分子生物學(xué)課件

分子生物學(xué)課件第1頁(yè)/共49頁(yè)3，順式作用序列（cis-actingsequence）4，順式作用第2頁(yè)/共49頁(yè)二、正、負(fù)控制系統(tǒng)對(duì)操縱元的控制（一）可誘導(dǎo)操縱元及可阻遏操縱元1，可誘導(dǎo)操縱元(incucibleoperon)（1）可誘導(dǎo)操縱元的定義（2）誘導(dǎo)（induction）（3）誘導(dǎo)物（inducer）第3頁(yè)/共49頁(yè)2，可阻遏操縱元（repressibleoperon）（1）可阻遏操縱元的定義（2）阻遏（repression）（3）輔阻遏物（corepressor）第4頁(yè)/共49頁(yè)（二）操縱元的狀態(tài)1，轉(zhuǎn)錄活性開放2，轉(zhuǎn)錄活性關(guān)閉3，正、負(fù)控制操縱元的狀態(tài)（圖8－1）負(fù)控制操縱元的誘導(dǎo)和阻遏正控制操縱元的誘導(dǎo)和阻遏不可誘導(dǎo)/超阻遏組成型表達(dá)第5頁(yè)/共49頁(yè)（三）正、負(fù)控制系統(tǒng)的遺傳學(xué)特征1，負(fù)控制系統(tǒng)的特征2，正控制系統(tǒng)的特征第6頁(yè)/共49頁(yè)第二節(jié)

操縱元的原型——

乳糖操縱元一、操縱元模型的提出（一）酶的誘導(dǎo)及阻遏現(xiàn)1，細(xì)菌半乳糖苷酶合成的誘導(dǎo)2，細(xì)菌色氨酸合成酶合成的阻遏3，安慰誘導(dǎo)物第7頁(yè)/共49頁(yè)（二）大腸桿菌乳糖代謝系統(tǒng)1，乳糖代謝相關(guān)酶及其基因（1）乳糖代謝相關(guān)酶（2）lacZYA基因第8頁(yè)/共49頁(yè)2，lacZYA系統(tǒng)的突變體研究

（1）部分二倍體（partialdiploid）（2）lacO的作用為順式作用（3）lacI的作用為反式作用（4）不可誘導(dǎo)的突變（不論有無(wú)誘導(dǎo)物均不能合成Lac酶系統(tǒng)）lacIS突變lacP突變第9頁(yè)/共49頁(yè)（三）操縱元模型1，Jacob-Monod操縱元模型（1）操縱元的結(jié)構(gòu)（2）操縱元各組分的作用2，操縱元的完整概念第10頁(yè)/共49頁(yè)二、乳糖操縱元的調(diào)控機(jī)理（一）lac操縱元1，lac操縱元的結(jié)構(gòu)2，lac操縱元的調(diào)控第11頁(yè)/共49頁(yè)（二）lac操縱元的本底組成型合成1，原因一2，原因二（三）半乳糖苷酶的作用（圖8-4）第12頁(yè)/共49頁(yè)三、阻遏蛋白與操作子的相互作用（一）操作子上與阻遏蛋白結(jié)合的位點(diǎn)1，lacI基因的表達(dá)特點(diǎn)低效率組成型第13頁(yè)/共49頁(yè)2，lac操作子（lacO）與阻遏蛋白的結(jié)合（1）阻遏蛋白與lacO結(jié)合的實(shí)驗(yàn)證據(jù)可以分離到阻遏蛋白與lacO結(jié)合的復(fù)合物這種結(jié)合可被IPTG所抑制lacOcDNA片段不能與阻遏蛋白結(jié)合第14頁(yè)/共49頁(yè)（2）lacO與阻遏蛋白結(jié)合的位點(diǎn)及其結(jié)構(gòu)A，DNA內(nèi)切核酸酶消化實(shí)驗(yàn)證明：受阻遏蛋白保護(hù)區(qū)域位于-5~+21(26bp)B，阻遏蛋白保護(hù)位點(diǎn)：甲基化實(shí)驗(yàn)確認(rèn)被保護(hù)的嘌呤紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)被保護(hù)的胸腺嘧啶第15頁(yè)/共49頁(yè)第16頁(yè)/共49頁(yè)C，lacO

的結(jié)構(gòu)及其與阻遏蛋白的結(jié)合性質(zhì)lacODNA序列的對(duì)稱性：以+11為對(duì)稱軸，兩側(cè)為兩段各6bp的對(duì)稱序列第17頁(yè)/共49頁(yè)第18頁(yè)/共49頁(yè)與阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)主要位于近軸對(duì)稱序列：+3~19的嘌呤、+1~+22的多數(shù)胸腺嘧啶與RNA聚合酶接觸lacO組成型突變位點(diǎn)大多位于左側(cè)第19頁(yè)/共49頁(yè)第20頁(yè)/共49頁(yè)左側(cè)序列與阻遏蛋白結(jié)合的親和力高3，阻遏蛋白對(duì)RNA聚合酶功能的影響（1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同時(shí)與DNA結(jié)合（2）阻遏蛋白與DNA的結(jié)合能增強(qiáng)RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子的能力（RNA聚合酶與的平衡常數(shù)從1.9*107增加到2.5*109）第21頁(yè)/共49頁(yè)（3）阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶與lac啟動(dòng)子上形成一個(gè)很強(qiáng)的關(guān)閉式的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄的起始（4）阻遏蛋白的這種作用對(duì)操縱元的誘導(dǎo)也有促進(jìn)意義阻遏蛋白的存在促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合一旦加入誘導(dǎo)物，阻遏蛋白總體上將加快誘導(dǎo)過(guò)程第22頁(yè)/共49頁(yè)（4）上述模式不一定適用于其他系統(tǒng)原因一：RNA聚合酶、阻遏蛋白、啟動(dòng)子/操作子之間的相互作用不同原因二：不同系統(tǒng)中操作子與啟動(dòng)子的相對(duì)位置不一致第23頁(yè)/共49頁(yè)（二）阻遏蛋白上與操作子結(jié)合的位點(diǎn)1，阻遏蛋白單體的結(jié)構(gòu)用胰蛋白酶消化阻遏蛋白單體可得到（1）長(zhǎng)頭片段（longheadpiece），由1-59位Aa殘基構(gòu)成，有與操作子結(jié)合的能力。短頭片段核心片段長(zhǎng)頭片段抗胰蛋白酶核心鉸鏈區(qū)051-528159-60360第24頁(yè)/共49頁(yè)（2）短頭片段胰蛋白酶還可將長(zhǎng)頭片段切割為短頭片段（1-51位Aa殘基）由螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）結(jié)構(gòu)構(gòu)成兩個(gè)螺旋嵌入DNA的大溝中，與特定的堿基結(jié)合。這個(gè)區(qū)域通過(guò)一個(gè)鉸鏈區(qū)與蛋白質(zhì)的主體相連短頭片段核心片段長(zhǎng)頭片段抗胰蛋白酶核心鉸鏈區(qū)051-528159-60360第25頁(yè)/共49頁(yè)（3）核心片段（core）具有形成四聚體及與誘導(dǎo)物結(jié)合的能力由兩個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)區(qū)域的兩端有兩個(gè)α螺旋，螺旋之間是6股平行β折疊。誘導(dǎo)物結(jié)合在兩個(gè)區(qū)域之間的一個(gè)裂隙之中C末端是一個(gè)向外伸出的α螺旋，由兩組7個(gè)亮氨酸的重復(fù)序列構(gòu)成。第26頁(yè)/共49頁(yè)（4）鉸鏈區(qū)由52-80位Aa殘基構(gòu)成當(dāng)阻遏蛋白以DNA結(jié)合形式存在時(shí)，鉸鏈形成一個(gè)小的α螺旋；當(dāng)阻遏蛋白不與DNA結(jié)合時(shí)，該區(qū)域是無(wú)序的。第27頁(yè)/共49頁(yè)2，阻遏蛋白四聚體的結(jié)構(gòu)四個(gè)阻遏蛋白單體的C末端螺旋相互結(jié)合，維持四聚體的結(jié)構(gòu)第28頁(yè)/共49頁(yè)二聚體的兩個(gè)單體核心片段的N-端之間的有一個(gè)疏松的界面，一個(gè)供誘導(dǎo)物結(jié)合的裂隙，和一個(gè)疏水核心第29頁(yè)/共49頁(yè)3，阻遏蛋白與操作子的結(jié)合阻遏蛋白以頭部片段與操作子DNA結(jié)合。第30頁(yè)/共49頁(yè)頭部片段可獨(dú)立于核心片段與操作子結(jié)合，但其親和力比完整的阻遏蛋白低許多個(gè)數(shù)量級(jí)。因?yàn)橥暾淖瓒舻鞍卓梢砸詢蓚€(gè)頭部片段同時(shí)與操作子結(jié)合，這將極大地提高與操作子的親和力第31頁(yè)/共49頁(yè)4，阻遏蛋白需要組成四聚體才能實(shí)現(xiàn)完全的阻遏作用（1）lac系統(tǒng)存在多個(gè)操作子O1：位于lacZ基因起始位點(diǎn)，與阻遏蛋白親和力最高O2：位于起始位點(diǎn)下游410bpO3：位于O1上游83bp第32頁(yè)/共49頁(yè)（2）阻遏蛋白四聚體可以同時(shí)與兩個(gè)操作子結(jié)合阻遏蛋白同時(shí)與O1和O2或O3之一結(jié)合，使兩個(gè)操作子之間的DNA形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。第33頁(yè)/共49頁(yè)（3）阻遏蛋白結(jié)合第二個(gè)操作子影響阻遏的水平去除O2或O3，阻遏效率降低2-4倍去除O2、O3，阻遏效率降低100倍。第34頁(yè)/共49頁(yè)（三）阻遏蛋白與操作子的解離1，誘導(dǎo)物與操作子上的阻遏蛋白直接結(jié)合的證據(jù)阻遏蛋白與操作子的結(jié)合很穩(wěn)定，而誘導(dǎo)作用很快實(shí)驗(yàn)證明，誘導(dǎo)物是可以與結(jié)合在操作子上的阻遏蛋白結(jié)合的第35頁(yè)/共49頁(yè)2，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白的結(jié)合立即改變阻遏蛋白的構(gòu)象，使頭部片段與核心片段的相對(duì)方向改變，導(dǎo)致阻遏蛋白二聚體的頭部片段不再同時(shí)與DNA結(jié)合，從而降低操作子與阻遏蛋白結(jié)合的親和力第36頁(yè)/共49頁(yè)3，阻遏蛋白與不同DNA的結(jié)合（1）不同形式的阻遏蛋白與不同DNA結(jié)合的特異性DNA阻遏蛋白（結(jié)合常數(shù)）阻遏蛋白+誘導(dǎo)物（結(jié)合常數(shù)）操作子2×10132×1010其他DNA2×1062×106特異性107104第37頁(yè)/共49頁(yè)（2）細(xì)胞內(nèi)阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)阻遏蛋白的高親和力（特異性）結(jié)合位點(diǎn)：一個(gè)（lacO）阻遏蛋白的底親和力（非特異性）結(jié)合位點(diǎn)：4.2×106第38頁(yè)/共49頁(yè)（3）細(xì)胞內(nèi)阻遏蛋白的存在方式無(wú)誘導(dǎo)物存在時(shí)：一個(gè)阻遏蛋白與lacO結(jié)合，其余阻遏蛋白全部隨機(jī)結(jié)合在其他DNA序列上有誘導(dǎo)物存在時(shí)：阻遏蛋白全部隨機(jī)結(jié)合在其他DNA序列上第39頁(yè)/共49頁(yè)第40頁(yè)/共49頁(yè)（四）影響阻遏蛋白與操作子相互作用的突變體1，i-突變體（1）突變的分子效應(yīng)：不能形成二聚體或四聚體，或形成四聚體卻不能和DNA結(jié)合第41頁(yè)/共49頁(yè)（2）突變位點(diǎn)：不能形成四聚體的突變位于220~280殘基之間，其他突變分布于整個(gè)核心片段（3）突變表型：隱性/組成型第42頁(yè)/共49頁(yè)2，iS突變體（1）突變的分子效應(yīng)：不能與誘導(dǎo)物結(jié)合，或與誘導(dǎo)物結(jié)合后不能產(chǎn)生別構(gòu)效應(yīng)（2）突變位點(diǎn)：分布于62~300個(gè)Aa殘基之間，190~300較集中，呈26個(gè)殘基的周期性（3）突變表型：顯性/超阻遏第43頁(yè)/共49頁(yè)3，it突變體（1）突變的分子效應(yīng)：阻遏蛋白與lacO緊密結(jié)合（2）突變位點(diǎn)：分布于50個(gè)Aa殘基的頭部片段中（3）突變表型：顯性/不可誘導(dǎo)第44頁(yè)/共49頁(yè)4，i-d突變體（1）突變的分子效應(yīng)：lacI基因的等位基因互補(bǔ)等位基因互補(bǔ)：當(dāng)多亞基蛋白質(zhì)由不同等位基因編碼的亞基構(gòu)成時(shí)，異源多聚體蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生改變，雜合蛋白質(zhì)的活性不同與任何一種同源多聚體蛋