衛(wèi)生化學(xué)-熒光分析法

衛(wèi)生化學(xué)——熒光分析法第1頁/共58頁2第五

章熒光分析法Fluorometry第2頁/共58頁3概述某些化合物在受到光輻射后，除了吸收某種波長的光之外，還會發(fā)射比原來所吸收的波長更長的光—光致發(fā)光現(xiàn)象光致發(fā)光熒光磷光分子熒光原子熒光熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量分析的方法。第3頁/共58頁4第4頁/共58頁5FLU與UV-Vis的比較FLUUV-Vis光譜性質(zhì)發(fā)射光譜吸收光譜被測物的性質(zhì)很強(qiáng)的紫外-可見光吸收有紫外-可見光吸收靈敏度高，10-10～10-12g/ml一般選擇性高低但在光譜分析中，熒光分析法不及紫外-可見分光光度法普遍，這主要是由于有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)所決定的—能發(fā)熒光的物質(zhì)較少第5頁/共58頁6雙嘧達(dá)莫萘普生幾個常見的發(fā)熒光的藥物第6頁/共58頁7

黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)第7頁/共58頁8苯并(a)芘世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)是黃曲霉毒素、苯并芘和亞硝胺第8頁/共58頁9核黃素環(huán)丙沙星第9頁/共58頁10第一節(jié)熒光分析法的基本原理

一）、熒光的產(chǎn)生

１．分子內(nèi)部能量之間的關(guān)系物質(zhì)對光的選擇性吸收與分子內(nèi)量子化的內(nèi)部運(yùn)動緊密相關(guān)：

E總=E電+E振+E轉(zhuǎn)E電為電子運(yùn)動的能級；位于紫外可見光區(qū)域E振為分子振動的能級；主要用于紅外光譜分析E轉(zhuǎn)為分子轉(zhuǎn)動能級，很微弱，難以測到純粹的E轉(zhuǎn)一分子熒光的產(chǎn)生第10頁/共58頁11基態(tài)：電子自旋配對，多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示。三重態(tài)能級低于單重態(tài)(Hund規(guī)則)第11頁/共58頁122．分子的電子能級與激發(fā)過程

分子的電子能態(tài)的激發(fā)包含了電子從基態(tài)軌道躍遷到激發(fā)軌道，分子的能量隨著增加。

大多數(shù)分子含有偶數(shù)個電子，處于基態(tài)時，電子成對地填在能量的最低各軌道上。根據(jù)Pauling不相容原理：一個給定軌道的兩個電子，自旋方向一定相反，自旋量子數(shù)為1/2與-1/2，總自旋量子數(shù)S=0。

分子的多重性M=2S+1=1.

此種情形稱為單重基態(tài)(S0)，這些分子放在磁場中，沒有發(fā)生能級分裂。即基態(tài)沒有凈自旋?！娮榆壍赖?2頁/共58頁13當(dāng)基態(tài)的一個電子吸收光輻射后被激發(fā)到較高的電子能態(tài)時，通常電子不發(fā)生自旋方向的改變，此時兩個電子的自旋方向仍然相反，凈自旋s=0，這時分子處于激發(fā)單重態(tài)(S*)。某些情況下，電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，這時分子的兩個電子的自旋方向相同，自旋量子數(shù)都是1/2，總自旋量子數(shù)s=1，這時分子的多重性M=2S+1=3，稱為激發(fā)三重態(tài)(T*)。第13頁/共58頁14根據(jù)洪特規(guī)則(Hundprinciple)，處于分立軌上的非成對電子，平行自旋要比自旋成對更穩(wěn)定，因此，三重態(tài)總是比相應(yīng)的激發(fā)單重態(tài)具有更低的能量。3.

分子吸收輻射的特點(diǎn)分子吸收輻射是一種激發(fā)過程，根據(jù)波爾茲曼(Boltzmann)分布，當(dāng)分子吸收了紫外-可見光后，基態(tài)分子中的電子只能躍遷到激發(fā)單重態(tài)的各個不同振動-轉(zhuǎn)動能級，不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)的各個能級上。第14頁/共58頁15單重態(tài)和三重態(tài)的電子分布模式圖A單重基態(tài)B激發(fā)單重態(tài)C激發(fā)三重態(tài)EABC不是直接的躍遷！第15頁/共58頁16激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)磁性抗磁順磁平均壽命10-8s10-4s-1s躍遷情況允許躍遷禁阻躍遷

能量高一些低一些

激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的比較第16頁/共58頁174.

分子對所吸收到的輻射的處理根據(jù)能量最低原理：由于激發(fā)單重態(tài)的分子能量較高，因而激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，所以會通過輻射躍遷和無輻射躍遷等方式釋放出多余的能量而返回到基態(tài)—去激發(fā)過程，在去激發(fā)過程中以速度最快、激發(fā)態(tài)的壽命最短的途徑占優(yōu)勢。去極化過程無輻射躍遷輻射躍遷振動弛豫(vibrationalrelaxation)內(nèi)部轉(zhuǎn)換(internalconversion)外部轉(zhuǎn)換(externalconversion)系間穿越(intersystemcrossing)熒光(fluorescence)磷光(phosphorescence)

第17頁/共58頁18分子中能級變換模式圖(Jablonski)S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第18頁/共58頁195.

相關(guān)名詞術(shù)語vibrationalrelaxation振動弛豫：處于激發(fā)態(tài)的各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰撞而將部分能量釋放出來，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的過程—只能發(fā)生在同一電子能級內(nèi)的不同振動能級之間internalconversion內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換：當(dāng)兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致振動能級發(fā)生重疊時，受激發(fā)分子常由高電子能級以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級的過程—容易發(fā)生

第19頁/共58頁20externalconversion外部能量轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)的分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子發(fā)生碰撞而將部分能量以熱能的形式釋放出來—降低熒光強(qiáng)度intersystemcrossing體系間跨越：處于激發(fā)態(tài)的分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生改變的過程。如S1*的最低振動能級同T1*的最高振動能級重疊時，則有可能發(fā)生S1*

T1*—使熒光強(qiáng)度降低甚至熄滅容易發(fā)生在含有重原子分子或溶液中存在O2等順磁性物質(zhì)中。第20頁/共58頁21fluorescenceemission：激發(fā)單重態(tài)內(nèi)部轉(zhuǎn)換或振動弛豫S1*的最低振動能級發(fā)射hυ

S0的任一振動能級熒光特點(diǎn)：1.不是單一的過程，借助了振動弛豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換的過程

2.持續(xù)過程為10-9～10-7s3.發(fā)射出來的波長大于吸收的激發(fā)波長

4.呈現(xiàn)帶狀的光譜第21頁/共58頁22phosphorescenceemission：體系間跨越

S*T1*的最低振動能級振動弛豫發(fā)射hυ

S0的任一振動能級磷光特點(diǎn)：1.不是單一的過程，借助了振動弛豫和體系間的跨越

2.波長大于熒光的波長

3.持續(xù)過程為10-4～10s4.低溫條件下才可見區(qū)別熒光和磷光？第22頁/共58頁23二、熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜(excitationspectrum)

表示不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。

固定發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光來激發(fā)熒光物質(zhì)，記錄熒光強(qiáng)度。2.

發(fā)射光譜(emissionspectrum)—熒光光譜(fluorescencespectrum)

表示所發(fā)射的熒光中各種波長的相對強(qiáng)度。

固定激發(fā)波長，掃描該波長激發(fā)所引起熒光物質(zhì)分子發(fā)射不同波長的相對強(qiáng)度。第23頁/共58頁24熒光光譜的性質(zhì)斯托克斯位移(Stokesshift)

熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)波長。原因：無輻射躍遷，使能量發(fā)生了損失。300400500nmFab硫酸奎寧的激發(fā)光譜(a)和發(fā)射光譜(b)第24頁/共58頁252.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)原因：熒光光譜只有一個發(fā)射帶—從S1*的最低

振動能級向基態(tài)回落過程中發(fā)射輻射。3.熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系F280360440520600nm激發(fā)光譜熒光光譜b4b3b2b1b0c1c2c3c4c0第25頁/共58頁26s0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4s1*V=4V=3V=2V=1V=0V=4V=3V=2V=1V=0?E4?E1?E3?E2?E3?E4?E2?E1蒽的能級躍遷第26頁/共58頁27二熒光與分子結(jié)構(gòu)熒光壽命與熒光效率

熒光壽命(fluorescencelifetime)——當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e時所需的時間。利用分子熒光壽命的差別，可以進(jìn)行熒光物質(zhì)混合組分的分析。設(shè)t=時，F(xiàn)t為F0的1/e,則該公式可以表征熒光壽命。第27頁/共58頁28

熒光效率(fluorescenceefficiency)——指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光量子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光量子數(shù)之比。ψf=發(fā)射熒光的光子數(shù)吸收激發(fā)光的光子數(shù)如果熒光物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)過程中沒有其他去極化過程與發(fā)射熒光相競爭，那么熒光分子就可以將所吸收的輻射全部以熒光的形式發(fā)射出來。此時其熒光效率為1。第28頁/共58頁292.有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

A.強(qiáng)的紫外-可見光吸收

分子中含有長的共軛π鍵(不飽和度高)，則容易發(fā)生躍遷，且共軛性越強(qiáng)，熒光強(qiáng)度越大。B.較高的熒光效率具有剛性平面，共共平面性越強(qiáng)，則容易可保持較高的熒光效率。另外，一個有機(jī)物能否發(fā)熒光以及熒光的強(qiáng)弱還受取代基團(tuán)的影響。第29頁/共58頁30

苯λex=205nmλem=278nm

萘λex=286nmλem=321nm

蒽λex=356nmλem=404nm第30頁/共58頁31聯(lián)苯芴芴分子中的兩個苯環(huán)不能自由旋轉(zhuǎn)，為剛性分子第31頁/共58頁32Al3+8-羥基喹啉8-羥基喹啉鋁熒光增強(qiáng)第32頁/共58頁33反-1,2-二苯乙烯順-1,2-二苯乙烯熒光√熒光×第33頁/共58頁34取代基增強(qiáng)π電子共軛程度—使熒光波長長移NH2-,OH-,OCH3-等減弱π電子共軛程度—使熒光減弱或熄滅COOH-,NO2-,-C=O,SH-及鹵素原子等不影響π鍵—對熒光基本沒有影響如R-,SO3H-等第一類為給電子基團(tuán)第二類為吸電子基團(tuán)第34頁/共58頁353.熒光試劑

在熒光分光光度法中，常使用某些熒光試劑，使之與被分析物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成熒光效應(yīng)強(qiáng)的物質(zhì)—提高分析的靈敏度和選擇性熒光胺能與伯氨基反應(yīng)，生成的衍生物Ex=390nm,Em=480nm第35頁/共58頁36鄰苯二甲醛常作為氨基酸含量測定的熒光反應(yīng)試劑丹磺酰氯丹磺酰肼能與伯、仲胺基及酚羥基的生物堿反應(yīng)，產(chǎn)生比較強(qiáng)的熒光第36頁/共58頁37三影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.溫度

T↑，熒光效率和熒光強(qiáng)度↓

。原因：分子間的碰撞加強(qiáng)，消耗了部分能量。2.溶劑

①

極性↑，熒光波長↑，且熒光強(qiáng)度↑。

②

黏度↑，熒光強(qiáng)度↑原因:①

極性溶液中，熒光分子π→π*的?E↓

②

分子間的熱碰撞幾率降低那么磷光呢？第37頁/共58頁383.酸度

溶劑的pH值會使分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如雙鍵位移，從而使光譜性質(zhì)發(fā)生變化。想想酸堿滴定中指示劑為什么會隨著pH值的改變而顏色發(fā)生變化呢？4.熒光熄滅劑(1)發(fā)生分子碰撞損失了熒光物質(zhì)的能量；(2)O2分子的順磁性，促進(jìn)了體系間的跨越，誘發(fā)S1*→T1*(3)

熒光物質(zhì)溶液濃度過大時(>1g/L)，產(chǎn)生自熄滅第38頁/共58頁395.散射光(1)瑞利散射光(Reileighscatteringlight)

光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，沒有能量的交換。(2)拉曼光(Ramanscatteringlight)

光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，光子與物質(zhì)分子間有能量的交換—干擾熒光測定

尤其是波長比入射光更長的拉曼光，因其與熒光接近，因此必須采取措施消除。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾第39頁/共58頁40強(qiáng)度320448Ex=320nm硫酸喹寧350448強(qiáng)度320360Ex=320nm0.1mol/LH2SO4350400Ex=350nm硫酸喹寧Ex=350nm0.1mol/LH2SO4無干擾√有干擾×Raman光譜有何特點(diǎn)？第40頁/共58頁41第二節(jié)熒光定量的分析方法溶液中物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)吸收光量子的程度以及熒光效率有關(guān)—成正相關(guān)關(guān)系I0FI一般在垂直方向觀察或測量熒光強(qiáng)度溶液中熒光的測定1.熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系熒光分光光度計的設(shè)計原理第41頁/共58頁42有關(guān)計算設(shè)溶液中熒光物質(zhì)濃度為C，液層厚度為L。熒光強(qiáng)度正比于被測熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度，即：F∞(I0-I),F=K'(I0-I)

K'為常數(shù)，其值取決于熒光效率。根據(jù)Beer定律：I=I010-ECl第42頁/共58頁43若濃度C很小，ECl也很小，，當(dāng)ECl≤0.05時上式中括號中第二項以后的各項可以忽略。得F=2.3K'I0ECl=KC因此，在低濃度時，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比—熒光定量分析的依據(jù)。注意：當(dāng)熒光物質(zhì)溶液的濃度太高時，則熒光響應(yīng)值與濃度之間就偏離了線性關(guān)系。第43頁/共58頁442.定量方法(1)校正曲線法

以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立線性方程。在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，常采用系列中某一對照品濃度作為基準(zhǔn)，將空白溶液的熒光強(qiáng)度讀數(shù)調(diào)至0，將該對照品溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)至100%或50%，然后測定對照品系列中其他溶液的熒光強(qiáng)度F。

A.每次校正的樣品應(yīng)采用同一對照品溶液。

B.如果對照品對光不穩(wěn)定，則可以用另外一個與被測物熒光光譜相近的物質(zhì)作基準(zhǔn)來校正儀器。第44頁/共58頁45(2)比例法

如果標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠通過原點(diǎn)，則可以直接進(jìn)行對比測定。如果空白溶液的F不能調(diào)至0，則按(3)聯(lián)立方程式法

用于多組分混合物的熒光分析。第45頁/共58頁46鹽酸洛美沙星200285323400

350445600

FF激發(fā)光譜熒光光譜第46頁/共58頁47測定法：用0.1mmol/L的鹽酸配制濃度為1.5ug/mL的溶液，進(jìn)行光譜掃描，得知其最大吸收波長為285nm，發(fā)射波長為485nm。同時用HCl溶液作空白對照。測得該濃度的洛美沙星的熒光值為Fs

,另按該法配制供試品溶液，同法測定熒光響應(yīng)值Fx

，按照比例法公式，計算，即得供試品溶液的藥物濃度。其中Cs=1.5ug/mL第47頁/共58頁48第三節(jié)熒光分光光度計1.熒光分光光度計由光源、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器、樣品池和檢測系統(tǒng)組成。激發(fā)單色器樣品池吸收物發(fā)射單色器檢測器放大器指示器記錄器Xe燈第48頁/共58頁492.儀器的校正

A.靈敏度：直接影響方法的檢出限。一般用1ug/mL的硫酸奎寧進(jìn)行檢查。

B.波長

C.光譜：影響測定的靈敏度和準(zhǔn)確度。原因：光源強(qiáng)度不穩(wěn)定；

檢測器對波長的感應(yīng)不呈線性。采用雙光束光路，即用一個參比光來抵消測量誤差。第49頁/共58頁50第四節(jié)熒光分析新技術(shù)激光熒光分析(laserfluorometry)

優(yōu)點(diǎn)：單色性好、強(qiáng)度大、穩(wěn)定性高2.時間分辨熒光分析(time-resolvedfluorometry)

原理：利用不同物質(zhì)的熒光壽命的不同，在激發(fā)和檢測之間延緩的時間不同，以實(shí)現(xiàn)分別檢測的目的?？垢蓴_性強(qiáng)，可用于復(fù)雜的多組分的分析。第50頁/共58頁514.同步熒光分析(synchronousfluorometry)

原理：在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長差值?λ

（通常為λex與λem之差)，同時掃描發(fā)射波長和激發(fā)波長，得到同步熒光光譜。

Fsp(λex,λem)=KCFexFem

靈敏度很高。3.熒光免疫分析(fluoroimmunoassay)

原理：利用熒光標(biāo)記的抗原與抗體之間的反應(yīng)進(jìn)行分析。用于生物化學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)中蛋白及多肽的分析。第51頁/共58頁525.膠束增敏熒光分析(micellarsensitizedfluorometry)

原理：利用表面活性劑(SDS)，形成膠體溶液，來減弱被分析物由于分子熱運(yùn)動所造成的能量損失甚至熒光熄滅現(xiàn)象。特點(diǎn)適用范圍廣靈敏度高穩(wěn)定第52頁/共58頁53學(xué)習(xí)要求1、熟悉分子內(nèi)部能級躍遷的模式及相關(guān)的概念2、理解熒光發(fā)射和磷光發(fā)射的過程3、理解激發(fā)光譜與熒光光譜的含義，掌握熒光光譜的特點(diǎn)4、熟悉熒光壽命與熒光效率的含義5、掌握影響有機(jī)物質(zhì)熒光強(qiáng)度的因素6、掌握熒光定量分析的方法依據(jù)第53頁/共58頁54練習(xí)題一、選擇題1.根據(jù)下列結(jié)構(gòu)，那種物質(zhì)的熒光效率最大

A苯B聯(lián)苯C蒽D萘2.下列物質(zhì)中，哪個的熒光強(qiáng)度最大

A.苯酚B.硝基苯C.苯甲酸D.苯甲醛第54頁/共58頁553.影響熒光強(qiáng)度因素有

A分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性B.分子的取代基團(tuán)

C溶液的溫度D.溶劑的性質(zhì)E.分子量的大小4.光和物質(zhì)分子發(fā)生碰撞，不發(fā)生能量的交換，僅是光子運(yùn)動的方向發(fā)生改變，這種