臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)2

臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第二周實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第一天：生物化學(xué)鑒定葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氫、Indol、枸椽酸鹽、雙糖鐵

第二天：生物化學(xué)鑒定苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、DNA酶、硝酸鹽還原、氧化發(fā)酵（O/F）

第三天：生物化學(xué)鑒定氧化酶、觸酶、DNA酶試驗(yàn)結(jié)果觀察目的要求1.掌握鑒別細(xì)菌常用生化反應(yīng)的原理、結(jié)果判定及接種方法。2.熟悉鑒別細(xì)菌常用的復(fù)合生化培養(yǎng)基(KIA)的原理、結(jié)果判定和應(yīng)用第一天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試劑（微量生化管）：葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氫、Indol、枸椽酸鹽、KIA

以上各種生化微量管2支/人菌種：大腸埃希菌、腸沙門菌、陰溝腸桿菌、福氏Ⅰa志賀菌等其他：砂輪、接種針、酒精燈常用指示劑變色范圍指示劑顏色改變感應(yīng)pH范圍酸→堿溴甲酚紫黃→紫5.2～6.8溴麝香草酚藍(lán)黃→藍(lán)6.0～7.6甲基紅紅→黃4.4～6.0中性紅紅→黃6.8～8.0酚紅黃紅6.8～8.4碳水化合物代謝試驗(yàn)1、糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)原理：細(xì)菌含發(fā)酵糖(苷、醇)類的酶不同，分解糖（苷、醇）能力不同，代謝產(chǎn)物不同，指示劑呈酸性或堿性反應(yīng)。

指示劑為溴甲酚紫

結(jié)果：

產(chǎn)酸：分解糖(苷醇)產(chǎn)酸，培養(yǎng)基變黃色＋產(chǎn)酸產(chǎn)氣：培養(yǎng)基變黃且出現(xiàn)氣泡＋無變化：－原理：某些細(xì)菌在代謝過程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)一步被分解為乳酸、乙酸、甲酸等，而使培養(yǎng)基的pH值下降至4.5以下，故加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色（陽性）。有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)如醇、酮、醛、氣體和水，則培養(yǎng)基的酸堿度仍在pH6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色（陰性）原理：細(xì)菌在葡萄糖代謝過程中生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步脫羧后可產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化為二乙酰（丁二酮），進(jìn)而與培養(yǎng)基內(nèi)的蛋白胨的精氨酸所含的胍基發(fā)生反應(yīng)，生成紅色化合物，即VP反應(yīng)陽性。

2、甲基紅試驗(yàn)（MR）及VP試驗(yàn)

葡萄糖

丙酮酸乙酰甲基甲醇混合酸(甲、乙、乳酸、琥珀酸)

KOH+空氣甲基紅指示劑丁二烯醇二乙酰PH<4.4紅色

α奈酚+肌酸(MR+)

紅色化合物

(VP+)

培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白胨水

VP試驗(yàn)

MR試驗(yàn)試劑：甲液：6%α-萘酚酒精溶液。乙液：40%KOH溶液、0.3%肌酐。結(jié)果判定：陽性:紅色

陰性:黃色/棕色

（再35℃0.5～1小時(shí)后觀察）甲基紅試劑：

結(jié)果判定：加入甲基紅試劑1滴,

陽性:紅色陰性:黃色-

+MR結(jié)果與VP結(jié)果相反3、硫化氫試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解含硫氨基酸(胱aa、半胱aa)生成H2S，遇醋酸鉛Pb或Fe2+形成黑色PbS或FeS沉淀培養(yǎng)基：硫化氫培養(yǎng)基結(jié)果判定：培養(yǎng)基變黑

+

-原理：細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可與試劑中的對二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色結(jié)果：反應(yīng)結(jié)束加試劑數(shù)滴，兩液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性

-

+4、吲哚試驗(yàn)原理：以枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸銨為唯一氮源，若細(xì)菌能利用這些鹽作為碳源和氮源而生長，則利用枸櫞酸鈉產(chǎn)生碳酸鹽，與利用銨鹽產(chǎn)生的NH3反應(yīng)，形成（NH4）2CO3，使培養(yǎng)基變堿，pH升高，指示劑溴麝香草酚藍(lán)由草綠色變?yōu)樯钏{(lán)色結(jié)果:

陽性:藍(lán)色;

陰性:綠色5、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

-

+培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基6.克氏雙糖鐵培養(yǎng)基(KliglerIronAgar,KIA)組成：無糖培養(yǎng)基+1份葡萄糖+10份乳糖+鐵鹽+酚紅

營養(yǎng)底物底物底物指示劑②分解葡萄糖+乳糖產(chǎn)酸(乳糖多，產(chǎn)酸多）上下層均變黃原理：①只分解葡萄糖產(chǎn)酸（葡萄糖少，產(chǎn)酸量少）上層酸氧化，紅色下層缺氧，不氧化，黃色③產(chǎn)生硫化氫+鐵鹽FeS黑色沉淀

應(yīng)用：檢測腸桿菌科細(xì)菌對乳糖、葡萄糖的分解和產(chǎn)H2S能力。未接種菌的KIA乳（－）葡（＋）H2S(-)乳（-）葡（+）H2S(+)乳（+）葡（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）H2S(-)克氏雙糖鐵試驗(yàn)結(jié)果示意圖各種生化培養(yǎng)基接種的細(xì)菌葡萄糖：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌乳糖：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌硫化氫：大腸埃希菌或志賀菌、沙門菌VP試驗(yàn)：大腸埃希菌、陰溝腸桿菌甲基紅MR試驗(yàn)：大腸埃希菌、陰溝腸桿菌吲哚試驗(yàn)：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌枸椽酸鹽：大腸埃希菌或志賀菌或沙門菌、陰溝腸桿菌KIA：大腸埃希菌、沙門菌或志賀菌每種生化試驗(yàn)每人均做！每個(gè)生化反應(yīng)微量管分別接種兩種不同的細(xì)菌！課后作業(yè)復(fù)習(xí)今天接種細(xì)菌的各種生化反應(yīng)原理與結(jié)果預(yù)習(xí)第二天的各種生化反應(yīng)原理及結(jié)果觀察第二天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試劑：苯丙、尿素、（賴氨酸、鳥氨酸、氨對）、DNA酶、硝還、O/F

以上各種生化微量管2支/人

O/F管4支/人菌種：大腸、變形、沙門、志賀、金葡、銅綠其他：砂輪、接種針、酒精燈觀察昨天的生化反應(yīng)結(jié)果并記錄-

+MR和VP加試劑后觀察+無色紅色VP試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)+-紫紅色橘黃色加試劑后觀察乳（+）葡（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）H2S(-)大腸埃希菌在KIA中結(jié)果乳（-）葡（+）H2S(+)傷寒沙門菌在KIA中結(jié)果乳（－）葡（＋）H2S(-)志賀菌在KIA中生長結(jié)果KA-+KA-+KA--AA+-原理：若細(xì)菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨變成苯丙酮酸，苯丙酮酸能使三氯化鐵指示劑變?yōu)榫G色加入苯丙氨酸脫氨酶試劑:10%FeCl3陽性:培養(yǎng)基與試劑接觸處出現(xiàn)綠色陰性:不變色培養(yǎng)基：苯丙氨酸培養(yǎng)基AB

+-1、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)

原理：細(xì)菌具有的尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨(氨在溶液中形成碳酸銨)，培養(yǎng)基pH↑

培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基

指示劑：酚紅

結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性指示劑顯紅色+－

＋

AB2、尿素酶試驗(yàn)原理：不同細(xì)菌對不同的糖分解能力及代謝產(chǎn)物不同，這種能力因是否有氧氣的存在而異，有氧條件下能分解稱為氧化型，無氧條件下能分解稱為發(fā)酵型,兩種情況下均不分解的為產(chǎn)堿型。結(jié)果判定:僅在沒有覆蓋石蠟油的一管分解糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者屬氧化型；兩管均分解糖產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣者為發(fā)酵型；兩管都不生長者為產(chǎn)堿型。指示劑：溴麝香草酚藍(lán)或溴甲酚紫培養(yǎng)基：Hugh-Leifson培養(yǎng)基3、氧化－發(fā)酵試驗(yàn)（OF）氧化－發(fā)酵試驗(yàn)（OF）發(fā)酵型ABC氧化型

產(chǎn)堿型4、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)脫羧酶分解氨基酸使脫羧生成胺、CO2，培養(yǎng)基變堿性。

-coo賴氨酸尸胺

-coo鳥氨酸腐胺培養(yǎng)基：賴、鳥氨基酸脫羧酶及氨基酸對照培養(yǎng)基結(jié)果：對照管黃色測定管紫色+

接種細(xì)菌后，在培養(yǎng)基中加入石蠟油！原理：細(xì)菌如果能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與試劑中的對氨基苯磺酸生成對偶氮苯磺酸，對偶氮苯磺酸再與試劑中的α-萘胺反應(yīng)，生成可見的紅色N-α-萘胺偶氮苯磺酸。硝酸鹽還原的過程可因細(xì)菌的不同而異，①有的細(xì)菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；②有的細(xì)菌使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽后，進(jìn)一步將亞硝酸鹽分解成為氮，此時(shí)加入硝酸鹽還原試劑不顯色，但可以在培養(yǎng)基的小倒管中出現(xiàn)氣泡，如假單胞菌等。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果被還原成氣體的終未產(chǎn)物如氮或氧化氮，就稱為脫硝化或脫氮化作用。

5、硝酸鹽還原試驗(yàn)甲液：甲基α-萘胺乙液：對氨基苯磺酸培養(yǎng)后加試劑：甲液、乙液各一滴陽性:紅色陰性:無色在無色的培養(yǎng)基中再加入鋅粉，判定結(jié)果硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)ABAB-/+

+加鋅粉+-加試劑后

DNA酶

原理：長鏈DNA寡核苷酸鏈

（可被酸沉淀）（可溶于酸）

方法：點(diǎn)種

-+6、DNA酶試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：各種培養(yǎng)基接種細(xì)菌苯丙：大腸埃希菌、變形桿菌尿素：大腸埃希菌、變形桿菌賴氨酸：傷寒沙門菌、奇異變形桿菌鳥氨酸：傷寒沙門菌、奇異變形桿菌對照管：分別接種傷寒沙門菌或奇異變形桿菌DNA酶：金葡菌、大腸埃希菌或銅綠假單胞菌硝還：大腸埃希菌或變形桿菌、銅綠假單胞菌O/F：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌每種生化反應(yīng)每個(gè)同學(xué)均做并分別接種兩種細(xì)菌?。〉谌鞂?shí)驗(yàn)內(nèi)容試劑：氧化酶、觸酶、1%鹽酸菌種：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌其他：砂輪、接種針、酒精燈觀察昨天的生化反應(yīng)結(jié)果OF試驗(yàn)發(fā)酵型氧化型＋－加入試劑后觀察苯丙氨酸脫胺酶試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)－＋硝酸鹽還原試驗(yàn)

－＋在無色的培養(yǎng)基中再加入鋅粉紅色（－）不產(chǎn)氮?dú)鉄o色（＋）產(chǎn)氮?dú)獍被崦擊让福伾c對照管一致的為陰性，顏色不同的則為陽性

－＋DNA酶試驗(yàn)結(jié)果加1%鹽酸1、氧化酶試驗(yàn)

原理：

鹽酸二甲基對苯二胺（無色）紫紅色的醌類化合物

OR

鹽酸四甲基對苯二胺（無色）藍(lán)色的醌類化合物

方法：直接法、間接法（濾紙法、試劑紙片法）

結(jié)果：在10秒內(nèi)呈紫紅色－－陽性

注意事項(xiàng)：不宜用生銹的接種針或接種環(huán)

不宜用熱的鑷子