普拉康唑中四種光學(xué)異構(gòu)體的HPLC法測定

普拉康唑中四種光學(xué)異構(gòu)體的HPLC法測定普拉康唑中四種光學(xué)異構(gòu)體的HPLC法測定

[摘要]目的建立同時測定普拉康唑中4種光學(xué)異構(gòu)體含量的辦法。辦法采用高效液相色譜法對普拉康唑中4種光學(xué)異構(gòu)體的含量進行測定。色譜柱為DaicelChiralpakIC手性柱；流動相為正己烷∶乙醇〔80∶20〕，流速為1.0mL/min；檢測波長為210nm；柱溫為25℃。結(jié)果4種光學(xué)異構(gòu)體間別離度均大于1.5，檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為0.5～120μg/mL〔r≥0.9992〕，辦法回收率≥99.75%，RSD[中圖分類號]R927.2[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1673-7210〔2022〕04〔c〕-0143-04

[Abstract]ObjectiveToestablishthemethodfordeterminationof4kindsofenantiomersinPramiconazole.MethodsHPLCmethodwasadoptedtodeterminethecontentof4kindsofenantiomersinPramiconazole.ThedeterminationwasseparatedonDaicelChiralpakIC.Themobilephasewasconsistedofhexane-ethanol〔80∶20〕ataflowrateof1.0mL/minandthecolumntemperatureat25℃.Thedetectionwavelengthwas210nm.ResultsTheresolutionof4kindsofenantiomersweregreaterthan1.5.Thelinearrangeofthemwere0.5-120μg/mL〔r≥0.9992，n=8〕withanrecoveryrate≥99.75%〔RSD[Keywords]Pramiconazole；Enantiomers；Contentdetermination；HPLCmethod

普拉康唑〔Pramiconazole，A〕，化學(xué)名為1-〔4-{4-[4-〔{〔2S，4R〕-4-〔2，4-二氟苯基〕-4-[〔1H-1，2，4-三唑-1-基〕甲基]-1，3-二氧戊環(huán)-2-基}甲氧基〕苯基]哌嗪-1-基}苯基〕-3-〔丙烷-2-基〕咪唑烷酮-2-烷，是由比利時BarrierTherapeutics公司開發(fā)研制的一種新型三唑類抗真菌藥，目前在歐盟尚處于Ⅱa期臨床試驗階段，尚未上市，具有療效確切，耐受性好，不良反饋程度較輕的特點，是一種較有開展前途的廣譜抗真菌藥。該藥的抗菌機制除了抑制麥角固醇合成，還波及到降低馬拉色菌對角質(zhì)細胞的黏附及與機體固有免疫的協(xié)同作用。普拉康唑在抗念珠菌和馬拉色菌方面具有比擬明顯的優(yōu)勢，在相同劑量下表現(xiàn)出較伊曲康唑更強的抗菌能力。該藥的前體分子是伊曲康唑，兩者都對表皮癬菌、酵母菌和其他許多真菌有明顯的抗菌作用。普拉康唑作為口服藥物用于治療淺部真菌感染，如皮膚、甲、口腔外陰黏膜療效明顯，不良反饋少且程度輕。缺乏之處是臨床應(yīng)用范圍不如伊曲康唑廣，目前僅用于治療淺部真菌感染[1-19]。

普拉康唑結(jié)構(gòu)中有2個手性碳，在合成過程中可能會產(chǎn)生4種光學(xué)異構(gòu)體，除了目標(biāo)化合物普拉康唑A外，還有〔2R，4S〕-構(gòu)型的B、〔2R，4R〕-構(gòu)型的C和〔2S，4S〕-構(gòu)型的D?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。按照研發(fā)立體異構(gòu)體新藥的相關(guān)技術(shù)要求[20]，有必要建立一套完善的分析辦法對普拉康唑的光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)進行質(zhì)量控制和產(chǎn)品質(zhì)量評價。由于普拉康唑還未上市，分析辦法尚未公開，為此，本研究根據(jù)?中國藥典》2022年版二部附錄VD的相關(guān)要求[21]，建立了一套HPLC法來監(jiān)控4種光學(xué)異構(gòu)體。該色譜條件滿足對普拉康唑光學(xué)異構(gòu)體的別離要求，辦法準(zhǔn)確、快速，重現(xiàn)性好，可為普拉康唑原料藥及制劑質(zhì)量分析等工作提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀〔美國安捷倫〕。對照品A〔含量99.94%，批號151101〕、B〔含量97.45%，批號151102〕、C〔含量96.35%，批號151103〕和D〔含量96.21%，批號151104〕，均為重慶涵虛閣制藥技術(shù)開發(fā)有限公司〔下列簡稱“本公司〞〕合成、精制、標(biāo)定〔以峰面積歸一化法計主峰純度〕；普拉康唑樣品〔本公司自制，批號151001、151002、151003〕；正己烷、乙醇均為色譜純，其他試劑為分析純。2辦法與結(jié)果

2.1溶液配制

對照品溶液：分別精密稱取普拉康唑?qū)φ掌稟～D各約10mg，各置于100mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，作為濃度為100μg/mL的對照品溶液。

混合對照品溶液：將4種異構(gòu)體對照品溶液按1∶1∶1∶1的比例混合，作為濃度為25μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取普拉康唑樣品100mg，置于100mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，作為濃度為1mg/mL的供試品溶液。

2.2色譜條件

分別將A～D對照品溶液在190～400nm進行掃描，各異構(gòu)體均在210nm處有較強吸收，應(yīng)選定檢測波長為210nm。色譜柱DaicelChiralpakIC手性柱〔4.6mm×250mm，5μm〕；流動相正己烷∶乙醇〔80∶20〕；流速1.0mL/min；檢測波長210nm；柱溫25℃；進樣量10μL。

2.3系統(tǒng)適用性試驗

取普拉康唑A～D對照品溶液及其混合對照品溶液，分別進樣測定，結(jié)果說明，A～D的保存時間分別為8.18、11.15、7.78、9.12min，普拉康唑及其光學(xué)異構(gòu)體基線到達完全別離，理論板數(shù)均大于10000，別離度分別為1.72、2.96、5.92，拖尾因子均小于1.15，溶劑峰不干擾測定。色譜圖見圖2。

2.4線性試驗

分別精密稱取A～D異構(gòu)體對照品適量，加流動相溶解并搖勻稀釋，配制成約0.5、5、10、20、50、80、100、120μg/mL的系列濃度溶液，進樣測定，以峰面積A對濃度C作圖，進行線性回歸，分別得到異構(gòu)體A、異構(gòu)體B、異構(gòu)體C和異構(gòu)體D的回歸方程，結(jié)果見表1。A～D均在0.5～120μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限〔LLOD〕為0.15μg/mL，最低定量限〔LLOQ〕為0.5μg/mL。

2.5回收率試驗

按“2.1〞項下辦法，精密稱取已知4種異構(gòu)體含量的供試品各9份，分別參加含4種異構(gòu)體為高、中、低3個質(zhì)量濃度的對照品溶液各3份，作為回收率試驗溶液，依法分析，計算回收率。普拉康唑4種異構(gòu)體A、B、C、D的回收率。結(jié)果RSD均小于1.5%，說明本辦法回收率良好。見表2。

2.6精密度和穩(wěn)定性試驗

取“2.1〞項下的混合對照品溶液和供試品溶液，分別連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果RSD均小于2.0%〔n=6〕，說明本辦法精密度良好。

分別取上述混合對照品溶液和供試品溶液，于室溫放置，分別于0、2、4、6、8h進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果A～D的峰面積在8h內(nèi)的RSD均小于2.0%〔n=5〕，說明混合對照品溶液室溫放置8h穩(wěn)定。

2.7耐用性實驗

分別采用不同實驗人員，不同溫度，不同比例的流動相進行測定，別離效果均合乎要求，別離度大于1.5，可以用于普拉康唑光學(xué)異構(gòu)體的別離測定。

2.8樣品測定

取樣品適量，按“2.1〞項下辦法制備對照品溶液和供試品溶液，分別進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有與各異構(gòu)體保存時間相同的雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法以峰面積計算各異構(gòu)體的含量。見表3。

3討論

3.1色譜柱的選擇

本研究在色譜條件摸索試驗中先后測試了不同的手性色譜柱，包括蛋白質(zhì)型、手性多聚物型、5μm硅膠外表共價鍵合纖維素-三〔3，5-二氯苯基氨基〕甲酸酯型〔DaicelChiralpakIC〕等。結(jié)果說明，蛋白質(zhì)型手性色譜柱對4種光學(xué)異構(gòu)體難以實現(xiàn)基線別離，別離度小于1；手性多聚物型色譜柱可以滿足基線別離4種光學(xué)異構(gòu)體，但是如果異構(gòu)體A和C別離度要大于1.5以上，那么異構(gòu)體B的出峰時間將超過50min，且峰形較寬，不能快速、準(zhǔn)確地進行定量測定；而DaicelChiralpakIC手性色譜柱別離，普拉康唑4種光學(xué)異構(gòu)體的別離度均大于1.5，4種手性異構(gòu)體色譜峰的拖尾因子均小于1.15。出峰時間在15min以內(nèi)，所以最終選擇DaicelChiralpakIC手性色譜柱測定普拉康唑4種光學(xué)異構(gòu)體。

3.2流動相的選擇

以DaicelChiralpakIC手性色譜柱，先后篩選了正己烷-乙醇和正己烷-異丙醇系統(tǒng)。結(jié)果說明，使用正己烷-乙醇系統(tǒng)時，色譜峰形較差，拖尾嚴(yán)重；正己烷-異丙醇系統(tǒng)那么可以實現(xiàn)良好的別離。通過調(diào)整一系列不同比例的正己烷-異丙醇流動相，最終選擇以正己烷-異丙醇〔80∶20〕為流動相，可以顯著地提高別離度和理論塔板數(shù)，優(yōu)化色譜峰的柱效、別離度及出峰時間。

3.3流速及柱溫的選擇

本研究還考察了儀器的流速及柱溫對異構(gòu)體別離度的影響，結(jié)果說明，改變流速和柱溫對異構(gòu)體的別離影響較小，綜合考慮，選擇流速為1.0mL/min，柱溫25℃，試驗說