發(fā)育生物學五周簡

發(fā)育生物學五周簡第1頁/共64頁一、程序性細胞死亡PCD（programmedcelldeath）又稱細胞凋亡

(apoptosis)（在體內(nèi)外因素誘導下，由基因嚴格調控而發(fā)生的自主性細胞有序死亡。）1、概念一個固有的遺傳程序即生物鐘，在一個受控制的時間和空間內(nèi)激活，從而導致細胞死亡。第2頁/共64頁細胞凋亡與程序性細胞死亡

意義大致相同，二者可交互使用。比較說來程序性細胞死亡側重于發(fā)育學功能上描述；強調死亡發(fā)生的時間；適用于胚胎細胞。細胞凋亡偏重于病理形態(tài)描述；強調細胞死亡的方式；適用于所有細胞。第3頁/共64頁蝌蚪尾的消失脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育發(fā)育過程中手和足的成形過程第4頁/共64頁2、簡史1885年，F(xiàn)lemming第一個描述有關細胞凋亡的特征；（染色質濃縮形成半月形）1914年，Graper用這種死亡現(xiàn)象解釋胚胎發(fā)育中器官收縮等現(xiàn)象1951年，Glucksmann發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中存在這種死亡，并詳細描述；60年代，Lockshin和Williams首次提出‘‘程序性細胞死亡’’這一概念第5頁/共64頁1986年，Robert

Horvitz等發(fā)現(xiàn)線蟲中ced3（caspase），ced4（Apaf-1）是促凋亡基因。1980年，Wyllie等發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活有關。

“DNAladder”是細胞凋亡發(fā)生的標志；1965年，JohnKerr提出“固縮性壞死”概念；1972年，Kerr，Wyllie，Currie提出“細胞凋亡”（apoptosis）的概念；第6頁/共64頁二、PCD/細胞凋亡的形態(tài)變化(1)細胞皺縮變圓，微絨毛、復合體消失；出芽(budding)膜空泡化（blebbing)(2)胞質濃縮、細胞器結構保留(3)核濃縮；染色質凝聚(4)凋亡小體形成胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(內(nèi)含DNA物質及細胞器)，形成的膜包顆粒即凋亡小體（apoptosisbody）

(5)吞噬第7頁/共64頁三、PCD/細胞凋亡的生理和生化變化磷脂酰絲氨酸外翻：annexinV基因轉錄和蛋白質合成：

與細胞骨架降解有關的酶谷胱甘肽轉移酶、組織蛋白酶D、組織型纖維蛋白酶原激活劑等

與細胞和凋亡小體形態(tài)維持有關的蛋白質

簇因子、r-谷丙轉氨酶等Ca2+、Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶活化：降解DNA，形成180-200bp或其倍數(shù)的DNA片段第8頁/共64頁PCD/細胞凋亡與壞死的區(qū)別★第9頁/共64頁細胞壞死(necrosis)

指由于某些外界毒性刺激（如局部缺血、高熱、物理和化學損傷或生物的侵襲等），直接作用于細胞導致的細胞急速死亡，一般伴有炎癥反應。

一般過程：因補體反應或烈性病毒感染破壞了質膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進入細胞，從而導致細胞吸水膨脹，最終破膜而死。第10頁/共64頁細胞凋亡與細胞壞死是多細胞生物細胞死亡的兩種不同形式，在形態(tài)學、生化代謝、分子機制、結局和意義等方面都有本質的區(qū)別。

細胞壞死特征：溶酶體釋放酶，細胞器瓦解，細胞骨架降解，細胞核破裂、降解，蛋白質合成終止，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應第11頁/共64頁細胞壞死細胞凋亡1.性質病理性生理性或病理性2.誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能4.形態(tài)變化細胞腫脹、細胞結構全面溶解、破壞胞膜及細胞器相對完整，細胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈梯狀條帶6.炎癥反應溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應7.凋亡小體無有8.基因調控無有表8－1細胞凋亡與細胞壞死的比較第12頁/共64頁三、胚胎發(fā)育中的程序性細胞死亡（PCD）

（一）PCD參與了各器官的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育。1、肢體的發(fā)生2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育3、腭的發(fā)生4、管（腔）道的形成5、晶狀體的發(fā)育6、心的發(fā)育7、生殖細胞的發(fā)生8、免疫、造血系統(tǒng)的發(fā)生9、無用結構的退化消失（弓動脈、前腎、中腎、尾芽、鰓膜等）第13頁/共64頁實驗將17期的雞胚翅芽后緣的細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時仍發(fā)生死亡。將17期的雞胚翅芽后緣以外的細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時不發(fā)生死亡。

證明雞胚翅芽后緣細胞的死亡有著預定的時間和空間程序。第14頁/共64頁（二）胚胎發(fā)育中PCD的意義1、系統(tǒng)匹配淘汰沒有作用或不再起作用的細胞，以確保有功能細胞的營養(yǎng)和空間。2、除去短暫結構：人胚尾芽3、雕刻軀體從而形成正常、精細復雜的生物體。4、保護機體：如胸腺的發(fā)育、損傷的胚胎細胞第15頁/共64頁四、PCD/細胞凋亡的調節(jié)（一）激素水平的調節(jié)：甲狀腺素（蝌蚪）、糖皮質激素（胸腺cell）、苗勒抑制物質（中腎旁管）等誘導PCD雌激素及卵泡刺激素（顆粒細胞）、胰島素（晶狀體上皮細胞）等抑制PCD（二）細胞因子調節(jié)主要是生長因子：NGF，F(xiàn)GF，TGF，G-CSF等缺乏導致PCD第16頁/共64頁（三）PCD相關基因/蛋白的調節(jié)1、TNF死亡受體超家族（1）死亡受體：Fas、TNFRI等（2）與死亡受體有關的含死亡結構域的信號蛋白：FADD（FAS相關死亡蛋白）、TRADD（TNFRI相關死亡蛋白）等第17頁/共64頁（1）死亡受體：Fas、TNFRI等結構特點：

胞內(nèi)C-端：胞內(nèi)功能區(qū)由80個氨基酸構成的死亡結構域（deathdomain，DD）

跨膜區(qū)

胞外N-端：胞外功能區(qū)內(nèi)含數(shù)個半胱氨酸第18頁/共64頁（2）含有死亡結構域的信號蛋白TRADD（TNFR相關死亡蛋白）：34kD，C端的DD與TNFRI，F(xiàn)ADD的DD結合FADD（Fas相關死亡蛋白）

（MORT-1）：23kD，C-端含有一個DD(deathdomain)，可與Fas結合；N-端含有

MORT結構域或死亡效應結構域（DED:deatheffectordomain），可與

proCaspase-8（FLICE）的DED結合第19頁/共64頁Fas(Apo-1,CD95):43kD

（三聚體FasL-----Fas------FADD（Fas相關死亡蛋白）--------proCaspase-8）(

DISC/死亡誘導信號復合物):活化Bid、caspase-3

DED:deatheffectordomainTNFRI（TNFR55）：55-60kD，TNFRI-------TRADD（TNFR相關死亡蛋白）------FADD--------proCaspase-8

DDDEDDDDDDED第20頁/共64頁Fas/FasLDD:deathdomain第21頁/共64頁凋亡誘導因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第22頁/共64頁2.凋亡蛋白酶Caspase:

cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特異蛋白水解酶）一組對底物的天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。(1)定義第23頁/共64頁（2）Caspase的分類及功能凋亡啟動亞類(DED、CARD)凋亡效應亞類細胞因子加工亞類（ICE亞類）第24頁/共64頁Caspases激活的瀑布學說(級聯(lián)反應)第25頁/共64頁(3)結構特征①以無活性的酶原形式存在；②N端均含有一段前區(qū)域（內(nèi)含DED、CARD)；CARD:CaspaseActivationandRecruitmentDomain第26頁/共64頁④在大亞基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2個大亞基和2個小亞基組成的雜四聚體；ActiveenzymeCatalyticsites第27頁/共64頁(4)

Caspase的作用底物

①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD)CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶(具有內(nèi)切酶活性)ICADCADDNACaspase第28頁/共64頁②核纖層（lamina）蛋白細胞核lamina染色體第29頁/共64頁③細胞骨架蛋白：導致細胞解體，形成凋亡小體

④其他的caspases⑤滅活細胞凋亡的抑制物第30頁/共64頁3、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1)

130kD，N-端含有一半胱氨酸蛋白酶募集域（CARD），C-端由12個WD-40重復片段組成。凋亡體/死亡復合體：Cytc-Apaf-1-dATP

（閉合的單體聚合成開放的七聚體）Cytc-Apaf-1-dATP-proCaspase-9第31頁/共64頁凋亡復合體CARD:Caspase ActivationandRecruitmentDomain第32頁/共64頁4、線粒體膜間隙蛋白（線粒體釋放的凋亡相關因子）細胞色素C，凋亡誘導因子，Apaf-1,Ca2+,

Smac/DIABLO等5、自由基活性氧自由基（超氧陰離子自由基、羥自由基及單線態(tài)氧，H2O2等）：誘導PCD的發(fā)生?；钚缘杂苫篘O—高濃度促PCD，低濃度抑制PCD第33頁/共64頁6、P53基因阻滯細胞G1期，修復受損的DNA，如修復失敗則通過多種途徑誘導細胞凋亡。（射線、毒素）分子警察第34頁/共64頁P53的促凋亡機制：（1）DNA結合蛋白，調控基因（BAX等)轉錄（細胞核途徑）（2）激活線粒體途徑（3）誘導Fas增加（4）誘導溶酶體的不穩(wěn)定性第35頁/共64頁7、BcL-2家族3個亞家族抗凋亡蛋白亞家族（BcL-2亞家族）含多區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（Bax亞家族）僅含BH3區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（BH3亞家族）基本結構特征：跨膜結構域

BcL-2同源結構域（BH）第36頁/共64頁第37頁/共64頁第38頁/共64頁

BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族通過蛋白與蛋白相互作用調節(jié)著細胞的存活與凋亡。第39頁/共64頁第40頁/共64頁Bcl-2（B

celllymphoma/leukemia-2）

：

Bcl-2

是第一個被確認有抗凋亡作用，由229aa構成（鼠236）分布在線粒體膜,內(nèi)質網(wǎng)，核膜等處。

Bcl-2

和C.elegans

中的ced-9

有很高的同源性，具有促進細胞存活的功能。第41頁/共64頁BcL-2抗凋亡機制：①直接抗氧化；②調節(jié)PTP（線粒體通透性轉換孔）開放；③抑制Bax，Bak的促凋亡作用；④抑制Caspases激活；⑤維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)。第42頁/共64頁8、凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）

IAP家族是一組抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的主要結構域：BIR

（baculoviralIAPrepeat),鋅指結構域、CARD。BIR2是IAP

抑制凋亡的結構基礎。作用機制：抑制caspase-3,7,9等的活性。第43頁/共64頁Figure1SchematicdiagramofdomainstructureinrepresentativeIAPs第44頁/共64頁凋亡細胞DNA的斷裂形成高分子量的DNA大片斷（50kb)形成180－200bp整數(shù)倍的DNA小片斷非Caspase依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活Caspase依賴的內(nèi)源性核酸酶激活(CAD)9.核酸內(nèi)切酶第45頁/共64頁

Caspase8

Caspase3

Caspase9

Cleavageofsubstrates

Nucleus

DegradationofDNACAD激活方式細胞膜第46頁/共64頁DNA斷裂與“梯狀條帶”第47頁/共64頁第48頁/共64頁（二）、PCD的主要途徑1.膜受體通路(死亡受體通路/外源性通路)腫瘤壞死因子死亡受體(TNFR)家族中的死亡受體：Fas／CD95，TNFR第49頁/共64頁Fas/FasLDD:deathdomain第50頁/共64頁死亡受體通路凋亡誘導因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第51頁/共64頁2.線粒體通路（內(nèi)源性途徑）線粒體通透性轉換孔（MPTP）：由內(nèi)膜的腺苷轉位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道）構成的蛋白復合體。第52頁/共64頁第53頁/共64頁1、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞與細胞凋亡的一致性；

Δψm下降時PTP開放導致細胞凋亡

Δψm正常時無細胞凋亡

2、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞早于核DNA的斷裂。第54頁/共64頁??線粒體信號通路smacSmac:secondmitochondria-derivedactivatorofcaspaseIAPs(-)ApoptosisinducingfactorInhibitorsofapoptosisproteinapoptoticproteaseactiviationfactor第55頁/共64頁凋亡誘導因素死亡受體/配體的表達、結合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisBid活化線粒體通路活化死亡受體通路與線粒體通路的