顯微鏡的使用課件

動物染色體制備——小鼠骨髓染色體HAT培養(yǎng)基主要組分H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA選擇作用淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻目的要求掌握動物骨髓細胞染色體制備的基本過程及原理。掌握小鼠骨髓細胞染色體制備步驟及試劑的作用。觀察小鼠染色體的形態(tài)特征及數(shù)目實驗原理染色體只有在分裂期的細胞，特別是中期細胞中表現(xiàn)出典型形態(tài)便于觀察和計數(shù)。用秋水仙素處理骨髓細胞后，使分裂細胞阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)低滲處理、固定、滴片、染色等步驟，得到染色體標本。

最常用的是骨髓細胞、血淋巴細胞和組織培養(yǎng)的細胞。方法與步驟注射秋水仙素（Cochicine）

實驗前3～4小時，向腹腔內(nèi)注射秋水仙素。注射濃度隨動物種類不同而異。秋水仙素的主要作用是抑制紡錘體的形成，使有絲分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。

處死小鼠

：頸椎脫臼法1、剪取小鼠的后肢，注意不要將股骨兩端關(guān)節(jié)剪斷，否則容易造成骨髓細胞的流失。

2、將股骨上皮膚、肌肉用剪刀、紗布清除干凈，然后將股骨兩端的關(guān)節(jié)剪去，使股骨兩端相通。取股骨：用小針筒吸取

0.075mol/LKCl低滲液(5ml)，在培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗骨髓腔，使骨髓細胞全部洗脫出來。收集細胞：實驗步驟5ml反復(fù)沖洗加固定液5滴終止低滲前1～2min秋水仙素頸椎脫臼小白鼠處理實驗前3～4h處死、取股骨KCl低滲液收集骨髓細胞37℃靜置30min低滲混勻、預(yù)固定2000轉(zhuǎn)∕分5min離心、棄上清加固定液5ml、混勻10min固定2000轉(zhuǎn)∕分5min離心、棄上清8-10滴固定液細胞懸液吹打混勻預(yù)冷的玻片低滲：0.075mol/LKCl固定：甲醇:冰醋酸3:1

滴片：20-30cm的高度(預(yù)冷潔凈的載玻片)染色：Giemsa染液7min

鏡檢：“U”形染色體2n=40

結(jié)果觀察結(jié)果觀察結(jié)果觀察結(jié)果顯示小鼠染色體的特點：呈“U”型，全部為端著絲粒染色體；40條（19對常+1對性）小鼠染色體核型圖：注意事項：1.把握好秋水仙素的濃度和處理時間。2.控制好離心的速度。3.低滲處理是實驗成敗的關(guān)鍵，其目的是使細胞體積脹大，染色體松散。低滲處理時間過長，會造成細胞破裂，染色體丟失。低滲處理時間不足，細胞內(nèi)染色體易聚集在一起，觀察時無法準確分辨與計數(shù)。4.固定液要現(xiàn)用現(xiàn)配。5.用吸管吹散細胞時用力必須盡量輕柔。6.載玻片要潔凈、預(yù)凍；滴片要有一定高度。人染色體制備鏡下所見染色體非顯帶染色體G-帶染色體染色體G顯帶制作技術(shù)原理：G顯帶技術(shù)是指經(jīng)胰蛋白酶處理后用Giemsa染色的方法。也是目前最基本最常用的染色體分析技術(shù)，它不僅能對染色體數(shù)目，而且能對染色體結(jié)構(gòu)畸變進行分析。為什么經(jīng)胰蛋白酶處理后染色體上會出現(xiàn)深淺不同的帶紋呢？這與染色體的化學(xué)成份有關(guān)。染色體經(jīng)蛋白水解酶類物質(zhì)處理后，蛋白質(zhì)部份被水解，使DNA中堿基暴露。由于DNA中堿基組合的比例不同，對染料結(jié)合程度不同，形成深淺不同的帶紋。染色體核酸（DNA為主）蛋白質(zhì)組蛋白非組蛋白實驗操作1.將染色體標本放入60-70度烘箱中烤2-3小時，然后放入37度恒溫箱中備用。2.把配制成0.042%胰蛋白酶液置室溫預(yù)溫。3.取一張玻片浸入已預(yù)溫的胰酶溶液中，處理大約20-25秒左右。4.緩沖液沖洗。5.1:10Giemsa液染色8分。6.沖洗，晾干，鏡檢。

ISCN2005預(yù)習(xí)：實驗一醋酸纖維素薄膜電泳的原理？P55：1、2思考題3、簡述對本次實驗的各個操作及染色體觀察的體會？顯微鏡使用、細胞的基本形態(tài)與結(jié)構(gòu)《細胞培養(yǎng)技術(shù)》錄像動物染色體制備秋水仙素、低滲處理蟾蜍血細胞的體外融合原理、試劑、細胞融合的原理、細胞計數(shù)格子AKP的Km測定原理、試劑雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量葡萄糖的酶法測定原理、試劑酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）—雙抗體夾心法實驗原理醋纖薄膜電泳分離血清蛋白實驗原理對流免疫電泳鑒定免疫球蛋白實驗原理小鼠脾單個核細胞的分離實驗原理、離心后分層、細胞計數(shù)雙向聚酰胺薄膜層析分離DNS-氨基酸凝膠層析技術(shù)分離脲酶和胰島素原理、試劑鼠肝DNA的制備試劑作用PCR技術(shù)檢測β-actin基因?qū)嶒炘?、反?yīng)體系中各成分作用電泳鑒定三個分光光度法、兩次層析、三次電泳比較內(nèi)容總結(jié)動物染色體制備。——小鼠骨髓染色體。染色體只有在分裂期的細胞，特別是中期細胞中表現(xiàn)出典型形態(tài)便于觀察和計數(shù)。最常用的是骨髓細胞、血淋巴細胞和組織培養(yǎng)的細胞。秋水仙素的主要作用是抑制紡錘體的形成，使有絲分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。1、剪取小鼠的后肢，注意不要將股骨兩端關(guān)節(jié)剪斷，否則容易造成骨髓細胞的流失。2、將股骨上皮膚、肌肉用剪刀、紗布清除干凈，然后將股骨兩端的關(guān)節(jié)剪去，使股骨兩端相通。用小針筒吸取0.075mol/LKCl低滲液(5ml)，在培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗骨髓腔，使骨髓細胞全部洗脫出來。固定：甲醇:冰醋酸3:1

滴片：20-30cm的高度。小鼠