口腔疾病分子生物學(xué)-分子生物學(xué)基礎(chǔ)及基本研究方法

分子生物學(xué)研究的主要方法分子克隆的材料與方法分子克隆的主要步驟特異核酸的檢測目的及要求熟悉分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)掌握與基因有關(guān)的基本概念，尤其是重組DNA技術(shù)的概念和步驟分子克隆技術(shù)DNA分子的無性繁殖技術(shù)建立依賴于幾種因子的發(fā)現(xiàn)與運(yùn)用限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、質(zhì)粒（一）限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。三種限速酶Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型Ⅱ型限制性內(nèi)切酶具有以下幾個(gè)特征特定的識別序列，4~6個(gè)堿基對在識別序列內(nèi)固定位置切割，切割后5’–端磷酸基因，3’-端羥基基團(tuán)切割后形成粘性或平齊末端（二）DNA連接酶質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于染色體外的環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制其上基因可借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)得以表達(dá)分子2000~50000bpTpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126pGEM-Tvectormap8構(gòu)建質(zhì)粒的特點(diǎn)Ori區(qū)：復(fù)制起點(diǎn)Par區(qū)：保證質(zhì)粒均勻分布于子細(xì)胞多克隆區(qū)：人為構(gòu)建，便于克隆操作。含有多個(gè)單一限制性內(nèi)切酶酶切點(diǎn)。選擇因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑選(四)噬菌體概念是侵染細(xì)菌、螺旋體、真菌等的病毒。結(jié)構(gòu)溫和噬菌體和毒性噬菌體噬菌斑是分子生物學(xué)中重要的DNA載體目前廣泛使用的噬菌體有λ-噬菌體，M13噬菌體，（五）轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化是指受體菌捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程。細(xì)菌種屬及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，轉(zhuǎn)化條件和過程均不一樣。感受態(tài)必須存在。即使同一菌屬中，各菌株達(dá)到感受態(tài)的的條件和時(shí)機(jī)也存在差別。氯化鈣處理大腸桿菌以提高細(xì)胞膜的通透性。轉(zhuǎn)染專指受體菌捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)利用噬菌體顆粒為媒介，將外源DNA轉(zhuǎn)移至受菌體并得到表達(dá)的生命過程。分子克隆的主要步驟1.基因文庫的建立2.目的基因的篩選3.目的基因的分析分子克隆常用技術(shù)DNA電泳：可分離不同分子量的DNA基因轉(zhuǎn)移核酸雜交聚合酶鏈反應(yīng)PCR

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW核酸雜交原理：在一定條件下（溫度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開并分離在一定條件下，兩股游離的互補(bǔ)的核苷酸可自行配對形成雙股SouthernBlot電泳、轉(zhuǎn)移、雜交確定分子量斑點(diǎn)雜交目標(biāo)序列的存在目標(biāo)序列的量PCR與齲病相關(guān)微生物的定量檢測方法細(xì)菌形態(tài)生化反應(yīng)免疫反應(yīng)分子生物學(xué)方法----分子探針雜交----RFLP----PCR唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測中的應(yīng)用在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關(guān)系更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測中的應(yīng)用抽提細(xì)菌染色體DNA(Igarashietal.1996)----細(xì)菌----唾液PCR反應(yīng)過程第一次PCR反應(yīng)預(yù)變性:94℃4min變性:94℃1min退火:51℃1min30cycles延伸:72℃2min最后延伸:72℃5min第二次PCR反應(yīng)套式PCR快速檢測人類唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌.譚海平，邊專，樊明文，陳智，范兵.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2003，38：223-226唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測中的應(yīng)用套式PCR(NestedPCR)5′3′TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′3′Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′3′ThesecondPCRproduct本套式PCR的引物是分別根據(jù)變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設(shè)計(jì)的內(nèi)、外兩套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

Ladder123456第一次PCR的靈敏度變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的靈敏度變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW

abcdefghLadder12345678選擇外引物行第一次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析以變鏈菌組(MutansStreptococci)染色體DNA為模板Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.MW(Kb)2.01.0

0.250.10.750.5

abcdefghLadder12345678選擇內(nèi)引物行第二次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000LadderMW(Kb)2.00.750.51.00.250.1

Ladder12345MW1.0(Kb)0.750.50.250.1

Ladder12345MW2.0(Kb)1.00.250.10.750.5ABLane1.chromosomalDNAfromS.mutansIngbritt;2.chromosomalDNAfromS.sobrinus6715;3.salivasamplefromsubjectA;4.salivasamplefromsubjectB;5.salivasamplefromsubjectC.利用PCR直接從唾液樣本中檢測變形鏈球菌S.mutans和茸毛鏈球菌S.sobrinus(圖A)利用外引物(圖B)利用內(nèi)引物結(jié)論套式PCR能快速在人類唾液中同時(shí)檢測變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌。該檢測方法有望運(yùn)用于臨床檢測,對揭示兩種細(xì)菌與齲病發(fā)生關(guān)系的研究具有一定價(jià)值。生命的主要遺傳物質(zhì)-DNADNA的復(fù)制基因表達(dá)中心法則基因表達(dá)的調(diào)節(jié)目的及要求掌握：生命的主要遺傳物質(zhì)；DNA的復(fù)制；基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)；中心法則。Mid-19thCentury

Mendel’sLawsofInheritance(孟德爾的遺傳法則)GregorMendel,1822-1884371869Nuclein(核素)DeoxyribonucleicAcid-DNA(脫氧核糖核酸)ProteinRibonucleicAcid-RNA(核糖核酸) FriedrichMiescher,1844-1895381910

TheChromosomeTheory(染色體學(xué)說)ThomasHuntMorgan,1866-1945ChromosomeGenesDNAProteinRNA???391944GenesOswaldAvery,1877-1955DNA40一、生命的主要遺傳物質(zhì)----DNA（一）對遺傳物質(zhì)的認(rèn)識什么是遺傳物質(zhì)？蛋白質(zhì)20種氨基酸DNA四種堿基轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明……核酸的組成、分布及基本化學(xué)結(jié)構(gòu)1.高分子化合物；2.單體為核苷酸，其包括：一個(gè)磷酸分子、一個(gè)糖分子、一個(gè)堿基;3.根據(jù)核苷酸的組成又分為DNA和RNA；4.DNA與RNA的分布；5.四種堿基：A、C、G、T/UDNA與RNA的區(qū)別DNARNA糖脫氧核糖核糖堿基腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤尿嘧啶結(jié)構(gòu)雙鏈單鏈DNA結(jié)構(gòu)的推衍Chargaff’rules:T+C=A+G A=T G=CWatson和Crick推導(dǎo)出：DNA是兩條鏈組成，相互平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制的特點(diǎn)新合成的子代DNA與親代DNA完全一樣，保證了遺傳的穩(wěn)定性。DNA的復(fù)制1.復(fù)制子：一個(gè)單獨(dú)的DNA復(fù)制單位。每一個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)序列，又稱復(fù)制原點(diǎn)，也常含有一個(gè)末端序列，復(fù)制的過程在此終止。復(fù)制是在起始階段控制的，一旦開始復(fù)制，就會(huì)繼續(xù)進(jìn)行下去，直到復(fù)制完成2.參與DNA復(fù)制中的酶和蛋白因子DNA多聚酶種類DNA多聚酶Ⅲ是DNA復(fù)制的主要合成酶。合成DNA還需要下列因素：DNA的前體材料，四種脫氧核苷三磷酸Mg離子的存在一小段DNA或RNA分子的3’-OH一個(gè)DNA模板DNA多聚酶的另一個(gè)重要特征是具有3’→5’方向的內(nèi)切酶功能。DNA復(fù)制的方式半保留復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制由于DNA多聚酶只能從5’→3’方向合成DNA，因而半保留復(fù)制不能完全解釋。引導(dǎo)鏈：5’→3’方向的DNA合成滯后鏈：3’→5’方向，岡崎片段基因編碼蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的遺傳信息的基本單位，是染色體或基因組的一段DNA序列(對以RNA作為遺傳信息載體的RNA病毒而言則是RNA序列)。包括編碼序列(外顯子)、編碼區(qū)前后對于基因表達(dá)具有調(diào)控功能的序列和單個(gè)編碼序列間的間隔序列(內(nèi)含子)。基因的表達(dá)1.DNA的遺傳信息是通過蛋白質(zhì)的合成，再由蛋白質(zhì)發(fā)揮各自特定功能的表達(dá)。2.DNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。3.蛋白質(zhì)的合成是通過RNA來完成。RNA（單鏈）信使RNA（mRNA)核糖體RNA（rRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA)RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄:在RNA多聚酶作用下，以DNA為模板合成RNA的過程。由RNA多聚酶合成從DNA上特定起始序列（啟動(dòng)子）開始，至終止信號結(jié)束內(nèi)含子與外顯子轉(zhuǎn)錄的模板和方向：有意義鏈：模板鏈（3’→5’DNA鏈）反義鏈：非模板鏈2.RNA多聚酶與啟動(dòng)子啟動(dòng)子：能特異性地與RNA多聚酶結(jié)合，引發(fā)RNA合成。從DNA上特定起始序列（啟動(dòng)子）開始，至終止信號結(jié)束3.轉(zhuǎn)錄的起始與延伸4.內(nèi)含子和外顯子的概念原核生物：基因是連續(xù)的DNA片段真核生物：基因由若干個(gè)不連續(xù)的DNA片段組成的。內(nèi)含子：插入序列，它是位于基因的內(nèi)部，能夠被轉(zhuǎn)錄的一段DNA。但在轉(zhuǎn)錄后，與之相應(yīng)的那部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在拼接中被去掉了。外顯子：基因中與成熟的mRNA相對應(yīng)的DNA片段，它不僅包括蛋白質(zhì)編碼的部分，而且包括5’和3’末端不翻譯的前導(dǎo)序列和尾隨序列。釉原蛋白基因表達(dá)示意圖遺傳密碼的性質(zhì)所有的密碼都是由三個(gè)連續(xù)的核苷酸組成，相鄰的兩個(gè)密碼之間沒有間隔的核苷酸存在3個(gè)終止密碼子UAA,UGA,UAG，起始密碼子：AUG密碼子具有兼并性通用性蛋白質(zhì)的生物合