胞生產(chǎn)干擾素，這兩種細胞在微囊中生產(chǎn)比懸浮培養(yǎng)或單層培養(yǎng)更旺盛，兩細胞在微囊中生產(chǎn)的干擾素與懸浮培養(yǎng)或單層培養(yǎng)的總產(chǎn)量相同。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!2、抗癌藥物的篩選微囊化的腫瘤細胞用于估價抗癌藥物對活體的作用。人的腫瘤細胞經(jīng)微囊化后注入小鼠腹腔中，服用受檢的抗癌藥，檢測微囊化的腫瘤細胞對藥物的反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗癌藥能穿透微囊的膜作用與微囊中的腫瘤細胞，抑制或殺滅的水平與其他體外或體內(nèi)測定的藥效一致。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!優(yōu)點：

①可防止細胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷.②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜，從而提高細胞密度和產(chǎn)物含量，并方便分離純化處理.缺點：①微囊制作復雜，成功率不高.②微囊內(nèi)死亡的細胞會污染正常產(chǎn)物.③收集產(chǎn)物必須破壁，不能實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化.

微囊化培養(yǎng)動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!微囊制備方法1、人工界面聚合法

此方法是將芯材物乳化或分散在一個有壁材的連續(xù)相中，然后在芯材物的表面通過單體聚合反應而形成微囊。參加聚合反應的單體，一種是水溶性的，另一種是油溶性的，它們分別位于囊心液滴的內(nèi)部和外部，并在囊心液滴的表面上反應形成聚合物薄膜。利用界面聚合法可以使疏水性材料的溶液或分散液微膠囊化，也可以使親水性材料的水溶液或分散液微膠囊化。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!3、凝聚法

在此工藝中，含有預分散活性物質(zhì)的陽離子高分子溶液與另一相反電荷的高分子溶液反應。一般使用明膠（陽離子）和阿拉伯膠（陰離子）。首先，在熱的明膠溶液中制備好囊芯物質(zhì)的懸浮液或乳液，接著加人稀釋的阿拉伯膠溶液，將pH值降至4.5以下，它促進了作為核芯的分散顆粒周圍明膠的凝固，當降低溫度時，明膠出現(xiàn)并形成軟的膠囊，接著加人醛類交聯(lián)劑（如戊二醛）使軟膠囊硬化，提高pH值至9并加熱。硬的膠囊可通過離心、過濾、噴霧干燥或其他方式分離出來。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!5、融解冷卻的分散液制微囊法

在此工藝中，囊芯材料分散在融解的石蠟中，低溫條件下在水中形成乳液，石蠟固化形成微膠囊壁。冷卻速度和攪拌條件決定了膠囊的形狀和大小。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!細胞的固定化培養(yǎng)方法

一、吸附

1）多孔陶瓷

美國某公司開發(fā)了一種完全自動化的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的核心是陶質(zhì)矩形蜂窩狀生物反應器。反應器構(gòu)型是一圓筒內(nèi)裝置有許多陶質(zhì)矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供一定的生長表面積，既可用于培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可用于培養(yǎng)貼壁依靠性細胞。該系統(tǒng)可以連續(xù)化生產(chǎn)蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，給分離純化帶來方便。而且細胞不用從培養(yǎng)基中分離，所以不必考慮梯度問題；當培養(yǎng)基高速循環(huán)時，可以保持相對恒定的營養(yǎng)物和氧濃度。增加套數(shù)即可實現(xiàn)放大。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!

微載體的直徑在60-250μm，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長基質(zhì)物質(zhì)，因而有利于細胞的粘附、鋪展和增殖。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!3）大孔微載體

人們?yōu)榱私鉀Q微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞易受機械損傷的缺陷以及能最大限度地擴大比表面積，開發(fā)了具有完全連通溝回的大孔微載體。大孔微載體將細胞固定在孔內(nèi)生長，因而與其他方法相比具有一系列優(yōu)點：

動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!二、包埋

將動物細胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動物細胞的方法稱為包埋法。

優(yōu)點：此法步驟簡便，條件溫和，負荷量大，細胞泄露少。因細胞嵌入在高聚物網(wǎng)格中而受到保護，細胞能抗機械剪切。但該法也有一定缺點，如擴散限制，并非所有細胞都處于最佳營養(yǎng)物濃度。

包埋法一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化。多孔凝膠是最常用的載體，用于動物細胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!2）瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細胞的瓊脂糖溶液分散到一個水不溶相中(如石蠟油)，形成直徑0.2mm凝膠微珠，移去石蠟油后，細胞即可進行培養(yǎng)。同海藻鈣一樣，瓊脂糖更適于培養(yǎng)懸浮細胞。盡管凝膠珠形成過程很復雜，目前放大體積不超過20L。但瓊脂糖凝膠無毒性，具有較大的空隙，可以允許大分子物質(zhì)自由擴散，因此該法非常適用于蛋白產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細胞和淋巴細胞生產(chǎn)單克隆抗體和白細胞介素。

動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!三、中空纖維

中空纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細管”即中空纖維給培養(yǎng)的細胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是無剪切、高傳質(zhì)、營養(yǎng)成分的選擇性滲入，使培養(yǎng)細胞和產(chǎn)物密度都可達到比較高的水平。缺點是膜的污染和堵塞，觀察困難，細胞生長或過量氣體產(chǎn)生會破壞纖維。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢是讓細胞在管束外空間生長，以達到更高的細胞培養(yǎng)密度。目前中空纖維反應器已進入工業(yè)化生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞來生產(chǎn)單克隆抗體。

動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!利用微囊包裹具有特定功能的組織細胞，形成免疫隔離的人工細胞，以此植入疾病動物或病人體內(nèi)。1980年報道了微囊化胰島移植治療糖尿病。他們將同種大鼠胰島用海藻酸-聚賴氨酸-聚乙烯亞胺包埋后植入鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠體內(nèi)，在未用免疫抑制劑的情況下，控制大鼠血糖正常達一年左右。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!二、培養(yǎng)方式

除了海藻酸鈣包埋法外，其他固定化基質(zhì)都是多孔型的，能允許大分子物質(zhì)自由出入，因此可實現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。在凝膠珠和微囊中可使蛋白產(chǎn)物積聚到很高的濃度，給后續(xù)的分離純化處理帶來方便，并大大降低了生產(chǎn)成本。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!四、制備方法的難易和成本由于固定化基質(zhì)類型比較復雜，因此各種固定化方法的成本很難比較。海藻酸鹽和瓊脂糖是以化學試劑形式出售；膠原珠是以無菌形式提供給使用者，以便于接種。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!固定化動物細胞培養(yǎng)的展望

固定化動物細胞培養(yǎng)工程發(fā)展的總方向是大型化、自動化、精巧化、低成本、高細胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。從國際上的發(fā)展趨勢看，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)主要有：（1）開發(fā)細胞培養(yǎng)反應器和培養(yǎng)系統(tǒng)；（2)開發(fā)培養(yǎng)貼壁細胞的載體；（3)開發(fā)微囊技術(shù)；（4)開發(fā)雜交、重組技術(shù)；（5)開發(fā)無血清和化學合成的培養(yǎng)基；（6)蛋白質(zhì)濃縮和提純技術(shù)。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!微囊化的神經(jīng)組織細胞

動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!一、微囊化概述人工細胞的概念由加拿大馬吉爾（McGill）大學T.M.S.Chang教授于1957年首次提出并應用具有半滲透性薄膜的微膠囊固定活體細胞或組織取得成功。由于微膠囊膜起到了類似細胞膜的作用,且固定后體系的形態(tài)和功能酷似活性細胞,所以稱之為“人工細胞”。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!

80年代初,Lim等人將微囊化技術(shù)與組織細胞移植相結(jié)合,制備了具有良好生物相容性的海藻酸鈉/聚賴氨酸(APA)微膠囊作為免疫隔離工具,包埋豬胰島細胞形成人工細胞,并移植入糖尿病大鼠體內(nèi),結(jié)果表明該人工細胞成功地調(diào)節(jié)了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被稱為人工胰腺.這一研究成果較好地解決了組織細胞移植過程的免疫排斥問題,避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用,為組織細胞移植治療神經(jīng)/內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供了新思路.動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!1、聚賴氨酸/海藻酸(PLL/ALG)微囊化（1）原理

海藻酸是以1，4鍵連接的聚醛酸，其主要成分是甘露糖醛酸和古羅糖醛酸。當它的水溶液以鈣鹽的形式存在時，則成凝膠狀態(tài)。用螯合劑將鈣離子去除后，海藻酸又回復到溶液狀態(tài)。海藻酸鈣凝膠用聚賴氨酸處理后，其接觸部分不再被螯合劑去鈣而溶解動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!（2）微囊化裝置及步驟動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!(3)影響微囊化的一些因素微囊半透明孔徑影響因素微囊的質(zhì)量影響因素細胞的活性影響因素動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!微囊的質(zhì)量海藻酸的純度、黏度及甘露糖醛酸和古羅糖醛酸的比例都會影響微囊的形成及機械性能。純度高、黏度高容易成囊。含古羅糖醛酸多的海藻酸容易成囊，機械性能好，不易破碎。因此在使用海藻酸時必須慎重地選擇。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!2、其它的微囊化方法（1）海藻酸鈣微囊以甲基纖維素代替海藻酸（PLL）的方法，將動物細胞與1.1%甲基纖維素的CaCL2溶液（1.3%）以1：3的比例混合，然后將混合物滴入0.75%的海藻酸鈉溶液中，反應15min后在液滴四周就形成了一層海藻酸鈣的膜，包圍動物細胞在囊內(nèi)，一般微囊直徑達2.5mm。此方法簡單，但強度不夠，容易破碎。動物細胞的微囊化培養(yǎng)共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!（3）PLL/脫乙酰幾丁質(zhì)/海藻酸鈉雙層膜微囊包有細胞的海藻酸鈉凝膠珠與脫乙酰幾丁