病毒蝕斑技術(shù)

病毒蝕斑技術(shù)1952年Dulbecco噬體斑術(shù)應(yīng)用于物毒，而病蝕技術(shù)plaque成許多毒滴和究法。(一理

病毒染胞，于體質(zhì)限，釋的毒能最感的細(xì)胞周擴(kuò)。過(guò)個(gè)殖期便形一局性變胞，即毒斑。理上，個(gè)斑由初染細(xì)的個(gè)毒粒成，而項(xiàng)術(shù)常于毒粒數(shù)分病克。但實(shí)操中?，F(xiàn)個(gè)毒粒時(shí)感一細(xì)的況影滴的確性克的一，此接的毒要充分和釋對(duì)細(xì)結(jié)性毒，MDV，需單細(xì)；細(xì)釋性病毒即用相質(zhì)浮細(xì)，可用層胞但者用脂固介蓋在胞，防放病在體質(zhì)中動(dòng)固介的度病的小定，病用度低介，病用濃較的質(zhì)以將斑生速控制適的圍。蝕需顯鏡觀，1-10mm的蝕可肉計(jì)。為便肉觀，用性等料色。病細(xì)不收性，變胞便呈無(wú)蝕。毒液滴以毫升斑成位(PFU/ml)來(lái)示例如，3個(gè)細(xì)瓶平蝕是58接種為0.2ml，病的稀度則毒液的度：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)(二術(shù)用

蝕斑術(shù)以用分病的隆(無(wú)性繁殖純系)、病毒或清的滴，可蝕形和小究毒的物特。病毒物純biological

在進(jìn)血中試時(shí)常會(huì)現(xiàn)標(biāo)病株滴下，而響試驗(yàn)準(zhǔn)性,這情多于煤毒。可能由原毒的雜,或者已有許變病粒存其甚至出現(xiàn)量多的陷毒致這有必要把手上握標(biāo)毒進(jìn)純,應(yīng)用病毒斑術(shù)挑出個(gè)同純病,亦“隆”。克隆后病經(jīng)敏細(xì)胞增測(cè)定滴選用合適毒用血中試。了更效進(jìn)純,必在蓋營(yíng)瓊之用養(yǎng)洗單細(xì)上未吸的毒同要制稀的度一培瓶的斑目好不超過(guò)10個(gè)，取其近10mm是康胞的蝕。取的毒傳代兩以上一認(rèn)，性染會(huì)于“光敏”作用抑病蝕的成破宿細(xì)胞因，了性覆層培物在暗培。蝕斑少和驗(yàn)(PlaqueReductionNeutralizationTest)

蝕斑少和驗(yàn)檢測(cè)清和體一敏性高方法試以蝕數(shù)少50％血稀度作其的價(jià)試驗(yàn)使用定的毒(100PFU)與不同稀釋的量清合

后感,接種先備的層胞,再覆蓋上營(yíng)養(yǎng)脂37℃二氧化碳培箱養(yǎng)數(shù)后別計(jì)斑,用Karber法計(jì)算該清蝕中效。操作理傳統(tǒng)血中試大相。由于試的作較鎖目前國(guó)極應(yīng)用,國(guó)上沒(méi)把作一種國(guó)都接的斷法僅OIE國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生典(第六版)中為裂熱規(guī)定斷方之。(三作例赤羽病(AKV)的滴或化于55mm直的菌料養(yǎng)中養(yǎng)猴細(xì)，形單。胞培養(yǎng)間3－4天，接種量約為2000000/ml個(gè)胞選單細(xì)胞部蓋不留空的養(yǎng)用試。用細(xì)胞培養(yǎng)液AKV病毒10倍倍稀至10-7并存4。每個(gè)稀釋度的毒接3個(gè)平皿接種前棄去細(xì)培液用5mlPBS或細(xì)培液洗層胞,然后去洗液。每個(gè)平皿分別入0.2ml病毒稀釋液對(duì)組用胞養(yǎng)代，37℃二氧化培箱附小，15分鐘動(dòng)次以使毒勻布。按第4步?jīng)_未吸的病毒。取2倍濃的胞養(yǎng)液入量1.5％瓊(預(yù)熱)中，個(gè)平皿加7ml置平待卻固于37二化碳培養(yǎng)培約2天平需置(取2倍縮細(xì)培液加等的2％脂(預(yù)熱中每平加5ml，置平臺(tái)待卻固于37℃二氧碳養(yǎng)中養(yǎng)至次日結(jié)果計(jì)算

求每三培皿蝕平數(shù)組蝕斑的異符稀度的規(guī)(即10-2組平均100個(gè)斑則10-3平應(yīng)個(gè)右)，否則考慮重試。平蝕數(shù)以毒釋的數(shù)乘5，為毫升病毒液蝕斑。

(10)選取征的干斑分以頭管瓊脂層下取斑收病，后分接到先備單細(xì)培瓶中行殖傳。(11)本試采BHK21細(xì)胞可用牛行病毒(BEFV)。藍(lán)舌病血清型鑒試(紙片法抗體紙片制備①取已各血型毒以1×107蝕斑形單接綿接種周血離血清②制備徑0.5mm的性紙，121℃15分種滅菌后存干環(huán)。③取上濾片入不血型免血后空干,保存于4℃冰箱備用，用前滅水潤(rùn)病毒接種①用直6cm的料養(yǎng)培BHK21或Vero細(xì)成層。②以103PFU/0.2ml被藍(lán)舌病接于胞,吸附1h。③洗去被附病毒棄洗。覆蓋瓊脂①取2倍縮細(xì)胞養(yǎng)加等的1.5％瓊，每平加7ml，置平臺(tái)卻凝。②在瓊面按花形案上同的清紙做記。③把平放在37℃二氧化培箱養(yǎng)2天④真空出皿的濾片⑤取2倍縮細(xì)胞養(yǎng)加等的2%瓊脂每平加5ml重置37℃

二氧碳養(yǎng)培2-3天,待明顯斑制環(huán)現(xiàn)結(jié)果判定

出現(xiàn)顯制斑成(即紙位置仍持細(xì)被色)的疫血即該檢毒血型注驗(yàn)方法同可用于鹿流性血病與舌病(BTV)的鑒別。新城病毒(NDV)離取疑似患病禽組用胞培液漿,心淀取清液用16孔微量培板備成維代胞細(xì)胞長(zhǎng)成單層吸培液，每滴被病料37℃吸附2小后棄液制備1％脂BME，置40－50℃水待。吸取上述瓊脂入養(yǎng)各孔每，冷凝固成覆層把培養(yǎng)板倒置在37℃二氧碳養(yǎng)培48h。制備含％性的1%瓊脂BME，40－50℃水浴待。(吸上述脂入養(yǎng)各，孔0.5ml，冷凝固成第覆層把培養(yǎng)板倒置在37℃二氧碳養(yǎng)繼培，48小內(nèi)察果(10)挑出斑的胞病的一增和定。注：試方在品病含少情況比純細(xì)培分要感試驗(yàn)各成的制細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液用稀病)10倍199保存液4ml牛血0.8ml

3%碳酸氫鈉2.4ml雙蒸32.8ml40ml兩倍濃縮細(xì)胞養(yǎng)(配首瓊脂用)10倍199保存液20ml牛血4ml3％碳酸氫12ml1％二乙氨乙10ml(可選)雙蒸54ml100ml(置40－45℃水浴用)％脂精制脂1.5g雙蒸加至100ml(0.112MPa高滅15分鐘置40－45℃水浴備用。含中性紅兩倍縮胞養(yǎng)液(配制第二瓊用)10倍199保存液20ml牛血10ml3％碳酸氫12ml0.5％性6ml雙蒸52ml100ml(置40－45℃水浴用)說(shuō)明在二瓊中中紅最濃度為1:5000－。2％瓊精制脂2g雙蒸加至100ml(0.112MPa高滅15分鐘置40－45℃水浴備用。（6）晶溶配：

Crystalstain:stock=1g.crystalviolet99ml20%EtOHworkingsoluion=mlstock40ml95%EtOH150water---------------------------------------------------------------------------Crystalviolet-Formaldehydestain:100ml10mlformalin90mldH2O0.4gNaH2PO4(monobasic)0.65gNa2HPO4(dibasic)0.1gcrystalviolet計(jì)數(shù)Pfu/ml(oforiginalstock)=1/dilutionfactorxnumberofplaquesx1/(mlofinoculum/plate)----------------------------------EV71Plaqueassay.RDcells(1105)in200μlRPMI1640wereseededineachwell24Serialdilutionsofthedifferentviralsuspensionswereaddedtothewellsfor18hofAfterfor1hat37°C,thevirussupernatantreplacedwithDMEMcontaining2%FBSand0.8%methylcelluloseforh.Aftertheoftheanda15-minfixationstep4%formalinPBS,theplaqueswerereadbybeingstainedwith1%crystalCountswereexpressedasPFUperm