分子生物學基本技能訓練

分子生物學基本技能訓練第1頁/共74頁

電泳層析離心分光光度基因操作其它

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉（化宿主細胞）

篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）基本模式“縱向”體系“橫向”體系第2頁/共74頁1理論部分基因工程原理生化技術原理新技術講座2實驗部分分子生物學實驗生化技術實驗3示教和錄像部分實驗原理實驗技術第3頁/共74頁基因工程原理第4頁/共74頁基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價連接形成重組DNA分子。重組DNA質粒DNA基因片段第5頁/共74頁1972年,P.Berg:構建第一個DNA重組分子1997年,動物克隆:克隆羊多莉1977年，基因工程產(chǎn)品的出現(xiàn)

H.W.Boyer,第一個基因工程產(chǎn)品(SS)1973年,S.S.Cohen:第一個基因克隆實驗2001年，人類基因組計劃第6頁/共74頁EcoRIBoyer和Cohen的實驗Boyer和Cohen的實驗pSC101pR6-5大腸桿菌第7頁/共74頁pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因第8頁/共74頁培養(yǎng)平皿卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌四環(huán)素平板第9頁/共74頁抗四環(huán)素抗卡那霉素抗四環(huán)素\抗卡那霉素第10頁/共74頁人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調節(jié)多種激素的作用從動物腦中提取:5mg50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌培養(yǎng)液第11頁/共74頁大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因第12頁/共74頁大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因目的基因基因載體第13頁/共74頁

目的基因基因載體重組體分切接轉篩表總體技術路線第14頁/共74頁目的基因及載體的分離1目的基因的獲取需要克隆的DNA片段：化學合成法

cDNA文庫基因組DNA文庫聚合酶鏈式反應分分分第15頁/共74頁1）化學合成法：較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測序引物定點突變核酸雜交探針第16頁/共74頁2）基因文庫限制性內切酶……克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫第17頁/共74頁基因組DNA文庫限制性內切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝第18頁/共74頁cDNA文庫的組建：基因重組反轉錄酶mRNAcDNA第19頁/共74頁引物引物3’5’5’5’3）PCR技術基因組第20頁/共74頁PCR技術的基本過程模板DNAdNTP引物Buffer預變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃第21頁/共74頁2載體DNA的選擇功能：

為目的基因提供進入受體細胞的轉移能力。為目的基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。為目的基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力。第22頁/共74頁目的基因整合在宿主細胞染色體DNA中獨立于宿主細胞染色體DNA外（獨立的復制子功能）基因載體第23頁/共74頁理想載體的基本條件：可轉移性合適的復制位點多克隆位點：廣泛、特異選擇標志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA第24頁/共74頁質粒噬菌體腺病毒載體逆轉錄病毒載體……種類：第25頁/共74頁

存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。

具有自我復制功能。帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標記物。經(jīng)改造后具有多克隆位點。舉例：pBR322質粒質粒第26頁/共74頁第27頁/共74頁宿主細胞ori第28頁/共74頁抗Amp宿主細菌含Amp培養(yǎng)基第29頁/共74頁多種酶切口多克隆位點限制性內切酶單一酶切口第30頁/共74頁多克隆位點ori復制起始點遺傳標記Amppolylinker基因載體第31頁/共74頁

噬菌體載體50kb+LARALARAEcoRⅠEcoRⅠlacZcI第32頁/共74頁限制性內切酶酶切切酶切第33頁/共74頁第34頁/共74頁限制性內切核酸酶

在特異位點上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識別序列呈回文對稱命名：酶來源的生物名稱縮寫屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序第35頁/共74頁

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列第36頁/共74頁5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’第37頁/共74頁

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）第38頁/共74頁磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶目的基因與載體的連接接第39頁/共74頁

T4-DNA連接酶：T4-噬菌體連接溫度：不高于粘性末端熔點溫度（Tm）≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；第40頁/共74頁連接方式：

相同粘性末端的連接平頭末端的連接不同粘性末端的連接人工粘性末端的連接

第41頁/共74頁粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶第42頁/共74頁平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA第43頁/共74頁重組體的轉化受體細胞轉第44頁/共74頁JM109感受態(tài)含氨芐平板Am重組質粒感受態(tài)第45頁/共74頁原核細胞的轉化（細菌轉化）1)受體細胞的選擇限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉化親和型：較高的可轉化性遺傳互補型：利于篩選感染缺陷型：防止感染第46頁/共74頁2）轉化方法CaCl2誘導轉化電穿孔PEG介導轉化人工體外包裝特殊處理受體細胞細胞膜特性改變第47頁/共74頁CaCl2處理受體細菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細菌重組體轉入細菌第48頁/共74頁基因重組轉染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝第49頁/共74頁3）轉化率：轉化細胞/細胞總數(shù)影響因素：

載體：載體性質、空間結構、分子大小等受體細胞轉化過程第50頁/共74頁含氨芐平板連接目的基因基因載體連接酶轉化重組體克隆的篩選與鑒定篩宿主細胞第51頁/共74頁轉化后的克隆群體：第52頁/共74頁1遺傳檢測法1）抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第53頁/共74頁2）標志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段第54頁/共74頁X-galLacZ藍色化合物X-gal第55頁/共74頁（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶第56頁/共74頁2電泳檢測法凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質粒重組質粒

重組質粒酶切重組質粒的PCR擴增片段第57頁/共74頁原位雜交3菌落雜交篩選法第58頁/共74頁4免疫化學檢測法放射性抗體檢測法濾膜（固定抗體）+第59頁/共74頁5DNA序列檢測ACTGAAGGCT第60頁/共74頁外源基因在宿主細胞中的表達重組子目的基因的mRNA表達蛋白質大腸桿菌（E.coli）受體細胞表第61頁/共74頁1E.coli表達體系優(yōu)勢：

一種成熟的基因克隆表達的受體細胞繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制易于進行遺傳操作和高效表達第62頁/共74頁不足之處：1）缺乏適當?shù)霓D錄后和翻譯后加工機制。2）缺乏表達蛋白質復性系統(tǒng)，表達蛋白無特異性空間結構。3）表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解。第63頁/共74頁2目的基因在E.coli中的高效表達三個因素：

強化蛋白質的生物合成抑制蛋白質的降解恢復蛋白質的空間構象第64頁/共74頁3目的基因表達產(chǎn)物的檢測1）蛋白質的PAGE對照樣品Marker第65頁/共74頁2）表達蛋白生物學功能檢測淀粉酶基因表達第66頁/共74頁4目的蛋白的分離純化分子篩親和柱離子交換抗原抗體目的蛋白第67頁/共74頁基因載體目的基因

質粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫限制性內切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉化轉染體外包裝帶重組體的宿主細胞

表型篩選電泳法核酸雜交免疫學方法目