聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR

關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR第1頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

一、PCR的定義：

PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴增技術(shù)。近年來發(fā)展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。第2頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

DNA擴增的傳統(tǒng)方法：一般采用分子克隆法，需將構(gòu)建的含有目的基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞進行擴增，并需要用探針進行篩選，牽扯到DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及探針雜交等技術(shù)，雖然技術(shù)上已無難點，但操作復(fù)雜，需數(shù)周到數(shù)月的時間，且不利于普及。第3頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

PCR技術(shù)：1985年由美國Cetus公司的KaryMullis

首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。優(yōu)點：敏感度高、特異性強、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便等，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實驗室，大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對目的基因進行分析、鑒定。

KaryMullis

本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎。第4頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

二、PCR的原理：

用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。

以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5′末端和3′末端互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。第5頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合，基本反應(yīng)步驟分三步：1.變性

(Denaturation)：加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。94℃30″2.退火(復(fù)性)(Annealling):

突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡單的特點，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。55℃30″第6頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

3.延伸

(Extension):

將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下，以引物的3′端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈。72℃1′

上述3步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～40個循環(huán)后DNA可擴增106～109倍。第7頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第8頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五第10頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

PCR擴增的特異性是由一對寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期，原來的DNA擔(dān)負(fù)起使模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴增產(chǎn)物是介于兩種引物5’端之間的DNA片段。第11頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

三、PCR的成分和作用：終濃度

1.緩沖液：

10

～50mMTris-Cl(pH8.4)

維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性

25～50mMKCl

促進引物退火，>50mM會抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白

(BSA)

對酶有一定的保護性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙?；腂SA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。第12頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.MgCl2:

1.5

～2.0mMTaq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應(yīng)的特異性和擴增片段的產(chǎn)量，過量能增加非特異擴增并影響產(chǎn)率，過低則酶活性顯著下降。第13頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物

0.02～0.2mMdNTPs可與Mg2+結(jié)合，應(yīng)注意Mg2+濃度與dNTPs

濃度之間的關(guān)系，Mg2+濃度比dNTPs濃度高0.2～2.5mM。過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實驗的精確性。第14頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五4.引物(Primer-P)：預(yù)擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

0.2～1μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。第15頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五5.TaqDNA聚合酶：耐高熱

0.5～5U/100μl

1U/25～50μl

偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴增偏低：產(chǎn)物量降低第16頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五6.模板DNA(Template):

最低102

～105bpDNA片段，實際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此量，用量需在實驗中摸索。1～5μl

過高：非特異產(chǎn)物增加過低：產(chǎn)量降低7.水：

去離子水，補足整個反應(yīng)體積。第17頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

四、PCR反應(yīng)體系：

常用30μl

各種成分的實際用量應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲備液濃度進行核算。第18頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五10×buffer：1×30/10=3μlMgCl2:1.5×30/25=1.8μldNTPs:0.2×30/10=0.6μl

引物P：0.4×30×2/10=2.4μlTaq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl

模板：1μl

水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl第19頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

操作：

5份標(biāo)本總體積30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，依次加入下列試劑：

10×buffer：3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×6=3.6μl

引物P：2.4μl×6=14.4μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：21μl×6=126μl

共174μl，先用移液器/指彈混勻，后用離心機瞬時混勻（管壁上液體沉至管底）。第20頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五2.另取5支0.2mlEp管，分別加入上述液體29μl。3.分別取標(biāo)本模板各1μl，加入上述5支Ep管中，混勻，分別加入2滴液體石蠟（防止加溫過程中液體蒸發(fā)影響反應(yīng)體積），離心機瞬時離心，備用。4.反應(yīng)條件：PCR擴增儀

94℃30″，55℃30″，72℃1′，

35個循環(huán)，72℃延伸5′。

第21頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

五、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、溫度、循環(huán)參數(shù)：

⑴變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90～95℃，30～60s，再復(fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。第22頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

⑵復(fù)性溫度和時間：

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長度和G+C含量確定，長度在15～25bp之間時，復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般位于40～60℃，30～60s。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。第23頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

⑶延伸溫度和時間：一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70～75℃。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，<1Kb，1分鐘足夠；>1Kb需加長延伸時間，10Kb片段延伸時間可達15分鐘。延伸時間過長可出現(xiàn)非特異擴增，常用72℃1′。

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⑷循環(huán)數(shù)：其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。第25頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

2、MgCl2濃度：可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性

1.5

～2.0mM

過高：增加非特異擴增并影響產(chǎn)率過低：酶活性顯著下降。

第26頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

3、引物：

0.2～1μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。引物設(shè)計原則：總原則是提高擴增的效率和特異性第27頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五

引物設(shè)計原則⑴長度15～30b，過短特異性降低，過長則成本增加，產(chǎn)量也下降。⑵引物堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右。⑶引物內(nèi)部不能含有自身互補序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3’末端不應(yīng)有互補鏈存在，不然會形成引物二聚體。第28頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五引物設(shè)計原則⑷引物的堿基順序不應(yīng)與非擴增區(qū)域有同源性(<70%)或少于連續(xù)8個的互補堿基。要求在引物設(shè)計時采用計算機進行輔助檢索分析。⑸引物的5′末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。最多可游離10個堿基并不影響PCR反應(yīng)進行。第29頁，共34頁，2023年，2月20日，星期五引物設(shè)計原則⑹引物的3′

末端堿基：原則上要求引物的3′末端與模板DNA一定要配對，另外3′末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，