發(fā)育生物學(xué)五周簡(jiǎn)

發(fā)育生物學(xué)五周簡(jiǎn)第1頁/共64頁一、程序性細(xì)胞死亡PCD（programmedcelldeath）又稱細(xì)胞凋亡

(apoptosis)（在體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，由基因嚴(yán)格調(diào)控而發(fā)生的自主性細(xì)胞有序死亡。）1、概念一個(gè)固有的遺傳程序即生物鐘，在一個(gè)受控制的時(shí)間和空間內(nèi)激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第2頁/共64頁細(xì)胞凋亡與程序性細(xì)胞死亡

意義大致相同，二者可交互使用。比較說來程序性細(xì)胞死亡側(cè)重于發(fā)育學(xué)功能上描述；強(qiáng)調(diào)死亡發(fā)生的時(shí)間；適用于胚胎細(xì)胞。細(xì)胞凋亡偏重于病理形態(tài)描述；強(qiáng)調(diào)細(xì)胞死亡的方式；適用于所有細(xì)胞。第3頁/共64頁蝌蚪尾的消失脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育發(fā)育過程中手和足的成形過程第4頁/共64頁2、簡(jiǎn)史1885年，F(xiàn)lemming第一個(gè)描述有關(guān)細(xì)胞凋亡的特征；（染色質(zhì)濃縮形成半月形）1914年，Graper用這種死亡現(xiàn)象解釋胚胎發(fā)育中器官收縮等現(xiàn)象1951年，Glucksmann發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中存在這種死亡，并詳細(xì)描述；60年代，Lockshin和Williams首次提出‘‘程序性細(xì)胞死亡’’這一概念第5頁/共64頁1986年，Robert

Horvitz等發(fā)現(xiàn)線蟲中ced3（caspase），ced4（Apaf-1）是促凋亡基因。1980年，Wyllie等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活有關(guān)。

“DNAladder”是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志；1965年，JohnKerr提出“固縮性壞死”概念；1972年，Kerr，Wyllie，Currie提出“細(xì)胞凋亡”（apoptosis）的概念；第6頁/共64頁二、PCD/細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化(1)細(xì)胞皺縮變圓，微絨毛、復(fù)合體消失；出芽(budding)膜空泡化（blebbing)(2)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)保留(3)核濃縮；染色質(zhì)凝聚(4)凋亡小體形成胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)(內(nèi)含DNA物質(zhì)及細(xì)胞器)，形成的膜包顆粒即凋亡小體（apoptosisbody）

(5)吞噬第7頁/共64頁三、PCD/細(xì)胞凋亡的生理和生化變化磷脂酰絲氨酸外翻：annexinV基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成：

與細(xì)胞骨架降解有關(guān)的酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、組織蛋白酶D、組織型纖維蛋白酶原激活劑等

與細(xì)胞和凋亡小體形態(tài)維持有關(guān)的蛋白質(zhì)

簇因子、r-谷丙轉(zhuǎn)氨酶等Ca2+、Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶活化：降解DNA，形成180-200bp或其倍數(shù)的DNA片段第8頁/共64頁P(yáng)CD/細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別★第9頁/共64頁細(xì)胞壞死(necrosis)

指由于某些外界毒性刺激（如局部缺血、高熱、物理和化學(xué)損傷或生物的侵襲等），直接作用于細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞急速死亡，一般伴有炎癥反應(yīng)。

一般過程：因補(bǔ)體反應(yīng)或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞吸水膨脹，最終破膜而死。第10頁/共64頁細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是多細(xì)胞生物細(xì)胞死亡的兩種不同形式，在形態(tài)學(xué)、生化代謝、分子機(jī)制、結(jié)局和意義等方面都有本質(zhì)的區(qū)別。

細(xì)胞壞死特征：溶酶體釋放酶，細(xì)胞器瓦解，細(xì)胞骨架降解，細(xì)胞核破裂、降解，蛋白質(zhì)合成終止，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)第11頁/共64頁細(xì)胞壞死細(xì)胞凋亡1.性質(zhì)病理性生理性或病理性2.誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈刺激，隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生3.生化特點(diǎn)被動(dòng)過程，無新蛋白合成，不耗能主動(dòng)過程，有新蛋白合成，耗能4.形態(tài)變化細(xì)胞腫脹、細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整，細(xì)胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈梯狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對(duì)完整，局部無炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控?zé)o有表8－1細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的比較第12頁/共64頁三、胚胎發(fā)育中的程序性細(xì)胞死亡（PCD）

（一）PCD參與了各器官的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育。1、肢體的發(fā)生2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育3、腭的發(fā)生4、管（腔）道的形成5、晶狀體的發(fā)育6、心的發(fā)育7、生殖細(xì)胞的發(fā)生8、免疫、造血系統(tǒng)的發(fā)生9、無用結(jié)構(gòu)的退化消失（弓動(dòng)脈、前腎、中腎、尾芽、鰓膜等）第13頁/共64頁實(shí)驗(yàn)將17期的雞胚翅芽后緣的細(xì)胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時(shí)仍發(fā)生死亡。將17期的雞胚翅芽后緣以外的細(xì)胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時(shí)不發(fā)生死亡。

證明雞胚翅芽后緣細(xì)胞的死亡有著預(yù)定的時(shí)間和空間程序。第14頁/共64頁（二）胚胎發(fā)育中PCD的意義1、系統(tǒng)匹配淘汰沒有作用或不再起作用的細(xì)胞，以確保有功能細(xì)胞的營養(yǎng)和空間。2、除去短暫結(jié)構(gòu)：人胚尾芽3、雕刻軀體從而形成正常、精細(xì)復(fù)雜的生物體。4、保護(hù)機(jī)體：如胸腺的發(fā)育、損傷的胚胎細(xì)胞第15頁/共64頁四、PCD/細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)（一）激素水平的調(diào)節(jié)：甲狀腺素（蝌蚪）、糖皮質(zhì)激素（胸腺cell）、苗勒抑制物質(zhì)（中腎旁管）等誘導(dǎo)PCD雌激素及卵泡刺激素（顆粒細(xì)胞）、胰島素（晶狀體上皮細(xì)胞）等抑制PCD（二）細(xì)胞因子調(diào)節(jié)主要是生長因子：NGF，F(xiàn)GF，TGF，G-CSF等缺乏導(dǎo)致PCD第16頁/共64頁（三）PCD相關(guān)基因/蛋白的調(diào)節(jié)1、TNF死亡受體超家族（1）死亡受體：Fas、TNFRI等（2）與死亡受體有關(guān)的含死亡結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白：FADD（FAS相關(guān)死亡蛋白）、TRADD（TNFRI相關(guān)死亡蛋白）等第17頁/共64頁（1）死亡受體：Fas、TNFRI等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

胞內(nèi)C-端：胞內(nèi)功能區(qū)由80個(gè)氨基酸構(gòu)成的死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain，DD）

跨膜區(qū)

胞外N-端：胞外功能區(qū)內(nèi)含數(shù)個(gè)半胱氨酸第18頁/共64頁（2）含有死亡結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白TRADD（TNFR相關(guān)死亡蛋白）：34kD，C端的DD與TNFRI，F(xiàn)ADD的DD結(jié)合FADD（Fas相關(guān)死亡蛋白）

（MORT-1）：23kD，C-端含有一個(gè)DD(deathdomain)，可與Fas結(jié)合；N-端含有

MORT結(jié)構(gòu)域或死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED:deatheffectordomain），可與

proCaspase-8（FLICE）的DED結(jié)合第19頁/共64頁Fas(Apo-1,CD95):43kD

（三聚體FasL-----Fas------FADD（Fas相關(guān)死亡蛋白）--------proCaspase-8）(

DISC/死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物):活化Bid、caspase-3

DED:deatheffectordomainTNFRI（TNFR55）：55-60kD，TNFRI-------TRADD（TNFR相關(guān)死亡蛋白）------FADD--------proCaspase-8

DDDEDDDDDDED第20頁/共64頁Fas/FasLDD:deathdomain第21頁/共64頁凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達(dá)、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第22頁/共64頁2.凋亡蛋白酶Caspase:

cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特異蛋白水解酶）一組對(duì)底物的天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。(1)定義第23頁/共64頁（2）Caspase的分類及功能凋亡啟動(dòng)亞類(DED、CARD)凋亡效應(yīng)亞類細(xì)胞因子加工亞類（ICE亞類）第24頁/共64頁Caspases激活的瀑布學(xué)說(級(jí)聯(lián)反應(yīng))第25頁/共64頁(3)結(jié)構(gòu)特征①以無活性的酶原形式存在；②N端均含有一段前區(qū)域（內(nèi)含DED、CARD)；CARD:CaspaseActivationandRecruitmentDomain第26頁/共64頁④在大亞基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2個(gè)大亞基和2個(gè)小亞基組成的雜四聚體；ActiveenzymeCatalyticsites第27頁/共64頁(4)

Caspase的作用底物

①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD)CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶(具有內(nèi)切酶活性)ICADCADDNACaspase第28頁/共64頁②核纖層（lamina）蛋白細(xì)胞核lamina染色體第29頁/共64頁③細(xì)胞骨架蛋白：導(dǎo)致細(xì)胞解體，形成凋亡小體

④其他的caspases⑤滅活細(xì)胞凋亡的抑制物第30頁/共64頁3、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1)

130kD，N-端含有一半胱氨酸蛋白酶募集域（CARD），C-端由12個(gè)WD-40重復(fù)片段組成。凋亡體/死亡復(fù)合體：Cytc-Apaf-1-dATP

（閉合的單體聚合成開放的七聚體）Cytc-Apaf-1-dATP-proCaspase-9第31頁/共64頁凋亡復(fù)合體CARD:Caspase ActivationandRecruitmentDomain第32頁/共64頁4、線粒體膜間隙蛋白（線粒體釋放的凋亡相關(guān)因子）細(xì)胞色素C，凋亡誘導(dǎo)因子，Apaf-1,Ca2+,

Smac/DIABLO等5、自由基活性氧自由基（超氧陰離子自由基、羥自由基及單線態(tài)氧，H2O2等）：誘導(dǎo)PCD的發(fā)生。活性氮自由基：NO—高濃度促PCD，低濃度抑制PCD第33頁/共64頁6、P53基因阻滯細(xì)胞G1期，修復(fù)受損的DNA，如修復(fù)失敗則通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（射線、毒素）分子警察第34頁/共64頁P(yáng)53的促凋亡機(jī)制：（1）DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因（BAX等)轉(zhuǎn)錄（細(xì)胞核途徑）（2）激活線粒體途徑（3）誘導(dǎo)Fas增加（4）誘導(dǎo)溶酶體的不穩(wěn)定性第35頁/共64頁7、BcL-2家族3個(gè)亞家族抗凋亡蛋白亞家族（BcL-2亞家族）含多區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（Bax亞家族）僅含BH3區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（BH3亞家族）基本結(jié)構(gòu)特征：跨膜結(jié)構(gòu)域

BcL-2同源結(jié)構(gòu)域（BH）第36頁/共64頁第37頁/共64頁第38頁/共64頁

BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族通過蛋白與蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞的存活與凋亡。第39頁/共64頁第40頁/共64頁Bcl-2（B

celllymphoma/leukemia-2）

：

Bcl-2

是第一個(gè)被確認(rèn)有抗凋亡作用，由229aa構(gòu)成（鼠236）分布在線粒體膜,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜等處。

Bcl-2

和C.elegans

中的ced-9

有很高的同源性，具有促進(jìn)細(xì)胞存活的功能。第41頁/共64頁BcL-2抗凋亡機(jī)制：①直接抗氧化；②調(diào)節(jié)PTP（線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔）開放；③抑制Bax，Bak的促凋亡作用；④抑制Caspases激活；⑤維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)。第42頁/共64頁8、凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）

IAP家族是一組抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的主要結(jié)構(gòu)域：BIR

（baculoviralIAPrepeat),鋅指結(jié)構(gòu)域、CARD。BIR2是IAP

抑制凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。作用機(jī)制：抑制caspase-3,7,9等的活性。第43頁/共64頁Figure1SchematicdiagramofdomainstructureinrepresentativeIAPs第44頁/共64頁凋亡細(xì)胞DNA的斷裂形成高分子量的DNA大片斷（50kb)形成180－200bp整數(shù)倍的DNA小片斷非Caspase依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活Caspase依賴的內(nèi)源性核酸酶激活(CAD)9.核酸內(nèi)切酶第45頁/共64頁

Caspase8

Caspase3

Caspase9

Cleavageofsubstrates

Nucleus

DegradationofDNACAD激活方式細(xì)胞膜第46頁/共64頁DNA斷裂與“梯狀條帶”第47頁/共64頁第48頁/共64頁（二）、PCD的主要途徑1.膜受體通路(死亡受體通路/外源性通路)腫瘤壞死因子死亡受體(TNFR)家族中的死亡受體：Fas／CD95，TNFR第49頁/共64頁Fas/FasLDD:deathdomain第50頁/共64頁死亡受體通路凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達(dá)、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD第51頁/共64頁2.線粒體通路（內(nèi)源性途徑）線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）：由內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道）構(gòu)成的蛋白復(fù)合體。第52頁/共64頁第53頁/共64頁1、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞與細(xì)胞凋亡的一致性；

Δψm下降時(shí)PTP開放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡

Δψm正常時(shí)無細(xì)胞凋亡

2、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞早于核DNA的斷裂。第54頁/共64頁??線粒體信號(hào)通路smacSmac:secondmitochondria-derivedactivatorofcaspaseIAPs(-)ApoptosisinducingfactorInhibitorsofapoptosisproteinapoptoticproteaseactiviationfactor第55頁/共64頁凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體/配體的表達(dá)、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisBid活化線粒體通路活化死亡受體通路與線粒體通路的