生物化學(xué)與分子生物學(xué)八課件25市公開課金獎市賽課一等獎?wù)n件

重組DNA技術(shù)RecombinantDNATechnology第二十四章第1頁第1頁克隆(clone)來自同一始祖相同副本或拷貝集合。獲取同一拷貝過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

即DNA克隆(DNAcloning)細胞克隆器官（或組織）克隆個體克隆（動物或植物）第2頁第2頁重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）又稱分子克?。╩olecularcloning）或DNA克?。―NAcloning）或基因克隆（genecloning)技術(shù)，是指在體外利用酶學(xué)辦法將目的DNA片段與能自主復(fù)制遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進而在受體細胞中復(fù)制、擴增，從而取得單一DNA分子大量拷貝。

克隆目的基因后，針對該基因進行特定蛋白質(zhì)或多肽制備以及定向改造基因結(jié)構(gòu)所用辦法及相關(guān)工作統(tǒng)稱為基因工程（geneticengineering）。因此，重組DNA技術(shù)又稱為基因工程技術(shù)。第3頁第3頁*重組DNA技術(shù)發(fā)展簡史1865年G.J.Mendel豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗1972年P(guān).

Berg構(gòu)建第一個重組DNA分子(猿猴病毒DNA和

λ噬菌體DNA)1973年S.Cohen初次將DNA片段與質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化入E.coli1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工，程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上主要藥物1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素工廠1997年英國羅林研究所成功地克隆了“多莉”羊MendelPaulBergIanWilmutand“Dolly”第4頁第4頁第一節(jié)

重組DNA技術(shù)中慣用工具酶

FrequentlyUsedEnzymesinRecombinantDNATechnology

第5頁第5頁限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶堿性磷酸酶反轉(zhuǎn)錄酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶I大片段

TaqDNA聚合酶多核苷酸激酶

工具酶在重組DNA技術(shù)中含有特殊用途

第6頁第6頁重組DNA技術(shù)中慣用工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶辨認特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接堿性磷酸酶切除末端磷酸基反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA；替換DNA聚合酶I進行填補，標識或DNA序列分析末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶

在3′羥基末端進行同聚物加尾DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接；缺口平移制作高比活性探針；DNA序列分析；填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而無53外切活性。慣用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標識等TaqDNA聚合酶

慣用于PCR；產(chǎn)物3′末端帶有A，可用于T-A克隆多核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標識探針第7頁第7頁一、限制性核酸內(nèi)切酶用于切割DNA定義:限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是辨認DNA特異序列,并在辨認位點或其周圍切割雙鏈DNA一類內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶是重組DNA技術(shù)中主要工具酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第8頁第8頁分類：依據(jù)酶識別切割特性、催化條件及是否含有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類（基因工程技術(shù)中慣用Ⅱ型）★Ⅰ型：屬于復(fù)合功效酶，兼有修飾和切割DNA兩種特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作為催化輔因子，在DNA降解時伴隨有ATP水解。即它含有核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四種活性。若識別位點上兩條DNA鏈均未甲基化，則行使內(nèi)切酶功效，并在切割DNA同時或之后轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP酶；若位點上只有1條鏈被甲基化則發(fā)揮修飾功效，使另一條鏈也甲基化；若位點上兩條鏈均甲基化就與位點解離。其顯著特點是識別位點和切割部位不一致，無固定切割位點，普通在識別位點以外1kb（不少于400bp）到幾kb（可多達7kb）處隨機切割，不產(chǎn)生特異片段，故在基因重組中沒有應(yīng)用價值?！铫笮停号cⅠ型酶特性類似，也有甲基化功效，但無ATP酶和DNA解旋酶活力；不同是它能在DNA鏈上特異位點切割，其切割位點在識別位點以外，對基因工程意義也不大。第9頁第9頁限制酶作用與甲基化酶共同構(gòu)成細菌限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護本身DNA，猶似高等動物免疫系統(tǒng)?！铫蛐停壕褪峭ǔＶ窪NA限制性內(nèi)切酶，在基因工程技術(shù)中慣用。特點：分子量小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)輔助因子，它們能辨認雙鏈DNA特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異DNA片段。

Ⅱ類酶辨認序列特點為回文結(jié)構(gòu)，普通為4~6bps（有些為8或8個以上堿基序列）

，且富含GC。GGATCCCCTAGG第10頁第10頁第一個字母取自產(chǎn)生該酶細菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個字母是該細菌種名，用小寫斜體；第四個字母（有時無）代表株（可大寫或小寫）；用羅馬數(shù)字表示發(fā)覺先后順序。命名Hin

dⅢ

屬

種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株第三種酶（一）重組DNA技術(shù)中通常使用Ⅱ型限制酶

第11頁第11頁E=Escherichia，埃希氏菌屬co=coli，大腸桿菌菌種R=RY13，菌株名I=第一個被分離到內(nèi)切酶命名EcoRⅠ

屬

種

株序第12頁第12頁（二）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶含有一些共性和特性1.含有特定辨認和切割位點

限制性內(nèi)切酶辨認位點限制性內(nèi)切酶辨認位點ApaIGGGCC’CC’CCGGGSmaICCC’GGGGGG’CCCBamHIG’GATCCCCTAG’GSau3AIGATC’’CTAGPstICTGCA’GG’ACGTCNotIGC’GGCCGCCGCCGG’CGEcoRIG’AATTCCTTAA’GSfiIGGCCNNNN’NGGCCCCGGN’NNNNCCGGII型限制性內(nèi)切酶辨認位點舉例（'示切割位點）第13頁第13頁2.辨認核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（palindrome）

第14頁第14頁第15頁第15頁BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口3.切割雙鏈DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端（stickyend）（bluntend）第16頁第16頁第17頁第17頁同尾酶（isocaudarner）

有些限制性內(nèi)切酶即使辨認序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同黏端，這樣酶彼此互稱為同尾酶。這兩個相同黏端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA4.不同酶能夠產(chǎn)生一樣末端第18頁第18頁GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGGG+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ能識別同一序列（切割位點可同或不同）但起源不同兩種酶互稱同工異源酶（isoschizomer）或同裂酶。5.不同酶能夠識別同一個序列第19頁第19頁6.切割會受其它原因影響

限制性內(nèi)切酶通常不能切割在辨認位點內(nèi)有特異堿基甲基化序列。緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶特異性。比如，EcoRI在正常情況下辨認“-GAATTC-”序列，但在甘油濃度不小于5%（v/v）或反應(yīng)溫度較低時辨認序列可變?yōu)椤?AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，這種現(xiàn)象稱為星號活性（staractivity），以EcoRI*表示。第20頁第20頁二、DNA連接酶用于催化DNA片段連接DNA連接酶（DNAligase）：催化兩個相鄰3′-OH和5′-磷酸基團形成3′，5′-磷酸二酯鍵，從而使DNA片段或單鏈斷裂形成缺口連接起來。連接酶作用機制第21頁第21頁BamHI第22頁第22頁

1.大腸桿菌染色體編碼DNA連接酶

需NAD+作為輔因子

2.大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼T4DNA連接酶

需ATP作為輔因子

DNA連接酶起源第23頁第23頁三、重組DNA技術(shù)中還需使用其它慣用工具酶（一）堿性磷酸酶能清除核酸分子末端磷酸基團（二）反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端加尾以構(gòu)成黏性末端

（四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA（五）DNA聚合酶I大片段保留了有用酶活性（六）TaqDNA聚合酶慣用于PCR（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5′羥基末端磷酸化第24頁第24頁

來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphatase，BAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。用于脫去DNA（RNA）5′末端磷酸基團，使5′-P成為5′-OH，該過程稱核酸分子脫磷酸作用。（一）堿性磷酸酶能清除核酸分子末端磷酸基團

P5′OH3′OH3′P5′OH5′OH3′OH3′OH5′第25頁第25頁（二）反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）反轉(zhuǎn)錄酶催化cDNA合成RNARNA5′3′AAAAAAAAAAAATTTTTT5′3′cDNAcDNA隨機引物Oligo-dT第26頁第26頁

5′3′5′5′3′3′

5′3′OHGGGGGdGTP末端轉(zhuǎn)移酶（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端加尾以構(gòu)成黏端

第27頁第27頁大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolymeraseI）是基因工程中慣用DNA聚合酶。其除含有5′→3′聚合酶活性外，尚有3′→5′及5′→3′核酸外切酶活性。因其含有5′→3′核酸外切酶活性而慣用于DNA探針缺口平移法（nicktranslation）標識。（四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA第28頁第28頁DNA聚合酶I大片段（largefragmentofDNApolymeraseI）為DNA聚合酶I用枯草桿菌蛋白酶（subtilisin）裂解后產(chǎn)生大片段，這個片段也稱為Klenow片段（Klenowfragment）。其保留了5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切酶活性，失去了5′→3′外切酶活性。它含有3′→5′外切酶活性能確保DNA復(fù)制準確性，即把DNA合成過程中錯配核苷酸清除，再把正確核苷酸接上去（該活性稱為校對活性）。

Klenow片段主要用途有：①補齊雙鏈DNA3′末端，使其轉(zhuǎn)變成平端；或通過補齊3′端而使3′末端標識；②在cDNA克隆中，用于第二股鏈合成；③用于DNA序列分析。（五）DNA聚合酶I大片段保留了有用酶活性第29頁第29頁將黏端轉(zhuǎn)變成平端GCTTAA

OH3′5′3′5′GAATTCTTAA5′3′3′5′

對5′-黏端片段，利用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段，在3′-OH端延伸，可填平末端凹陷并將其轉(zhuǎn)變成平端。DNA聚合酶

EcoRⅠ第30頁第30頁將黏端轉(zhuǎn)變成平端CTGCAG

5′3′5′CG5′3′3′

對3′黏端片段，應(yīng)用如T4DNA聚合酶3′→5′核酸外切酶活性可切去未配正確序列，將其轉(zhuǎn)變成平端。核酸外切酶

PstⅠ

5′3′第31頁第31頁（六）TaqDNA聚合酶慣用于PCRTaqDNA聚合酶含有良好聚合活性和熱穩(wěn)定性，慣用于PCR。該酶含有5′→3′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，但沒有3′→5′外切酶活性，因而無3′→5′校對活性，故在PCR反應(yīng)中假如發(fā)生堿基錯配，該酶沒有校正功效。針對此不足，當前研發(fā)出各種高保真耐高溫DNA聚合酶，大大減少了PCR過程中堿基錯配率。另外，TaqDNA聚合酶含有末端轉(zhuǎn)移酶作用，能在所合成DNA鏈3′末端加上一個單獨腺苷酸殘基（A）。這樣PCR產(chǎn)物可直接與帶有3′-T線性化載體（T載體）連接（即T-A克?。?。第32頁第32頁（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5′羥基末端磷酸化

慣用是T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase），該酶含5′多核苷酸激酶和3′磷酸酶活性，能催化ATPγ-位磷酸向DNA和RNA5′-羥基轉(zhuǎn)移。該酶慣用于：①DNA或RNA5′末端標識；②使沒有5′-末端磷酸DNA片段磷酸化，以供連接和克隆之用。第33頁第33頁第二節(jié)

目的DNA獲取PreparationofInterestedDNA第34頁第34頁一、化學(xué)合成法可直接合成目DNA

要求：已知目的基因核苷酸序列或其產(chǎn)物氨基酸序列應(yīng)用：普通用于小分子肽類基因合成第35頁第35頁*化學(xué)合成法獲取目DNA由已知氨基酸序列推測也許DNA序列色苯丙蛋賴第36頁第36頁

第一步：構(gòu)建基因組DNA文庫（是指包括某一個生物細胞或組織所有基因組DNA序列隨機克隆群體，以DNA片段形式貯存了所有基因組DNA信息）。

第二步：篩選含有目的基因克隆。

二、從基因組DNA文庫中獲取目DNA第37頁第37頁組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶或機械剪切受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶所有基因組DNA片段集合*從基因組DNA文庫獲取目基因第38頁第38頁三、從cDNA文庫中獲取目的DNA

第一步：構(gòu)建cDNA文庫（包括某一組織細胞在一定條件下所表示所有mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而合成cDNA序列克隆群體，它以cDNA片段形式貯存了所有基因表示信息）。第二步：篩選含有目的cDNA克隆。

第39頁第39頁cDNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶所有cDNA片段集合第40頁第40頁基因組DNA文庫和cDNA文庫構(gòu)建第41頁第41頁從基因組DNA文庫或cDNA文庫中篩選目的DNA策略1.菌落或噬斑原位雜交2.針對表示文庫，可用抗原-抗體或配體-受體結(jié)合原理（親和篩選法）篩選第42頁第42頁*從基因組DNA文庫獲取目基因菌落原位雜交法等辦法，可從文庫中篩選含有目的基因噬菌體第43頁第43頁AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAcDNAsynthesisInfectcellscDNAlibrary從cDNA文庫獲取目基因第44頁第44頁假如已經(jīng)知道目的基因序列，就能很以便地用PCR反應(yīng)，從基因組DNA或cDNA中取得目的基因，可不必要通過復(fù)雜DNA文庫構(gòu)建過程。PCR是一個高效快速體外DNA聚合程序四、經(jīng)PCR獲取目DNA第45頁第45頁

PCR體系模板引物耐熱DNA聚合酶dNTPs含Mg2+緩沖液第46頁第46頁

PCR過程變性(Denaturing):經(jīng)加熱使模板DNA從dsDNA變成ssDNA退火(Annealing):引物與模板DNA雜交延伸(Extension):DNA合成第47頁第47頁ing第48頁第48頁PCR頭三個循環(huán)第49頁第49頁酵母單雜交系統(tǒng)五、通過特異雜交系統(tǒng)獲取一些轉(zhuǎn)錄因子編碼DNAA.無轉(zhuǎn)錄因子：匯報基因不表示“誘餌”DNA序列B.有轉(zhuǎn)錄因子：匯報基因表示C.有轉(zhuǎn)錄因子AD/DNA結(jié)合蛋白－融合蛋白：匯報基因表示轉(zhuǎn)錄因子AD轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合蛋白匯報基因匯報基因匯報基因.第50頁第50頁.

匯報基因

匯報基因酵母雙雜交系統(tǒng)B.有互相作用蛋白質(zhì)，匯報基因表示

啟動子A.無互相作用蛋白質(zhì)，匯報基因不表示“誘餌”“獵物”ADBD

上游激活序列

啟動子BD“誘餌”“獵物”AD上游激活序列第51頁第51頁第三節(jié)

重組DNA技術(shù)中DNA載體DNAVectorsinRecombinantDNATechnology

第52頁第52頁載體（vector）是為攜帶感興趣外源DNA，實現(xiàn)外源DNA在受體細胞中無性繁殖或表示故意義蛋白質(zhì)所采用一些DNA分子

按功效分克隆載體（cloningvector）表示載體（expressionvector）按基本元件起源不同質(zhì)粒載體噬菌體載體黏粒載體病毒載體人工染色體載體等載體概述第53頁第53頁克隆載體(cloningvector)為使插入外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計載體稱為克隆載體。表示載體(expressionvector)為使插入外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計載體稱為表示載體。第54頁第54頁一、克隆載體用于外源DNA克隆和無性繁殖（一）克隆載體應(yīng)具備主要特點至少有一個復(fù)制起點（originofreplication,ori）至少有一個選擇性標志（selectionmarker）有適宜限制性內(nèi)切酶單一切點：稱為多克隆位點（multiplecloningsites，MCS）應(yīng)有較高拷貝數(shù)。

pBR322質(zhì)粒圖譜

第55頁第55頁1.質(zhì)粒

(plasmid)特點：能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有一些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。

（二）慣用克隆載體有各種第56頁第56頁嚴緊型質(zhì)粒:質(zhì)粒與細菌染色體同時復(fù)制，處于嚴密控制之下，其拷貝數(shù)較低。松弛型質(zhì)粒:質(zhì)粒復(fù)制快于細菌染色體復(fù)制（即質(zhì)粒復(fù)制不受嚴格控制），其拷貝數(shù)很高。重組DNA技術(shù)中使用質(zhì)粒通常是松弛型。不同質(zhì)粒必須兼容才干共存于同一細胞中，這對復(fù)合轉(zhuǎn)染（或轉(zhuǎn)化）有參考價值。當前，已經(jīng)有一系列商品化質(zhì)?？寺≥d體可供選擇，如pUC系列、pGEM系列等。質(zhì)粒載體通常所能容納外源DNA長度在10kb以內(nèi)，外源DNA片段越長，質(zhì)粒越不穩(wěn)定。第57頁第57頁pUC系列質(zhì)粒圖譜第58頁第58頁λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適合用于cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適合用于基因組DNA克?。ヽos位點:λ噬菌體DNA為線性雙鏈分子，兩端各有一條由12個堿基構(gòu)成、彼此完全互補且5′單鏈突出序列（即粘性末端），稱cos位點2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列第59頁第59頁3.穿梭載體（shuttlevector）人工構(gòu)建，含有不止一個復(fù)制起點，能攜帶外源DNA序列在不同種類宿主細胞中復(fù)制、擴增。第60頁第60頁表示載體是指用來在宿主細胞中表示外源基因載體依據(jù)其宿主細胞不同可分為:原核表示載體（prokaryoticexpressionvector）真核表示載體（eukaryoticexpressionvector）二、表示載體用于外源DNA表示第61頁第61頁（一）

原核表示載體用于在原核細胞中表示外源基因

從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體普通特點外，還需有調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯序列，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等。當前應(yīng)用最廣泛原核表示載體是大腸桿菌表示載體。原核表示載體基本構(gòu)成下列：R：調(diào)整序列；P：啟動子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列大腸桿菌表示載體第62頁第62頁Lac啟動子（乳糖啟動子）

Trp啟動子（色氨酸啟動子）Tac啟動子（乳糖和色氨酸雜合啟動子）

PL和PR啟動子（λ噬菌體左向和右向啟動子）

T7啟動子1.啟動子是啟動外源基因表示必需元件，其能被RNA聚合酶所辨認：當前原核表示載體常使用啟動子有下列幾種

第63頁第63頁2.SD序列提供核糖體結(jié)合位點

mRNA在細菌中翻譯嚴格依賴于核糖體結(jié)合位點（ribosomebindingsite）存在。SD序列（Shine-Dalgarnosequence）位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游8～13bp處，為富含嘌呤短片段，其能與核糖體30S小亞基中16SrRNA3′端部分序列互補結(jié)合。SD序列作為核糖體結(jié)合位點，確保了翻譯起始復(fù)合物形成。第64頁第64頁3.轉(zhuǎn)錄終止序列有助于外源基因高效表示盡管載體中沒有轉(zhuǎn)錄終止序列，也可表示一些外源蛋白，但表示效果通常不抱負。因此，多數(shù)原核表示載體中都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列。轉(zhuǎn)錄終止序列長短不一，短只有幾十bp，長可達幾百bp。轉(zhuǎn)錄終止序列有助于使RNA聚合酶重點轉(zhuǎn)錄克隆外源基因，控制所轉(zhuǎn)錄RNA長度，提升RNA穩(wěn)定性。位于啟動子上游轉(zhuǎn)錄終止序列可制止其它啟動子通讀，減少本底；位于多克隆位點下游轉(zhuǎn)錄終止序列可預(yù)防因外源基因表示而干擾載體穩(wěn)定性。第65頁第65頁4.幾種常見原核表示載體各有特點依據(jù)表示目的蛋白方式，可將原核表示載體分為（1）非融合型表示載體（2）融合型表示載體（3）分泌型表示載體

第66頁第66頁（1）非融合型表示載體用于表示非融合蛋白非融合蛋白是指不與細菌任何蛋白或多肽融合在一起進行表示蛋白。表示該類蛋白載體稱為非融合型表示載體。使用強啟動子tac，緊接tac啟動子是多克隆位點，目的基因克隆于啟動子和SD序列下游。在多克隆位點下游包括一個很強rrnB核糖體RNA轉(zhuǎn)錄終止子，其作用是為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，由于上游強tac啟動子控制轉(zhuǎn)錄必須由強終止子克制，才不至于干擾與載體本身穩(wěn)定性相關(guān)基因表示。載體其余部分來自pBR322。使用pKK223-3時，應(yīng)配套使用LacIq宿主菌，在無IPTG誘導(dǎo)時，tac啟動子受阻遏，當加入IPTG后，便可去阻遏，從而使外源基因表示。

第67頁第67頁將一段特殊蛋白質(zhì)（或短肽）基因構(gòu)建入載體，使之與目的蛋白融合表示可形成融合蛋白（fusionprotein）。表示該類蛋白載體稱為融合型表示載體，如pGEX系統(tǒng)。pGEX系統(tǒng)包括各種載體，如pGEX-lλT、pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P等。該系統(tǒng)載體使用強啟動子tac，緊接啟動子是SD序列及其下游GST基因，然后是多克隆位點。用IPTG可誘導(dǎo)目的基因表示，表示產(chǎn)物與GST融合，故可利用該標簽對蛋白進行純化。（2）融合型表示載體用于表示融合蛋白第68頁第68頁該類載體長處是能把在受體細菌內(nèi)表示外源蛋白有效地分泌到周質(zhì)腔，甚至穿過細胞外膜進入培養(yǎng)基中。在構(gòu)建該類載體時，除有普通表示載體應(yīng)有啟動子等元件外，還需含有編碼信號肽序列（通常置于SD序列下游）。分泌型載體既可用于非融合蛋白表示，也可用于融合蛋白表示。pINⅢ系列載體是較慣用分泌型表示載體，可使所表示蛋白分泌到宿主菌周質(zhì)腔中。該系列載體以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，帶有大腸桿菌中最強啟動子之一，即lpp（脂蛋白基因）啟動子，其中編碼信號肽序列取自大腸桿菌中分泌蛋白基因ompa（外膜蛋白基因）。

（3）分泌型表示載體用于外源基因分泌表示pINⅢ系列載體有3種，即pINⅢ-ompA1、pINⅢ-ompA2和pINⅢ-ompA3，分別適合用于使用不同密碼子框架目標基因插入，克隆位點分別為EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ。第69頁第69頁（二）真核表示載體用于在真原核細胞中表示外源基因

真核表示載體包括在大腸桿菌中起作用復(fù)制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表示載體中還含有：①真核表示調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、polyA加尾信號等②真核細胞復(fù)制起始序列③真核細胞藥物抗性基因第70頁第70頁OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。注：不是所有真核表示載體都有整合序列真核表示載體基本構(gòu)成

第71頁第71頁真核開啟子和增強子在不同類型細胞中活性差異很大。一些起源于病毒開啟子和增強子，其真核宿主細胞范圍較廣，如Rous肉瘤病毒基因組長末端重復(fù)序列（longterminalrepeats，LTR）、SV40病毒早期基因開啟子和增強子、人類巨細胞病毒（CMV）開啟子等。這些開啟子和增強子組合可在廣泛宿主細胞中起作用，故在真核表示載體中被普遍使用。第72頁第72頁真核表示載體帶有polyA加尾信號可確保新轉(zhuǎn)錄mRNA能有效地加上polyA。為mRNA加上polyA依賴于mRNA3′末端AAUAAA和其下游GU或U富含區(qū)。盡管全長cDNA克隆可能已帶有AAUAAA序列和一段polyA，但這些序列仍不足以確保polyA有效形成。因此，載體中必須帶有polyA加尾信號。慣用來自SV40polyA加尾信號為237bp，其中同時含有針對早期和晚期轉(zhuǎn)錄子切割和polyA加尾信號。兩套信號作用方向相反，并分別位于不同DNA鏈上，對mRNA加工均很有效。第73頁第73頁酵母表示載體昆蟲表示載體哺乳類細胞表示載體依據(jù)真核宿主細胞不同，真核表示載體可主要分為：第74頁第74頁（1）酵母表示載體適于在酵母細胞中表示外源蛋白

依據(jù)載體在酵母細胞中復(fù)制方式不同，可將酵母載體分為五類，YIp：酵母整合型質(zhì)粒YRp：酵母復(fù)制型質(zhì)粒YCp：酵母著絲粒型質(zhì)粒YEp：酵母游離型質(zhì)粒YLp：酵母線性質(zhì)粒除YLp外，其余各類既可在大腸桿菌，又可在酵母細胞中復(fù)制與擴增。第75頁第75頁依據(jù)在轉(zhuǎn)化酵母細胞中復(fù)制機制，又可將酵母載體分為兩個基本類型：①整合型載體，如YIp包括一個酵母ura3標志基因、大腸桿菌復(fù)制起始序列以及抗生素抗性基因。該質(zhì)粒缺乏在酵母細胞中進行自主復(fù)制元件，其需通過質(zhì)粒DNA與酵母DNA同源序列重組而整合至酵母基因組中

。②自主復(fù)制型載體，這類載體因在酵母細胞中有自我復(fù)制能力而得名，屬于這類載體有：YRp、YEp和YCp。

第76頁第76頁YRp含有酵母自主復(fù)制序列，但轉(zhuǎn)化后缺乏有效分離，故在有絲分裂后，質(zhì)粒在親代細胞分布極多而在子代細胞較少或丟失，在遺傳學(xué)方面極不穩(wěn)定。YEp含有可誘導(dǎo)型啟動子、信號肽編碼序列（慣用交配因子α序列）和酵母質(zhì)粒2μm環(huán)片段，這類質(zhì)?？稍谌旧w外自主復(fù)制（約50~100拷貝/細胞），其轉(zhuǎn)化效率高且質(zhì)粒穩(wěn)定，因此慣用該類載體在酵母細胞中高效表示外源基因。YCp是由自主復(fù)制序列與著絲點序列連接而成，該類載體特性是單拷貝（1～2拷貝/細胞），遺傳性極其穩(wěn)定。著絲點序列存在于酵母細胞每條染色體中，該序列在有絲分裂和減數(shù)分裂中能使染色體穩(wěn)定而準確地復(fù)制，這是保持該類載體穩(wěn)定關(guān)鍵原因。第77頁第77頁（2）昆蟲表示載體可在昆蟲細胞中表示真核基因

昆蟲表示載體主要有兩類：①桿狀病毒表示載體。載體啟動子為多角體蛋白(polyhedrin)基因啟動子，所使用外泌信號序列來自蜜蜂milittin序列，其可在宿主細胞（如Sf9或Sf20）中高水平表示外源蛋白。②果蠅表示載體。載體上啟動子有Ac5（果蠅黑素激動蛋白5C基因）啟動子和MT（果蠅黑素金屬硫蛋白基因）啟動子，所使用外泌信號序列為Bip序列，其可連續(xù)表示或誘導(dǎo)表示外源蛋白。第78頁第78頁（3）哺乳類細胞表示載體適宜在哺乳類細胞中

表示真核基因

據(jù)載體進入宿主細胞方式分為病毒載體和質(zhì)粒載體據(jù)載體在宿主細胞內(nèi)是否整合于細胞染色體DNA，可將其分為整合型和非整合型載體整合型載體普通是隨機整合入染色體，但所攜帶外源基因表示受插入位點影響，同時還也許會改變宿主細胞生長特性，整合型載體通慣用于外源基因穩(wěn)定表示；非整合型載體通慣用于外源基因瞬時表示最慣用哺乳類細胞表示載體是病毒載體

第79頁第79頁一個抱負病毒表示載體，通常應(yīng)具備下列條件：

①使用安全，對宿主細胞無毒副效應(yīng)；②能容納較大外源DNA片段且轉(zhuǎn)染效率高；③所產(chǎn)生病毒效價高；④外源基因在靶組織或靶細胞中能長期、穩(wěn)定表示⑤病毒靶向性強；⑥外源基因表示含有可控性。然而，遺憾是，到當前為止，還沒有任何一個病毒載體能滿足以上所有抱負條件。

第80頁第80頁病毒表示載體由各種病毒DNA衍生而來，其構(gòu)建時普通都把細菌質(zhì)粒復(fù)制起點放置其中，使病毒載體及其所攜帶目的DNA能以便地在細菌中繁殖和克隆，然后再轉(zhuǎn)入真核細胞。通過質(zhì)?；慕ú《据d體通常都包括病毒啟動子、包裝元件、遺傳標識和質(zhì)粒復(fù)制起點等幾種部分。第81頁第81頁當前，慣用病毒表示載體包括下列各種：

①反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus,RV）載體

RV屬ssRNA病毒。構(gòu)建RV載體時，將RVDNA插入pBR322質(zhì)粒，同時刪除RV三個編碼基因，保留兩端LTR和病毒顆粒包裝序列Ψ，再加入供篩選標識基因。5′LTR具啟動子和增強子活性并具轉(zhuǎn)錄起始信號，3′LTR具轉(zhuǎn)錄終止信號。RV載體含有較高整合和表示外源基因能力，廣泛用于轉(zhuǎn)基因動物和基因治療研究，但因其隨機整合，其安全性問題需加以考慮。

第82頁第82頁②慢病毒（lentivirus,LV）載體LV載體是以HIV-1（I型人類免疫缺點病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來表示載體；與普通RV載體不同是，它對分裂細胞和非分裂細胞均含有感染能力；該載體可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而取得持久表示；該載體宿主細胞較廣，在表示目標蛋白和小干擾RNA方面都有廣泛應(yīng)用。第83頁第83頁③腺病毒（Adenovirus,AV）載體

AV屬線性dsDNA病毒；當前，普遍使用是AV第三代載體，載體中清除了所有AV編碼基因，僅保留了5′和3′末端反向重復(fù)序列（invertedterminalrepeats，ITR）及病毒包裝序列Ψ，病毒載體外殼包裝需要輔助病毒提供編碼序列；第三代AV載體能容納較大DNA片段，能較長時間地表示外源基因，其毒性和免疫原性都大大減少。

第84頁第84頁④腺相關(guān)病毒（adenovirus-associatedvirus，AAV）載體AAV屬于線性ssDNA病毒。構(gòu)建AAV載體時，用外源基因及其調(diào)整序列取代病毒rep和cap編碼區(qū)，僅保留兩端145bpITRs，負責病毒獲救、復(fù)制、包裝與整合；而輔助質(zhì)粒則保留所有編碼序列而無ITRs。兩種質(zhì)粒間無重復(fù)序列，重組AAV復(fù)制和殼化所需rep和cap基因，由輔助質(zhì)粒直接以蛋白表示方式提供，故不會發(fā)生野生型病毒序列重組、復(fù)制和包裝。當AAV載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染輔助病毒（AV）感染細胞時，即能獲救、復(fù)制并包裝成重組AAV顆粒。AAV載體含有能穩(wěn)定表示外源基因、特異整合至人19號染色體長臂末端、病毒穩(wěn)定且宿主范圍廣、不引起免疫反應(yīng)等長處。第85頁第85頁⑤痘苗病毒（vacciniavirus，VV）載體VV屬dsDNA病毒。構(gòu)建VV載體時，通常以胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因作為篩選標志。tk序列中插有該病毒早期啟動子和下游多克隆位點。含有外源DNA重組VV載體tk基因不表示，當與野生型VV共轉(zhuǎn)染宿主細胞并經(jīng)tk同源序列重組，便可取得既有外源基因又有tk基因重組VV顆粒，進而導(dǎo)入tk缺點細胞后，可在含有次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷培養(yǎng)基中篩選，只有tk表示細胞才干生長。VV載體含有克隆容量大（可插入25～40kb外源DNA片段）、可插入多個外源基因、病毒宿主細胞廣且使用安全等長處。第86頁第86頁⑥猿猴空泡病毒40（simianvacuolatingvirus40，SV40）載體

SV40基因組為雙鏈環(huán)狀DNA人工構(gòu)建SV40載體主要有重組病毒質(zhì)粒載體和取代型重組病毒載體兩種類型，前者是將SV40基因組復(fù)制起點序列插入質(zhì)粒載體中，從而構(gòu)建成病毒-質(zhì)粒載體；后者是用外源基因取代病毒基因組中與其大小相稱一個片段，從而形成取代型重組病毒載體

第87頁第87頁⑦單純皰疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）載體HSV為線性DNA病毒構(gòu)建HSV載體時，通常由Ⅰ型HSV基因組改建而成當前，HSV載體主要有兩類，一類是即刻早期（immediateearly，IE）基因缺點型載體，通過缺失這些IE基因，減少了毒性，從而使外源基因表示時間延長；另一類是利用該病毒擴增子（amplicons）制備載體，該類載體僅含有HSV復(fù)制起點和包裝序列以及調(diào)整序列。輔助質(zhì)粒為裝配型質(zhì)粒，其除了缺失包裝序列外，包括所有HSV基因組。兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細胞后，產(chǎn)生感染性重組病毒顆粒，其中僅含有HSV基因組序列，所有與毒性相關(guān)HSV蛋白均以低水平表示HSV載體含有克隆容量大（可插入長達50kb外源DNA）、外源基因可取得穩(wěn)定表示、整合入宿主基因組后無致癌危險、病毒宿主范圍廣且有較高轉(zhuǎn)移效率和效價第88頁第88頁⑧其它病毒載體

除上述病毒載體外，當前用于構(gòu)建真核表示載體病毒尚有些人巨細胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等。另外，尚有些人試圖利用乙型肝炎病毒等構(gòu)建真核表示載體。第89頁第89頁（一）黏粒兼具質(zhì)粒和噬菌體DNA特性黏粒（cosmid）：又稱粘性質(zhì)粒或裝配型質(zhì)粒，是由λDNAcos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建而成雜合雙鏈環(huán)狀DNA載體。黏粒特點：①含有質(zhì)?？剐詷俗R基因及復(fù)制起點和多克隆位點，可按質(zhì)粒方式在宿主菌中進行自主復(fù)制；②帶有λ噬菌體DNAcos序列，可像λ噬菌體DNA同樣進行體外包裝；③黏粒本身較小，通常只有幾kb，但能容納高達50kb外源DNA片段；④非重組體黏粒很小，故不能在體外進行包裝，因此有助于后續(xù)陽性克隆篩選；⑤黏粒因缺乏所有λ基因，不會產(chǎn)生噬斑，但在選擇培養(yǎng)基平板上形成菌落，這一點也與質(zhì)粒載體一致。三、特殊載體含有特定用途黏粒pJB8圖譜第90頁第90頁（二）BAC、PAC和YAC用于大片段DNA克隆細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）基于F質(zhì)粒構(gòu)建而成。BAC能容納高達400kb（普通為50kb～250kb）外源DNA?；诖竽c桿菌P1噬菌體載體（E.colibacteriophageP1-basedvector,PAC）與BAC克隆容量相稱。酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）載體能攜帶更大DNA片段，其由酵母線性質(zhì)粒（YLp）發(fā)展而來，含有染色體兩個端粒片段，能復(fù)制出線性DNA，其克隆容量可高達3Mb（普通為500kb～2Mb）。利用重組線性DNA轉(zhuǎn)化細胞，可建成包括人所有基因組DNA巨型YAC文庫。BAC、PAC和YAC使用為人類基因組物理圖譜和序列測定提供了強有力工具，大大增進了人類基因組計劃完畢。第91頁第91頁端粒重復(fù)序列（telomericrepeat,TEL）著絲粒（centromere,CEN）自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationsequences,ARS）BamHⅠ切割后形成微型酵母染色體→EcoRⅠ切割形成染色體兩臂→外源DNA插入該切點形成人工酵母染色體→轉(zhuǎn)化入酵母菌→通過復(fù)制、分裂，克隆大片段DNA第92頁第92頁（三）啟動子探針型載體用于分離和分析基因啟動子啟動子探針型載體（即通常所說匯報基因載體）是一個快速分離和鑒定基因啟動子工具型載體包括兩個基本部分：轉(zhuǎn)化單元和檢測單元。其中，轉(zhuǎn)化單元包括質(zhì)粒克隆載體必備轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（復(fù)制起點和抗生素抗性基因，用于選擇被轉(zhuǎn)化細胞）；檢測單元則包括一個已失去轉(zhuǎn)錄功效且易于檢測遺傳標志基因以及多克隆位點。比如，pGL3-basic就是一個典型啟動子探針型載體，它不含啟動子，含有一個熒光素酶（luciferase，luc）標志基因。假如插入片段中含有啟動子序列，則luc表示，不然，luc不表示，故依據(jù)luc表示是否和表示水平高下，即可判斷插入片段中啟動子序列有無和活性強弱。

啟動子探針型載體pGL3-basic圖譜第93頁第93頁在啟動子探針型載體基礎(chǔ)上，還發(fā)展出了用于分離和分析其它基因表示調(diào)控元件（如增強子或衰減子）載體。這類載體與啟動子探針型載體區(qū)別，就是本身含有啟動子，故將空載體轉(zhuǎn)入細胞，就有標識基因（如luc）表示。當在啟動子上游或下游（乃至標識基因下游）插入外源DNA片段后，便可依據(jù)標識基因表示水平改變來判斷所插入DNA片段中是否含有增強或克制基因表示調(diào)控元件。第94頁第94頁（四）組織特異性表示載體使外源基因在特定組織表示把某種組織特異性調(diào)控序列（如啟動子）構(gòu)建于表示載體，使外源基因表示嚴格受控于該調(diào)控序列，就形成了組織特異性表示載體該類載體為研究特定組織發(fā)育和針對特定組織或器官基因治療提供了有效手段當前研究較多有乳腺組織特異性表示載體，它是基因工程藥物生物反應(yīng)器；腫瘤細胞特異性表示載體能在腫瘤細胞內(nèi)有效表示毒性蛋白，從而特異性殺傷腫瘤細胞；神經(jīng)組織特異性表示載體，對治療早老性癡呆含有積極作用第95頁第95頁（五）雙啟動子和串聯(lián)啟動子表示載體各有特殊用途普通表示載體只有一個開啟子，為了特殊需要，可給表示載體組裝兩個開啟子，組成雙開啟子表示載體，意在方便地研究不同條件下基因表示情況或分別開啟不同基因表示。有時為了提升目標基因表示水平，可將兩個或兩個以上相同開啟子串聯(lián)在一起，組成串聯(lián)開啟子表示載體。第96頁第96頁（六）一些表示載體用于表示非蛋白分子有些表示載體不用于表示蛋白質(zhì)，而是用于表示小分子干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）或微小RNA（microRNA，miRNA）等。比如，當前，用于表示siRNA載體已有各種（如pSilencer2.1-U6neo，mU6pro等）。

第97頁第97頁四、載體上慣用標志或標簽載體上標志（marker）：通慣用于重組子或陽性克隆篩選、鑒定常見標志有：①抗生素抗性基因

a.用于細菌重組子篩選抗生素抗性基因

b.用于哺乳類細胞陽性克隆篩選抗生素抗性基因②酶編碼基因③營養(yǎng)缺點選擇標志第98頁第98頁標簽（tag）：其編碼序列通常構(gòu)建于表示載體，與目的基因位于同一閱讀框內(nèi)，這樣就可使所表示蛋白上帶上標簽肽。標簽肽大小不等，小只有幾種氨基酸殘基，大有幾十kD。標簽肽慣用于表示產(chǎn)物分離、純化與鑒定。慣用tag序列包括

His：6～8個組氨酸FLAG：八肽序列

Strep：鏈親和素，八肽序列HA：血凝素，九肽序列

Myc：十肽序列T7：11肽序列

S：14肽序列HSV：11肽序列

VSV-G：11肽序列GSTSPA：葡萄球菌蛋白質(zhì)AMBP：麥芽糖結(jié)合蛋白

GFP：綠熒光蛋白RFP：紅熒光蛋白

VSV：vesicularstomatitisvirus，口蹄疫病毒第99頁第99頁第四節(jié)

DNA克隆基本過程

ProcedureofDNACloning第100頁第100頁目的DNA分離獲?。ǚ郑┹d體選擇與準備（擇）目的DNA與載體連接（接）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞（轉(zhuǎn)）重組體篩選與鑒定（篩）DNA克隆基本過程第101頁第101頁一、分離獲取目DNA有多種辦法（分）DNA克隆第一步是分離獲取目的DNA。目的DNA起源有各種，包括基因組DNA、經(jīng)mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA、PCR擴增產(chǎn)物、化學(xué)合成法取得DNA等。第102頁第102頁二、依據(jù)DNA克隆目的選擇與準備

適宜載體（擇）進行DNA克隆目的主要有二：①取得目的DNA片段；②取得目的DNA片段所編碼蛋白質(zhì)針對第一個目的，通常選取克隆載體；針對第二種目的，需選取表示載體選擇載體時，還要考慮目的DNA大小、受體細胞種類和起源等原因選擇載體時還需注意載體內(nèi)應(yīng)有適宜多克隆位點第103頁第103頁不同載體克隆容量及適宜宿主細胞載體插入DNA片段宿主細胞質(zhì)粒<5~10kb細菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細菌黏粒~50kb細菌BAC~400kb細菌YAC~3Mb酵母第104頁第104頁三、目DNA與適宜載體連接形成重組DNA（接）（一）黏端連接為最適連接

1.單一相同黏端連接會產(chǎn)生載體自連配伍末端連接情況與單一相同黏端連接相同第105頁第105頁載體和目DNA用EcoRI切割DNA連接酶粘性末端質(zhì)粒載體目DNA重組DNA錯誤連接錯誤連接++單一相同黏端連接產(chǎn)生載體自連第106頁第106頁BamHI第107頁第107頁單一相同黏端連接存在下列缺點：容易出現(xiàn)載體本身環(huán)化目的DNA雙向插入載體（即正向和反向插入）多拷貝現(xiàn)象采用堿性磷酸酶預(yù)處理線性化載體DNA，使之去磷酸化，可有效減少載體本身環(huán)化目的DNA假如反向插入載體，雖不影響基因克隆，但卻影響外源基因表示

第108頁第108頁EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶重組體2.定向克隆可有效避免載體自連和DNA片段反向插入定向克隆：將待克隆DNA分子和載體分子采用同一對限制性核酸內(nèi)切酶切割后連接起來，可實現(xiàn)外源DNA片段定向插入，此即定向克隆第109頁第109頁3.通過其它辦法產(chǎn)生黏端進行連接①人工接頭法②同聚物加尾法③PCR法④T-A克隆法

第110頁第110頁人工接頭(adaptor或linker)連接由平端加上新酶切位點，再用限制酶切割產(chǎn)生粘性末端，而后進行黏端連接。

人工接頭（adaptor/linker

）：是借助化學(xué)合成[和(或)結(jié)合退火辦法]而得到含有一個或一個以上限制性內(nèi)切酶切點平端雙鏈寡核苷酸片段。5′---GGTG▼AATTCACC---3′3′---CCACTTAA▲GTGG---5′第111頁第111頁人工接頭(adaptor/linker)連接CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ第112頁第112頁在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出黏端，再進行黏端連接。加同聚物尾

5′---GGTGAAAAAAACACC---3′3′---CCACTTTTTTTGTGG---5′

同聚物加尾連接第113頁第113頁同聚物加尾連接T(T)nT3′5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′3′T(T)nT

5′

3′3′5′A(A)nA3′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶重組體5′5′5′5′3′

A(A)nA第114頁第114頁PCR法產(chǎn)生黏端針對目標DNA5′和3′端，設(shè)計一對特異引物，在每條引物5′端分別加上不同限制性內(nèi)切酶位點，然后以目標DNA為模板，經(jīng)PCR擴增便可得到帶有引物序列目標DNA，進而用對應(yīng)限制性內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨即便可與帶有相同黏端線性化載體進行有效連接。第115頁第115頁T-A克隆法在使用TaqDNA聚合酶進行PCR時，擴增產(chǎn)物3′末端可加上一個單獨腺苷酸殘基（A）而成為黏端，這樣PCR產(chǎn)物可直接與帶有3′-T線性化載體（T載體）連接，此即T-A克隆。

第116頁第116頁目基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體載體自連目基因自連（二）平端連接效率較低第117頁第117頁為了提升連接效率，可采用提升連接酶用量、延長連接時間、減少反應(yīng)溫度、增長DNA片段與載體摩爾比等辦法平端連接同樣存在載體本身環(huán)化、目的DNA雙向插入和多拷貝現(xiàn)象等缺點第118頁第118頁（三）粘-平末端連接效率介于黏端和平端連接之間粘-平末端連接是指目的DNA和載體之間通過一端為黏端、另一端為平端方式進行連接以該方式連時，目的DNA為定向插入載體（即定向克隆）該連接方式連接效率介于黏端和平端連接之間可采用提升平端連接效率辦法來提升該方式連接效率第119頁第119頁（四）快速連接法無需純化DNA片段該辦法從低融點瓊脂糖凝膠中直接切下所需DNA片段，無需純化，連同凝膠一起與載體DNA進行連接。本法省時省力，對DNA黏端和平端連接均合用，但其連接效率明顯低于常規(guī)連接，且DNA連接酶用量大。第120頁第120頁四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)化（transformation）

質(zhì)?；蝠ち！毦ǜ惺軕B(tài)細胞，competentcell）質(zhì)粒→酵母菌（真核細胞）轉(zhuǎn)染（transfection）外源DNA→真核細胞（酵母除外）噬菌體DNA→感受態(tài)細菌感染（infection）噬菌體顆?！毦《绢w?！溉榧毎?21頁第121頁受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺點處于感受態(tài)(competent)

細菌感受態(tài)（competentbacterium）：細菌易于接納外源物質(zhì)一個天然狀態(tài)，在細菌對數(shù)生長前期，為了分裂增殖需要，細菌胞膜上會表示一些特殊蛋白質(zhì)，利于外源物質(zhì)穿透胞膜，幫助細菌吸取外源營養(yǎng)物質(zhì)?；蚬こ滩僮髦校ㄟ^物理化學(xué)辦法也可使細菌處于感受態(tài)。處于該狀態(tài)細菌被稱為感受態(tài)細胞。第122頁第122頁將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞慣用辦法化學(xué)法：氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化物理法：電擊法顯微注射法等第123頁第123頁用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化第124頁第124頁電擊法第125頁第125頁顯微注射法第126頁第126頁五、篩選與鑒定重組DNA有各種辦法（篩）普通一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細胞只接受一個重組DNA分子。最后培養(yǎng)出來細胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列重組體。將目的重組體篩選出來就等于取得了目的序列克隆篩選與鑒定程序主要包括：先篩選出帶有載體克??；然后篩選鑒定出帶有重組載體克??；最后篩選鑒定出帶有目的DNA克隆主要篩選和鑒定辦法有遺傳標志篩選法、序列特異性篩選法、親和篩選法等第127頁第127頁（一）借助載體上遺傳標志可快捷以便地進行篩選1.利用抗生素抗性標志可篩選出帶有載體重組子將含有某種抗生素抗性基因載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后，將細胞在含有相應(yīng)抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無載體轉(zhuǎn)入細胞將被殺死，生長細胞即是含有載體細胞。至于細胞中載體是否為含有目的DNA重組載體，尚需進一步鑒定。第128頁第128頁抗藥性標志篩選抗性平板第129頁第129頁2.利用標志補救篩選帶有載體重組子標志補救（markerrescue）是指當載體上標志基因在宿主細胞中表示時，通過互補宿主細胞相應(yīng)缺點而使細胞在相應(yīng)選擇培養(yǎng)基中存活。利用該策略可初步篩選帶有載體重組子。標志補救也可用于外源基因?qū)氩溉閯游锛毎箨栃钥寺〕鹾Y。比如，當把帶有dhfr標志基因真核表示載體導(dǎo)入dhfr缺點哺乳類細胞后，則可使細胞在無胸腺嘧啶培養(yǎng)基中存活，從而篩選出帶有載體克隆。要擬定是否為帶有重組載體陽性克隆，還需進一步鑒定。第130頁第130頁第131頁第131頁3.利用不同遺傳標志可篩選出帶有重組載體克?。?）利用抗性基因插入失活可篩選帶有重組載體克隆很多載體都帶有抗生素抗性基因，當外源DNA插入某一抗性基因內(nèi)，便可使該抗性基因失活。借助該抗性標志及載體上其它標志，便可篩選出帶有重組載體克隆。第132頁第132頁插入失活篩選帶有重組載體克隆第133頁第133頁（2）利用抗性基因插入表示也可篩選帶有重組載體克隆

比如：質(zhì)粒pTR262攜帶來自λ噬菌體CI基因，該基因在正常情況下表示產(chǎn)生阻遏蛋白，從而使tetR基因不能表示。當在CI基因中插入外源DNA后，將造成CI基因失活，從而使tetR基因去阻遏而表示。假如細菌內(nèi)含有插入表示重組體，則可在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生長。第134頁第134頁（3）α-互補篩選利用了β-半乳糖苷酶功效互補基因片段

α-互補：pUC、pGEM及M13mp等載體系列均攜帶β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸殘基（α片段）編碼序列，在該序列中含有多克隆位點；通過改造宿主菌基因組DNA含有β-半乳糖苷酶C端（ω片段）編碼序列。只有當載體與宿主細胞同時共表示該酶α和ω片段時，才干形成有活性β-半乳糖苷酶，該現(xiàn)象稱為α-互補（alphacomplementation）。β-半乳糖苷酶可在誘導(dǎo)劑IPTG存在情況下，使底物X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色產(chǎn)物，使細菌克隆或噬斑呈藍色。當外源DNA片段插入載體多克隆位點后，便不能表示α片段，轉(zhuǎn)化細菌后不能分解底物，結(jié)果使菌落或噬斑呈現(xiàn)白色。因此，α-互補篩選又稱藍-白篩選

。第135頁第135頁α-互補篩選（藍-白篩選）第136頁第136頁MCS有插入片段MCS無插入片段β-半乳糖苷酶X-Gal藍色LacZ基因MCS載體上有β-半乳糖苷酶N端編碼序列，細菌染色體DNA有β-半乳糖苷酶C端編碼序列α-互補（藍-白篩選）第137頁第137頁4.利用噬菌體包裝特性可初篩帶有重組載體克隆

λ噬菌體一個主要遺傳特性就是其在包裝時對λDNA大小有嚴格要求，只有重組λDNA長度達到其野生型長度75%～105%時，方能包裝形成有活性噬菌體顆粒，進而在培養(yǎng)基上生長時呈現(xiàn)清楚噬斑，而不含外源DNA單一噬菌體載體DNA因其長度太小而不能被包裝成有活性噬菌體顆粒，故不能感染細菌形成噬斑。第138頁第138頁（二）依據(jù)序列特異性可篩選出特定重組DNA

依據(jù)序列特異性進行篩選辦法包括：限制性內(nèi)切酶法PCR法核酸雜交法DNA測序法等

第139頁第139頁1.限制性內(nèi)切酶法是依據(jù)限制酶切圖譜篩選特定DNA

針對初篩為陽性克隆，提取其重組DNA，以適當限制性內(nèi)切酶進行消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳便可判斷有無DNA片段插入及插入片段大小。同時，依據(jù)酶切位點在插入片段內(nèi)部不對稱分布，可用該辦法鑒定DNA片段插入方向；進而可用各種限制酶制作和分析插入片段酶切圖譜。

第140頁第140頁限制性內(nèi)切酶圖譜分析

目的序列插入載體會使載體DNA限制性內(nèi)切酶圖譜（restrictionmap）發(fā)生改變，如插入目的序列中有其它限制性內(nèi)切酶位點，也能在酶切電泳圖譜上觀測到。第141頁第141頁2.PCR法可直接鑒定目的DNA存在利用序列特異性引物，經(jīng)PCR進行擴增，可鑒定出陽性克隆。假如利用克隆位點兩側(cè)序列設(shè)計引物進行PCR，再結(jié)合序列分析，便能可靠地證實插入片段方向、序列和閱讀框正確性。

第142頁第142頁3.核酸雜交法慣用于從文庫中篩選目標DNA慣用方法是將轉(zhuǎn)有外源DNA菌落或噬斑影印到硝酸纖維膜上，細菌裂解后所釋放出DNA將吸附在膜上，將膜與標識核酸探針雜交，經(jīng)過檢測探針存在即可鑒定出含有重組DNA克隆。該方法又稱為菌落或噬斑原位雜交（insituhybridizaiton）。依據(jù)核酸探針標識物不同，可經(jīng)過放射自顯影、化學(xué)發(fā)光、酶作用于底物顯色等方法來顯示探針存在位置（即陽性克隆存在位置）。第143頁第143頁菌落或噬斑原位雜交第144頁第144頁Southern印跡（SouthernBlot）第145頁第145頁4.核苷酸序列測定是最準確鑒定目的DNA辦法

測定核苷酸序列辦法主要有雙脫氧鏈末端終止法和化學(xué)降解法，尤其以前者最為慣用。針對已知序列，通過測序可明確序列和閱讀框正確性；針對未知序列，可明確序列順序，為進一步研究提供依據(jù)。第146頁第146頁戊糖（RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（DNA）脫氧核糖(deoxyribose)第147頁第147頁DNA

序

列

測

定5′端3′端CGA第148頁第148頁DNA鏈末端合成終止法第149頁第149頁第150頁第150頁DNA自動測序采取熒光替換放射性核素標識是實現(xiàn)DNA序列分析自動化基礎(chǔ)。用不同熒光分子標識四種雙脫氧核苷酸（或同一測序引物），然后進行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，經(jīng)過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基排列次序。第151頁第151頁DNA自動測序結(jié)果舉例第152頁第152頁（三）親和篩選法借助相關(guān)表示產(chǎn)物而篩選陽性克隆親和篩選法前提是重組DNA進入受體細胞后能夠表示出其編碼產(chǎn)物。慣用親和篩選法原理是基于抗原-抗體反應(yīng)或配體-受體反應(yīng)。普通做法同上述菌落或噬斑原位雜交相同，只是被檢測靶分子換成了吸附于硝酸纖維膜上蛋白質(zhì)，檢測探針換成了抗體/抗原或配體/受體。

Ab第153頁第153頁通過以上分、擇、接、轉(zhuǎn)、篩五個環(huán)節(jié)，便完畢了一次DNA克隆過程。有時為了達到某種新目的，需要對已克隆DNA進行再次克隆，該過程稱為亞克隆。亞克隆目的有各種，常見有：①實現(xiàn)目的DNA高效擴增②表示目的DNA編碼蛋白質(zhì)③對目的DNA序列進行分析④對目的DNA進行修飾（如突變、缺失、引入新限制酶切位點等）⑤取得單鏈DNA或RNA⑥鑒定目的DNA是否含有一些特殊功效亞克隆（subcloning）及其目第154頁第154頁第五節(jié)

慣用原核、真核細胞表示體系FrequentlyUsedProkaryoticandEukaryoticExpressionSystems

第155頁第155頁一、原核細胞表示體系主要利用細菌

表示外源蛋白原核表示體系主要以細菌作為宿主細胞，包括大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌、沙門氏菌、蘇云金桿菌等，其中又以大腸桿菌表示體系應(yīng)用最為廣泛和最成熟。原核表示體系既可用于原核基因表示，也可用于真核基因表示。第156頁第156頁大腸桿菌(Escherichiacoli)

遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表示載體種類齊全，表示效率高不具備真核細胞蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng)，真核基因在大腸桿菌中會合成錯誤空間構(gòu)象多肽鏈，易形成包涵體(無正確折疊立體結(jié)構(gòu))無真核生物蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，如糖基化磷酸化修飾等第157頁第157頁枯草桿菌(Bacillussubtilis)

分泌蛋白質(zhì)能力強，普通有天然立體結(jié)構(gòu)無糖基化修飾功效，培養(yǎng)液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶水解質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化表示載體第158頁第158頁其它宿主菌乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)

(可殺滅農(nóng)林害蟲，也可殺滅蚊、蠅等幼蟲，不傷害害蟲天敵，對人和動物安全無害——微生物殺蟲劑)第159頁第159頁（1）將外源基因置于強啟動子和SD順序（核糖體結(jié)合位點）控制下（2）刪除內(nèi)含子和5′非編碼區(qū)（3）維持正確開放閱讀框架（ORF）（4）mRNA穩(wěn)定且可被有效翻譯和折疊，形成蛋白質(zhì)不被降解

外源基因在原核表示體系中表示必要條件：正常轉(zhuǎn)錄與翻譯第160頁第160頁（一）影響原核表示體系有效表示外源基因原因有多個1.目的基因構(gòu)成序列是決定外源基因表示關(guān)鍵原因由于原核細胞缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，無法切除內(nèi)含子序列，故針對來自真核細胞基因，只能選擇cDNA，不能使用基因組DNA真核基因mRNA無結(jié)合細菌核糖體SD序列，cDNA起始密碼子上游非編碼序列必須刪除目的基因mRNA中密碼子應(yīng)是原核宿主細胞偏嗜密碼子，不然，表示效率會減少要讓目的基因正好插在啟動子最佳