福建不同源的流感毒株的NS基因遺傳進(jìn)化分析,病毒學(xué)論文

福建不同源的流感毒株的NS基因遺傳進(jìn)化分析,病毒學(xué)論文禽流感(AvianInfluenza)是由A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征,該病毒由8個(gè)基因片段構(gòu)成,華而不實(shí)最短的一個(gè)基由于非構(gòu)造基因(non-structuralgene,NS)。病毒復(fù)制經(jīng)過中,NS基因編碼一個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本,該轉(zhuǎn)錄本可被選擇性的剪切并表示出兩個(gè)重要的功能蛋白,分別是26kDa的NS1蛋白和14kDa的NEP(nuclearexportprotein,NEP)蛋白(通常被稱為NS2蛋白)。NS1蛋白以二聚體形式存在,在病毒的復(fù)制經(jīng)過中發(fā)揮著重要的作用,mRNA的合成、剪切、蛋白磷酸化甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡都與這個(gè)蛋白禽流感(AvianInfluenza)是由A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征,該病毒由8個(gè)基因片段構(gòu)成,華而不實(shí)最短的一個(gè)基由于非構(gòu)造基因(non-structuralgene,NS)。病毒復(fù)制經(jīng)過中,NS基因編碼一個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本,該轉(zhuǎn)錄本可被選擇性的剪切并表示出兩個(gè)重要的功能蛋白,分別是26kDa的NS1蛋白和14kDa的NEP(nuclearexportprotein,NEP)蛋白(通常被稱為NS2蛋白)。NS1蛋白以二聚體形式存在,在病毒的復(fù)制經(jīng)過中發(fā)揮著重要的作用,mRNA的合成、剪切、蛋白磷酸化甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡都與這個(gè)蛋白相關(guān)。同時(shí),有研究表示清楚該蛋白在非特異性免疫反響中會(huì)抑制Ⅰ型干擾素的合成。NS1蛋白含有兩個(gè)核定位信號(hào)區(qū),華而不實(shí)34~38位氨基酸殘基的Asp-Arg-Leu-Arg-Arg信號(hào)區(qū)非常保守,在所有的甲型流感病毒中都一樣。第二個(gè)信號(hào)區(qū)位于203~230位氨基酸殘基處,大多數(shù)甲型流感病毒中都有這一序列。NS1蛋白是決定AIV對(duì)感染細(xì)胞的毀壞力的關(guān)鍵因素,影響AIV的致病性和毒力;NS2具有調(diào)節(jié)非構(gòu)造蛋白合成的作用,在病毒感染細(xì)胞經(jīng)過發(fā)揮重要的作用。在細(xì)胞感染流感病毒的早期就可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)有大量的NS1聚集,細(xì)胞漿內(nèi)也有NS1聚集;而NS2合成較晚,主要存在于細(xì)胞漿,可以在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)。當(dāng)前福建省分離的禽源流感毒株包括H5N1、H6N6、H9N2等亞型,本研究擬對(duì)福建省雞源、鴨源、鵝源等不同源的流感毒株的NS基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,進(jìn)一步討論福建省不同亞型之間和同一亞型內(nèi)不同毒株的NS基因與國(guó)內(nèi)代表株禽流感病毒NS基因的特性差異,為進(jìn)一步了解福建省不同亞型禽流感病毒的NS基因遺傳進(jìn)化關(guān)系及毒力變異奠定基礎(chǔ),為深切進(jìn)入了解流感病毒的致病機(jī)制與NS基因之間交互作用提供理論根據(jù)。1、材料與方式方法1.1材料9~10日齡SPF雞胚購(gòu)自北京梅利亞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。2株雞源禽流感病毒FZ-04、FZ-11株,5株鴨源禽流感病毒A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)、A/Duck/Fujian/FQ107/2007(H9N2)、A/duck/Fujian/MH/2003(H9N2)、A/Duck/Fujian/FZ01/08(H9N2)、A/Muscovyduck/Fujian/CL/1997(H9N2)毒株均由本禽病室于1997-2018年從福建地區(qū)分離保存,毒株分離與增殖見文獻(xiàn)。大腸桿菌DH5由本室保存。1.2儀器和試劑凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD)、PCR儀(Eppendorf公司),Trizol購(gòu)自In-vitrogen。膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自美國(guó)OmegaBio-Tek公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5感受態(tài)細(xì)胞自制。AMV反轉(zhuǎn)錄酶、ExTaqDNA聚合酶和pMD18-T載體均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。1.3引物設(shè)計(jì)FZ-04株禽流感病毒NS基因特異引物以下為參考文獻(xiàn)。反轉(zhuǎn)錄引物序列為5-AG-CAAAAGCAGG-3。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.4毒株NS基因擴(kuò)增毒株分離、增殖以及病毒RNA提取詳見文獻(xiàn)。用流感的反轉(zhuǎn)錄引物Uni-12,根據(jù)AMV反轉(zhuǎn)錄酶講明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增以cDNA為模板,反響體系為50L:10Buffer5L,dNTPmixture(2.5nmol/L)4L,Ex-TaqDNApolymerase0.5L,引物(20mol/L)各1L,模板cDNA1L,ddH2O37.5L。反響條件:94℃預(yù)變性5min,按94℃30s,55℃35s,72℃2min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。取5L產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。1.5NS基因的遺傳進(jìn)化分析將毒株NS基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞,PCR方式方法鑒定重組質(zhì)粒,陽性質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序。分別應(yīng)用DNAstar5.0和MEGA4.0分析軟件(ByClust-alWMethod)對(duì)NS基因序列與GenBank中登錄的國(guó)內(nèi)流感病毒典型代表株及福建省不同時(shí)期分離的H5N1、H9N2和H6N6亞型流感毒株進(jìn)行核苷酸序列同源性比擬和遺傳進(jìn)化分析。遺傳進(jìn)化分析所牽涉的毒株見表1。2、結(jié)果2.1NS基因核苷酸測(cè)序結(jié)果及核苷酸同源性分析FZ-04、FZ-11毒株NS基因擴(kuò)增的長(zhǎng)度均為887bp,GenBank基因登錄號(hào)分別為KF550969、KF550968。由DNAstar軟件分析可知,兩個(gè)毒株NS1基因完好的閱讀框?yàn)?54bp(從27~680bp),編碼217個(gè)氨基酸;NS2基因編碼區(qū)則由27~56bp及529~864bp構(gòu)成,共編碼121個(gè)氨基酸,不存在氨基酸缺失或插入現(xiàn)象。MegAlign軟件分析可知,FZ-04株與福建株CK/FJ/G9/09(H9N2)同源性最高(99.0%),FZ-11株與廣西省馬源分離株EQ/GX/3/2018(H9N2)同源性最高(99.4%)。FZ-04,FZ-11毒株與福建H5N1毒株同源性分別為88.2%~89.3%,88.3%~89.2%;與福建H9N2毒株的同源性分別為92.7%~99.0%,93.2%~99.4%;與疫苗株CK/SD/6/96同源性分別為92.6%、93.2%,與國(guó)內(nèi)H5N1代表株GS/GD/1/96同源性最低,分別為70.8%和70.6%,與福建省H6N6代表株同源性分別為89.6%和90.1%。2.2NS基因遺傳進(jìn)化分析從遺傳進(jìn)化樹分析可知(圖1),福建省H5、H9亞型禽流感毒株分別聚合在兩個(gè)不同的大分支上。GenBank中與本研究的兩株病毒NS基因親緣關(guān)系近期的毒株為CK/FJ/G9/09株,與國(guó)內(nèi)高致病性禽流感代表株GS/GD/1/96遺傳距離最遠(yuǎn),CK/BJ/1/94毒株位于進(jìn)化分析的根部,表示清楚其余的H9N2亞型毒株都是該毒株與其他亞系毒株之間基因溝通的產(chǎn)物。NS基因與廣西省馬源流感株EQ/GX/3/2018遺傳距離很近,可能是禽源流感病毒基因重組后感染了馬類造成的。福建省禽流感NS1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖2和表2),FZ-04和FZ-11毒株NS1蛋白羧基末端存在13個(gè)氨基酸缺失,與福建省分離的H9N2亞型毒株序列長(zhǎng)度一樣,而福建省H5N1毒株NS1蛋白80-84位有5個(gè)氨基酸缺失,總長(zhǎng)度為225bp。本研究中福建省H9N2毒株的NS1蛋白羧基端不存在PL基序(ESEV/EPEV),而國(guó)內(nèi)初次分離的高致病性GS/GD/1/96代表株和福建9株H5N1病毒SW/FJ/F1/01、GS/FJ/bb/03、CK/FJ/9821/05等存在ESEV基序,有一株病毒CK/FJ/1/07(H5N1)則呈現(xiàn)GSEV遺傳多態(tài)性。3、討論根據(jù)NS基因核苷酸同源性不同分為A和B兩個(gè)等位基因群,群內(nèi)同源性相比照較高。A群包含禽源和哺乳動(dòng)物源流感病毒,而B群主要包含禽源流感病毒和一種馬流感,有研究報(bào)道A等位基因群中歐亞H9N2亞型流感毒株又被分為3個(gè)不同的亞群,分別為DK/HK/Y280/97株為代表的Y280亞群、DK/HK/Y439/97株為代表的Y439亞群及QA/HK/G1/97株為代表的G1亞群。本研究中所牽涉的毒株GS/GD/1/96屬于B等位基因群,其他的都屬于A等位基因群。根據(jù)GenBank提交的序列信息可知,福建省分離的禽源流感毒株當(dāng)前已見報(bào)道的有3種亞型,分別是H5N1、H9N2和H6N6亞型,福建H9N2亞型毒株都屬于Y280亞群,而福建H5N1流感毒株則屬于Y439亞群,H6N6亞型鴨源DK/FJ/FZ01/08株則是獨(dú)立的一分支。本研究中FZ-04和FZ-11的NS1基因編碼217個(gè)氨基酸,其羧基末端存在13個(gè)氨基酸缺失,早期報(bào)道野外分離的禽流感病毒的某些毒株,NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失現(xiàn)象,而最近幾年研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)低致病性毒株羧基端存在氨基酸缺失現(xiàn)象,本研究中福建省H9N2毒株都存在羧基末端氨基酸缺失現(xiàn)象,與其亞群代表株Y280不同,Y280株不存在基因缺失現(xiàn)象。令人感興趣的是,本研究的21株病毒中僅福建H5N1高致病性流感毒株NS1蛋白80-84位有5個(gè)氨基酸缺失(圖2),而H9N2亞型毒株和H6N6毒株在這幾個(gè)位點(diǎn)不存在缺失現(xiàn)象,這能否可作為福建省區(qū)分高致病性和低致病性禽流感病毒的標(biāo)志之一,有待于進(jìn)一步研究。近年來關(guān)于NS1蛋白這幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸缺失的報(bào)道比擬多,歐新華等報(bào)道從湖南長(zhǎng)沙市禽類農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分離到8株H5N1病毒的NS1蛋白80-84位點(diǎn)均存在氨基酸缺失。福建省AIV的NS1氨基酸序列中有11個(gè)氨基酸位點(diǎn)高度保守(分別是第55、69、77、87、103、106、118、129、143、152和185位),已有研究證實(shí)第69位和第77位氨基酸位點(diǎn)突變會(huì)影響NS蛋白正確的亞細(xì)胞定位,進(jìn)而減弱病毒的復(fù)制能力;同時(shí),有研究報(bào)道稱103、106位氨基酸位點(diǎn)分別從L(亮氨酸)突變成F(苯丙氨酸)和I(異亮氨酸)突變成M(蛋氨酸),將會(huì)加強(qiáng)禽源和人源流感毒株的毒力,其他7個(gè)氨基酸位點(diǎn)在不同亞型上(H5N1或H9N2)氨基酸不同,而同一亞型內(nèi)(H5N1或H9N2)的毒株的7個(gè)氨基酸位點(diǎn)一樣(見表2),這能否能夠成為福建省高致病性H5N1株和低致