雞蛋清溶菌酶的提取及電泳鑒定

雞蛋清溶菌酶的提取及電泳鑒定第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日實驗目的：1了解雞蛋清溶菌酶的性質、常用制備方法及原理2掌握鹽析法分離蛋白質原理及操作3掌握SDS鑒定蛋白純度的原理及操作第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日1溶菌酶的性質溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)由英國細菌學家弗萊明(Fleming)在1922年在人的眼淚、唾液中發(fā)現(xiàn)的。廣泛存在于鳥類和家禽的蛋清中，哺乳動物的淚液、唾液、血漿、尿、乳汁、其它體液中及白細胞和組織（如肝、腎）細胞內，而且部分植物、微生物中也含有此酶。人溶菌酶的活性是最高的，大約為雞蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最豐富，約為0.3%-0.4%左右，而且蛋清來源廣泛，因此多數(shù)商品溶菌酶是從蛋清中提取的。第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日雞蛋清溶菌酶是動植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。白色、無臭結晶粉末，味甜，易溶于水，遇堿易破壞，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129個氨基酸殘基排列構成的單一肽鏈，有四對二硫鍵，分子量為14300。堿性球蛋白，堿性氨基酸殘基及芳香族氨基酸如色氨酸殘基的比例很高。其等電點為pH10.7；其最適pH值為pH7左右，最適溫度為50℃。第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日不規(guī)則的橢圓體，比較容易結晶，結晶形狀隨結晶條件而異，有菱形八面體、正方形六面體及棒狀結晶等。用X射線衍射測得此酶的體積為45×30×30?。第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日性質非常穩(wěn)定：當pH值在1.2-11.3范圍內劇烈變化時，其結構幾乎不變。遇熱也很穩(wěn)定，pH值4-7、100℃處理1分鐘仍保持原酶活性；pH值5.5、50℃加熱4小時后，酶活不受影響。但是，在堿性條件下，溶菌酶的熱穩(wěn)定性較差，易變性。熱變性隨著有機溶劑的增加而直線下降。溶菌酶對變性劑相對不敏感。在6M鹽酸胍溶液中，酶完全變性，但在8M尿素中則不變性。吡啶、十二烷基磺酸鈉等對酶有抑制作用，氧化劑能使酶鈍化。第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日2溶菌酶的應用水解N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間β-1，4糖苷，破壞革蘭氏陽性細菌細胞壁而具有溶菌作用，是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，又稱細胞壁溶解酶（Muramidase）。醫(yī)療、食品防腐及生物工程中，特別是在食品防腐方面，以代替化學合成的食品防腐劑，具有較好應用價值。第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.1食品工業(yè)上的應用選擇性的分解微生物的細胞壁，而不能作用于其它物質，主要應用于海產品、水產品、乳制品和干酪的保鮮，低度酒、糕點及飲料的防腐，以及水產熟制品及肉類熟制品的防腐保鮮。加入到飲料中，如鈣奶、乳酸飲料中,也可起到防蛀牙、爽口的作用。為彌補奶粉的不足，可以向其中添加適量溶菌酶，制成母乳化奶粉，可以加強嬰幼兒的抗感染能力，可以促進嬰兒胃內乳酪蛋白形成細微凝乳，有利于嬰兒的消化吸收。特別對早產嬰兒，有防止體重減輕、預防消化器官疾病、增進體重等功效。第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.2酶工程上的應用近年來，溶菌酶已成為基因工程及細胞工程必不可少的工具酶，用以提取菌體內的活性物質如核酸、酶及活性多肽等。第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.3發(fā)酵工業(yè)上的應用溶菌酶制備酵母膏，則不僅可以提高浸膏量的收率，還可以大大縮短酵母膏的制備時間。溶菌酶還可用于菌體內含物質的提取。第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.4醫(yī)學上的應用溶菌酶制備的口腔藥片或漱口液治療副鼻竇炎、口腔潰瘍、扁平苔蘚和滲出性中耳炎等疾病。作口服劑可抑制流行性感冒和腺病毒的生長、抗感染及抗炎癥，還具有多種藥理作用。還具有一定的保健作用；有促進血液凝固和止血作用；有組織再生和瘢痕形成促進作用等。第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.5科學研究中的應用利用溶菌酶專一性地水解細胞壁的特點,了解微生物細胞壁的構造，分解細胞壁后制備原生質體，從而用于微生物育種以及微生物分類等學術研究的領域。第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日3溶菌酶的生產現(xiàn)狀及前景上世紀50年代，國外開始了溶菌酶的工業(yè)化生產。采用從雞蛋清中直接結晶得溶菌酶，產品用來制作口服藥劑。上世紀60年代，又開發(fā)了離子交換法，進一步降低了生產成本，提高了產品質量，達到了注射級藥品質量要求。上世紀70年代，開發(fā)了親和色譜技術，主要用于高純度生化試劑的生產。近來超濾法與其它方法相結合，進一步提高了溶菌酶的生產工藝水平。第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日目前美國、加拿大、荷蘭、法國、德國、丹麥、意大利、日本等國家均生產溶菌酶，其產量與日俱增。近年來，溶菌酶被用作天然防腐劑，極大的促進了其市場需求，每年以10%的速率增長，現(xiàn)在市場規(guī)模約為700噸。第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日我國的食品工業(yè)、精細化工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)對溶菌酶具有較大的需求。我國于上世紀70年代采用離子交換法生產溶菌酶。目前國內有大連生化、天津東原、煙臺金梓等廠家生產，初步滿足了國內科研及醫(yī)藥工業(yè)的需求。進口溶菌酶，存在著價格較高，進口環(huán)節(jié)復雜等諸多方面的限制。國產溶菌酶工業(yè)剛剛起步，生產規(guī)模小，工業(yè)水平落后，產品的質量與國際標準差距較大。存在提取率低，處理量小和產品比活低等缺點。第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日我國是世界上最大的產蛋國家，原料來源豐富，目前鮮蛋基本作為初級食品食用，深加工不足。而發(fā)達國家的鮮蛋加工業(yè)可以加工鮮蛋總產量的40%。1kg雞蛋大約8元，提取出溶菌酶，可以得到3.5g，溶菌酶純品售價60元/1g左右。因此，進行溶菌酶的提取工藝研究，有著重大的科學意義和現(xiàn)實意義。第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日4溶菌酶的提取工藝蛋清的組成成分蛋清又稱蛋白，是一種膠體物質，約占蛋重的45%～60%，顏色為微黃色。雞蛋清實際分為四層，由外向內的結構是：第一層為外稀薄層，貼附在蛋清膜上，占整個蛋清的23.3%；第二層為外濃厚層（亦稱中層濃厚蛋白層），約57.2%；第三層為內稀薄層，約占16.8%；第四層為系帶膜狀層（亦稱內濃厚層），為一薄層，加上與之連為一體的兩端系帶，約占2.7%。第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日水分蛋白質碳水化合物維生素和色素灰分脂質酶第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.1直接結晶法優(yōu)點：操作簡單，原料便宜，設備投資小。最早應用于蛋清溶菌酶的工業(yè)生產，使產品的成本大大降低，為其醫(yī)藥應用作出了貢獻。缺點：（1）生產周期長。（2）由于蛋白質在其等電點不穩(wěn)定，因此生產過程中溶菌酶易失活。（3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶殘留于母液。因此不能用以分離微量的溶菌酶。（4）收率低，活性低。（5）處理后的蛋清難以再利用。此點導致溶菌酶成本大幅上升。第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.2親和色譜法優(yōu)點：分離提純的倍數(shù)較高，得到的溶菌酶純度高，還能分離純化經(jīng)化學修飾而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于檢測酶與底物相結合的氨基酸殘基。對于濃縮與精制微量的溶菌酶，區(qū)分天然溶菌酶和修飾酶，或探索與底物結合的酶分子氨基酸殘基狀況等問題，這是很有效的方法。缺點：由于親和吸附劑的制作較為復雜，成本高，而且操作難度大，限制了它在工業(yè)上的大規(guī)模利用。第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.3離子交換法離子交換法具有簡便、高效、成本低且可自動化連續(xù)操作的優(yōu)點，目前大部分溶菌酶生產廠家都采用離子交換法。這種方法在實際應用中收率較高，降低了生產成本。要注意選擇合適的離子交換介質。早期有AmberliteIRC-50樹脂，724樹脂。目前采用DouliteC-464、磷酸纖維素（PC）、羧甲基纖維素（CMC）和羧甲基瓊脂糖（CMS）等離子交換劑，對溶菌酶都有較強的吸附能力。第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.4超濾法超濾法的早期應用主要是對溶菌酶的濃縮精制。它利用膜兩側的壓力差，使水分、鹽類及糖類等小分子透過膜，而溶菌酶等蛋白質大分子物質留在膜內不能透過，從而達到濃縮效果。它的優(yōu)點是無相變、操作簡單、操作費用低、產品不易失活。溶菌酶的分子量僅14300，而蛋清中其它蛋白質的分子量則在30000以上，因此可選擇適當?shù)姆蛛x膜，以超濾法濾出溶菌酶。而殘留的大量蛋清則可直接應用于食品加工。第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.5反膠團萃取法反膠團的主要應用是萃取蛋白質。目前研究使用最多的是陰離子表面活性劑AerosolOT(丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉，簡稱AOT)。該表面活性劑價廉易得，分子極性頭小，有雙鏈，形成反膠團時不必加入助表面活性劑，形成的反膠團極性核大，有利于蛋白質分子的進入。AOT/異辛烷/水體系是最常用的反膠團萃取體系，對于分離溶菌酶這類相對較小的分子來說，具有較好的分離效果。但是對于分子量大于30000的蛋白質則不易分離。1998年，反膠團萃取法從蛋清中直接分離溶菌酶。在離心管中將蛋清稀釋液與等體積的有機相（AOT/異辛烷）混合，恒溫水浴，高速搖動，混合50分鐘后，在3000rpm下離心5分鐘。分離得上層即反膠團萃取液，加入等體積的pH11.8磷酸鹽緩沖液，震蕩45分鐘，進行反萃取。離心后，收集下層水溶液，分析溶菌酶濃度，測定溶菌酶的酶活力。此法的溶菌酶回收率達90%，活性達73000u/mg，比大多數(shù)商業(yè)產品活性高。第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日5溶菌酶活力的測定方法典型作用底物是細胞壁粘多糖、甲殼素及糖苷。第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日溶菌酶的測定方法有兩大類：（1）利用酶反應測定酶活性：用對溶菌酶敏感的革蘭氏陰性菌（主要是溶壁微球菌）、甲殼素及其衍生物、人工合成的寡聚糖作為底物。本類方法簡便、靈敏，但影響溶菌酶活性的因素很多，穩(wěn)定性差。比濁法瓊脂平板法比色法熒光強度及熒光偏振法第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日（2）非酶學測定法：電泳法使用歷史較長，測定的溶菌酶含量包括有活性及失去活性的溶菌酶總量。免疫法技術的發(fā)展而產生的。此類方法靈敏度高，為定性也較好。但是這類方法需要制備抗體，實驗條件較酶學法復雜，因此大大限制了該類方法的應用。第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日鹽析法1878年Hammarster首次使用，是粗分離蛋白質的重要方法之一。許多蛋白質在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”（Saltingin）。而當鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時，蛋白質又變得不深而自動析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析“（Saltingout）。

第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日Hammarster用硫酸鎂成功地將血清蛋白分成為清蛋白、球蛋白兩部分。硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等鹽析蛋白質，其中運用最廣的是硫酸銨。

第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日硫酸銨優(yōu)點:化學性質穩(wěn)定；溶解度大，25℃時能達到4.1mol/L的濃度；溶解度的溫度系數(shù)變化較小，在0~30℃范圍內溶解度變化不大，如25℃時飽和溶解度為4.12mol/L，即767g/L，0℃時飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L;價廉易得，分段效果比其他鹽好，性質溫和，即使?jié)舛群芨邥r也不會影響蛋白質的生物學活性。

第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日實際工作中將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1。鹽析某種蛋白質成分所需的硫酸銨數(shù)量折算成100%或1飽和度的百分之幾，即稱為為該蛋白鹽析的飽和度。

第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日飽和硫酸銨溶液法在蛋白質溶液的總體不大，要求達到飽和度在50%以下時，可選用此方法。在已知鹽析出某各蛋白質成分所要過到飽和度時，可按下列公式計算出應加入飽和硫酸銨溶液的數(shù)量：V0——蛋白質溶液的原始體積；C2——所要達到硫酸銨飽和度；

C1——原來溶液的硫酸銨飽和度；

V——應加入飽和硫酸銨溶液的體積。

第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日固體硫酸銨法所需達到的飽和度較高，而蛋白質溶液的體積又不能再過分增大時，采用直接加入固體硫酸銨的方法。欲達到某到飽和度可按下列公式計算出應加入固體硫酸銨的數(shù)量：

X是將1L飽和度為C1溶液提高到飽和度為C2時，需要加入固體硫酸銨的重量（g）。G和A為常數(shù)，數(shù)值與溫度有關?，F(xiàn)在已將達到各種飽和度所需固體硫酸銨的數(shù)量列成表，使用時不需計算可直接從表中查出。第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法:常用蛋白質純度分析及分子量測定技術。SDS:十二烷基硫酸鈉（SodiumdeclecylSulfate）破壞蛋白質分子之間以及與其他物質分子之間的共價鍵，使蛋白質變性而改變原來的空間構象，特別是在強還原劑如巰基乙醇存在的條件下，由于蛋白質分子內的二硫鍵被還原劑打開并不易再氧化，這就保證了蛋白質分子與SDS結合從而形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物。

第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣（約為18?，即1.8nm），而長軸則隨蛋白質分子量成正比地變化。這樣的SDS-蛋白質復合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度也就是蛋白質分子量的函數(shù)。使蛋白質的電泳遷移率僅僅取決于分子大小這一因素。第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日當?shù)鞍踪|的分子量在11，700~165，000之間時，電泳遷移率與分子量對數(shù)呈直線關系，符合直線方程式：LgMw=—bx+k式中：Mw為蛋白質分子量，X為電泳遷移率，k和b均為常數(shù)。利用這一關系將已知分子量的標準蛋白質電泳遷移率與分子量的對數(shù)作圖即可得到一條標準曲線。只要測得未知分子量的蛋白質在相同條件下電泳遷移率，就能根據(jù)標準曲線求得其分子量。第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠作為支持電泳介質。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。在聚合前可調節(jié)單體的濃度比，形成不同程度交鏈結構，其孔隙度可在一個較廣的范圍內變化，可以根據(jù)要分離物質分子的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的孔隙度，又有比較好的機械性質。一

般說來，含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，機械性能適用于分離分子量范圍1萬至100萬物質，1萬以下的蛋白質則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠，而分子量特別大的可采用含丙烯酰胺4%的凝膠。

第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日連續(xù)體系；不連續(xù)體系前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornstein(1964)和Davis(1964)設計的,樣品和濃縮膠中含

Tris-HCl(pH6.8),上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分離膠中含Tris-HCl(pH8.8)。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的

SDS(Laemmli,1970)。

第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。

5～15%SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍

*丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）

1512～431016～687.536～945.057～212第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日實驗步驟1.蛋清準備取1枚鮮雞蛋，洗凈擦干，在小頭用鑷子輕輕搗一直徑為4mm的小孔，下用燒杯或量筒接好，再在大頭打一細小針孔進氣，此時蛋清緩緩自動流出。取蛋清的操作應很細致，避免蛋黃破裂混入蛋清而影響實驗結果。將所得雞蛋清充分打勻（約15分鐘）。打時力戒過猛以防止產生泡沫變性作用。然后用4層紗布濾去雜質，測量體積（或體重），記錄pH值。第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日2熱變性取稀鹽酸調節(jié)雞蛋清pH值5.5左右（4-7）、70℃處理15分鐘。離心，去沉淀，保留上清。3分步鹽析取適量上清，先用1N的氫氧化鈉后用0.1NNaOH溶液調至pH8.0~8.5，加適量飽和硫酸銨溶液（pH8.0）至飽和度為10%。冰浴放置30min。離心，棄上清。（比例：800ul到eppendorf管中，加入88.9ul飽和硫酸銨）。第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日4樣品處理取適量沉淀到干凈的eppendorf管內，加200ulddH2O溶解沉淀。加入20ulTCA，顛倒三次，13000rpm離心10min。棄上清。Eppendorf管中加入200ul丙酮，顛倒三次，13000rpm離心10min。棄上清。待管內殘留丙酮揮發(fā)干凈，加入適量loadingbuffer及ddH2O，沸水浴處理15min，待電泳鑒定。第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日5電泳鑒定上述樣品用濃度12%的SDS分析。注意加入標準對照。6結果觀察染色，脫色，觀察實驗結果。第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作：1．

實驗材料和試劑（1）丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺。以溫熱（利于溶解雙丙烯酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N,N’-亞甲雙丙烯酰胺的貯存液，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中緩慢轉變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一脫氨基反應是光催化或堿催化的，故應核實溶液的pH值不超過7.0。這一溶液置棕色瓶中貯存于室溫，每隔幾個月須重新配制。（2）十二烷基硫酸鈉（SDS）。SDS可用去離子水配成10%（w/v）貯存液保存于室溫。（3）用于制備分離膠和積層膠的Tris緩沖液。第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日（4）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。（5）過硫酸銨。過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。須新鮮配制。（6）1.5MTris，pH8.8（分離膠緩沖液）（7）1MTris，pH6.8（濃縮膠緩沖液）（8）Tris-甘氨酸電泳緩沖液。25mMTris，250mM甘氨酸(pH8.3)，0.1%SDS，（9）樣品處理液，50mMTris-HCl(pH6.8)，100mMDTT(or5%巰基乙醇)，2%SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油（10）染色液：0.1%考馬斯亮藍R250，40%甲醇，10%冰醋酸（11）脫色液：10%甲醇，10%冰醋酸第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日實驗步驟1.配制SDS聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑2．SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制⑴根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板。⑵確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下步操作。第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日⑶迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加0.5cm)。再在膠液面上小心注入一層水（約2~3mm高），以阻止氧氣進入凝膠溶液。⑷分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。⑸制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)