第八章真核基因表達(dá)調(diào)控1

●基本概念●真核基因表達(dá)調(diào)控一般規(guī)律●真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控●真核生物DNA水平的基因表達(dá)調(diào)控●真核基因其他水平的表達(dá)調(diào)控Contents當(dāng)前1頁，總共92頁。斷裂基因：在一個結(jié)構(gòu)基因中，編碼某一蛋白質(zhì)不同區(qū)域的各個外顯子并不連續(xù)排列在一起，常常被長度不等的內(nèi)含子所隔離，形成鑲嵌排列的斷裂方式。具有這種結(jié)構(gòu)特征的基因被稱為斷裂基因。真核生物基因為斷裂基因。外顯子：真核基因中的編碼序列，稱為外顯子。內(nèi)含子：真核基因中的非編碼序列，稱為內(nèi)含子。當(dāng)前2頁，總共92頁。當(dāng)前3頁，總共92頁。外顯子與內(nèi)含子鏈接區(qū)結(jié)構(gòu)特征當(dāng)前4頁，總共92頁。當(dāng)前5頁，總共92頁。Ⅰ類內(nèi)含子的自我剪接當(dāng)前6頁，總共92頁。Ⅱ類內(nèi)含子的自我剪接當(dāng)前7頁，總共92頁。基因家族：真核細(xì)胞中許多相關(guān)的基因常按功能成套組合，被稱為基因家族。簡單多基因家族：功能相關(guān)的基因以串聯(lián)方式前后相連。如真核生物5.8S，18S,28SrRNA的結(jié)構(gòu)基因組成簡單多基因家族。復(fù)雜多基因家族：一般由幾個相關(guān)基因家族構(gòu)成。如組蛋白基因家族。發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜多基因家族：如血紅蛋白基因家族當(dāng)前8頁，總共92頁。●基本概念●真核基因表達(dá)調(diào)控一般規(guī)律●真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控●真核生物DNA水平的基因表達(dá)調(diào)控●真核基因其他水平的表達(dá)調(diào)控Contents當(dāng)前9頁，總共92頁。真核生物基因調(diào)控分類：瞬時調(diào)控：或稱可逆調(diào)控，真核細(xì)胞對環(huán)境條件變化做出的反應(yīng)。發(fā)育調(diào)控：或稱不可逆調(diào)控，是真核細(xì)胞在生長、分化，發(fā)育過程中基因受到的調(diào)節(jié)。當(dāng)前10頁，總共92頁?！窕靖拍睢裾婧嘶虮磉_(dá)調(diào)控一般規(guī)律●真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控●真核生物DNA水平的基因表達(dá)調(diào)控●真核基因其他水平的表達(dá)調(diào)控Contents當(dāng)前11頁，總共92頁。1真核細(xì)胞的基因與原核細(xì)胞基因表達(dá)差異真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及DNA的空間結(jié)構(gòu)方面存在很大的差異，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：

(1)在真核細(xì)胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見的多基因操縱子形式；

(2)真核細(xì)胞DNA與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部DNA是裸露的；

(3)真核細(xì)胞中存在著一部分由幾個或幾十個堿基組成的DNA序列.它們在整個基因組中重復(fù)幾百次甚至上百萬次.高等真核細(xì)胞DNA中很大一部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細(xì)胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子；當(dāng)前12頁，總共92頁。

（4）真核生物能夠根據(jù)生長發(fā)育階段的需要進(jìn)行DNA片段的有序重排，還能在需要時增加細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)，這種能力在原核生物中是極為鮮見的；（5）原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動子上游不遠(yuǎn)處。調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點上后可直接促進(jìn)或抑制RNA聚合酶對它的結(jié)合。而在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)則大得多，它們可能遠(yuǎn)離啟動子達(dá)幾百個甚至上千個堿基。雖然這些調(diào)節(jié)區(qū)也能與蛋白質(zhì)結(jié)合，但是并不直接影響啟動子區(qū)對于RNA聚合酶的接受度，而是通過改變整個所控制基因5’上游區(qū)DNA的構(gòu)型來影響它與RNA聚合酶的結(jié)合能力；當(dāng)前13頁，總共92頁。

（6）真核生物的RNA在細(xì)胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運穿過核膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴(yán)格的空間間隔；（7）許多真核生物的基因只有經(jīng)過復(fù)雜的成熟（maturation）和剪接（splicing）過程才能順利翻譯成蛋白質(zhì)。當(dāng)前14頁，總共92頁。

2、真核基因的一般結(jié)構(gòu)特征當(dāng)前15頁，總共92頁。

真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能轉(zhuǎn)錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。順式作用元件(cis-actingelements)

真核基因的順式調(diào)控元件是基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響轉(zhuǎn)錄的DNA序列。其中主要是起正性調(diào)控作用的順式作用元件，包括啟動子(promoter)、增強子(enhancer)。近年又發(fā)現(xiàn)起負(fù)性調(diào)控作用的元件沉寂子(silencer)。當(dāng)前16頁，總共92頁。1、啟動子(1)真核啟動子序列比原核啟動子復(fù)雜的原因：

a.真核啟動子不像原核那樣有明顯共同一致的序列，且單靠RNA聚合酶難以結(jié)合DNA而起動轉(zhuǎn)錄，而是需要多種蛋質(zhì)因子的相互協(xié)調(diào)作用;b.不同蛋白質(zhì)因子又能與不同DNA序列相互作用，不同基因轉(zhuǎn)錄起始及其調(diào)控所需的蛋白因子也不完全相同。（2）真核啟動子中的元件真核啟動子一般包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游約100－200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長7－30bp。當(dāng)前17頁，總共92頁。a.核心啟動子元件(corepromoterelement)

指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游－25/－30bp處的TATA盒。核心元件單獨起作用時只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。b.上游啟動子元件(upstreampromoterelement)

包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點更遠(yuǎn)的上游元件。這些元件與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合能提高或改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達(dá)分別有不同的調(diào)控。當(dāng)前18頁，總共92頁。2、增強子是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強子。增強子通常占100－200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強子的作用有以下特點：⑴增強子提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離作用，通?？删嚯x1－4kb、個別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。⑵增強子作用與其序列的正反方向無關(guān)。當(dāng)前19頁，總共92頁。

⑶增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現(xiàn)活性。但增強子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。例如：a.當(dāng)含有增強子的病毒基因組整合入宿主細(xì)胞基因組時，能夠增強整合區(qū)附近宿主某些基因的轉(zhuǎn)錄；b.當(dāng)增強子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉(zhuǎn)錄。c.使某些癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。⑷增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強轉(zhuǎn)錄的作用。增強子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有的特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。當(dāng)前20頁，總共92頁。6.3.3基因調(diào)控的反式作用因子

1、反式作用因子是與順式元件相互作用的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。目前已發(fā)現(xiàn)了許多反式作用因子，其中主要是蛋白質(zhì)，例如：（1）識別GGGCGG的轉(zhuǎn)錄因子SPl；（2）識別CCAAT框的CTF；（3）熱震驚基因的轉(zhuǎn)錄因子HSTF；（4）固醇類激素受體；（5）cAMP的受體CAP等。有些轉(zhuǎn)錄因子如Apl是由原癌基因jun所編碼的，這引起了人們極大的興趣，它向人們提供了胚胎分化和癌癥發(fā)生的新線索。下面僅以SP1為例來了解轉(zhuǎn)錄因子的一般情況：當(dāng)前21頁，總共92頁。

例：SPl是從人類細(xì)胞中分離到的一種轉(zhuǎn)錄因子，是SV40轉(zhuǎn)錄所必需的：（1）它所識別的序列GGGCGG是非對稱的，而且其作用是雙方向的；（2）在SV40的啟動子中有六個這樣的GC框，SPl與其中的三個結(jié)合較強，與兩個結(jié)合較弱，還有一個不結(jié)合；（3）每個SPl可以保持大約20bp的DNA；（4）SV40啟動子中的GC框可促進(jìn)早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多真核基因的啟動子都含有GC框，艾滋病毒基因啟動子中也含有GC框。不同的啟動子中GC框具有不同的排列方式。當(dāng)前22頁，總共92頁。2、反式作用因子(transactingfactors)：以反式作用影響轉(zhuǎn)錄的因子可統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactors,TF)。與RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子分別稱為TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ，對TFⅡ研究最多。真核基因轉(zhuǎn)錄需要基本的TFⅡ。

RNA聚合酶Ⅱ的基本轉(zhuǎn)錄因子(見下表）：當(dāng)前23頁，總共92頁。

不同基因由不同的上游啟動子元件組成，能與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，這些轉(zhuǎn)錄因子通過與基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體作用而影響轉(zhuǎn)錄的效率。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有許多不同的轉(zhuǎn)錄因子，看到的現(xiàn)象是：

(1)同一DNA序列可被不同的蛋白因子所識別；

(2)能直接結(jié)合DNA序列的蛋白因子是少數(shù)，但不同的蛋白因子間可以相互作用，因而多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子是通過蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間作用與DNA序列聯(lián)系并影響轉(zhuǎn)錄效率的(見圖4)。轉(zhuǎn)錄因子之間或轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合都會引起構(gòu)象的變化，從而影響轉(zhuǎn)錄的效率。當(dāng)前24頁，總共92頁。3、轉(zhuǎn)錄因子從功能上分析其結(jié)構(gòu)可包含有不同區(qū)域：⑴DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain)，多由60－100個氨基酸殘基組織的幾個亞區(qū)組成；⑵轉(zhuǎn)錄激活域(activatingdomain)，常由30－100個殘基組成，富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸等不同種類，以酸性結(jié)構(gòu)域最多見；⑶連接區(qū)，即連接上兩個結(jié)構(gòu)域的部分。不與DNA直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子沒有DNA結(jié)合域，但能通過轉(zhuǎn)錄激活域直接或間接作用于轉(zhuǎn)錄復(fù)合體而影響轉(zhuǎn)錄效率。當(dāng)前25頁，總共92頁。4、與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子大多以二聚體形式起作用，與DNA結(jié)合的功能域常見有以下幾種：⑴螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋(helixturnhelix,HTH)及螺旋-環(huán)-螺旋(helixloophelix,HLH)：這類結(jié)構(gòu)至少有兩個α螺旋，其間由短肽段形成的轉(zhuǎn)角或環(huán)連接，兩個這樣的motif結(jié)構(gòu)以二聚體形式相連，距離正好相當(dāng)于DNA的一個螺距(3.4nm)，兩個α螺旋剛好分別嵌入DNA的深溝。當(dāng)前26頁，總共92頁。⑵鋅指(zincfinger)：其結(jié)構(gòu)如圖所示，每個重復(fù)的“指”狀結(jié)構(gòu)約含23個氨基酸殘基，鋅以4個配價鍵與4個半胱氨酸、或2個半胱氨酸和2個組氨酸相結(jié)合。整個蛋白質(zhì)分子可有2?個這樣的鋅指重復(fù)單位。每一個單位可以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。例如與GC盒結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子SP1中就有連續(xù)的3個鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu)。當(dāng)前27頁，總共92頁。⑶堿性－亮氨酸拉鏈(basicleucinezipper,bZIP)：該結(jié)構(gòu)的特點：蛋白質(zhì)分子的肽鏈上每隔6個氨基酸就有一個亮氨酸殘基，結(jié)果就導(dǎo)致這些亮氨酸殘基都在α螺旋的同一個方向出現(xiàn)。兩個相同結(jié)構(gòu)的兩排亮氨酸殘基就能以疏水鍵結(jié)合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合。若不形成二聚體則對DNA的親和結(jié)合力明顯降低。例如：在肝臟、小腸上皮、脂肪細(xì)胞和某些腦細(xì)胞中有稱為C/EBP家族的一大類蛋白質(zhì)能夠與CAAT盒和病毒增強子結(jié)合，其特征就是能形成bZIP二聚體結(jié)構(gòu)。

當(dāng)前28頁，總共92頁。當(dāng)前29頁，總共92頁。5、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域⑴酸性結(jié)構(gòu)域最初從酵母調(diào)節(jié)蛋白GAL4和GCN4轉(zhuǎn)錄因子中分析鑒定，在他們的表面含有一束帶負(fù)電荷的酸性氨基酸，能形成螺旋結(jié)構(gòu)，它是通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子在啟動子上的裝配而實現(xiàn)酸性激活的。例如：GAL4調(diào)節(jié)蛋白借助這種酸性負(fù)電荷表面結(jié)合于自身的DNA結(jié)合位點后，幫助TFIIB克服裝配上的阻塞，從而成千倍增加轉(zhuǎn)錄。⑵富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)已經(jīng)測的Sp1調(diào)節(jié)蛋白中有4個被分開的激活結(jié)構(gòu)域，其中兩個激活最強的結(jié)構(gòu)域含谷氨酰胺約為25%，在Oct-1,Oct-2,Ap-2和血清應(yīng)答因子（SRF）等轉(zhuǎn)錄因子也都有此特點。當(dāng)前30頁，總共92頁。（3）富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域在CTF－NF1轉(zhuǎn)錄因子羧基端含有（脯氨酸）Pro高達(dá)20%-30%，如果將此區(qū)域與各種DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連便可激活轉(zhuǎn)錄過程，其他哺乳類動物的轉(zhuǎn)錄因子如Ap-2、Jun、Oct-2、SRF中也有此類激活結(jié)構(gòu)。激活結(jié)構(gòu)域可能是轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白質(zhì)相接觸的區(qū)域。

聚合酶II在轉(zhuǎn)錄起始時至少需要5—6種轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用如何，目前還不太清楚.。當(dāng)前31頁，總共92頁。4、RNA的編輯編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象。當(dāng)前32頁，總共92頁。C變?yōu)閁堿基的突變當(dāng)前33頁，總共92頁。尿苷酸的缺失和添加在研究錐蟲線粒體mRNA轉(zhuǎn)錄加工時發(fā)現(xiàn)mRNA的多個編碼位置上加入或丟失尿苷酸，1990年在高等動物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了編輯現(xiàn)象。當(dāng)前34頁，總共92頁。錐蟲coxII基因的編輯當(dāng)前35頁，總共92頁。當(dāng)前36頁，總共92頁。核酶核酶（ribozyme）是指一類具有催化功能的RNA分子通過催化靶點RNA鏈中的磷酸二酯鍵的斷裂，特異性地剪切底物RNA分子，從而阻斷基因表達(dá)。核酶的幾種特殊結(jié)構(gòu)：錘頭狀結(jié)構(gòu)、I類內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、二類內(nèi)含子結(jié)構(gòu)等當(dāng)前37頁，總共92頁。Hammer–headStructure1.錘頭結(jié)構(gòu)核酶及作用機制錘頭結(jié)構(gòu)核酶結(jié)構(gòu)特點：1）由11-13個保守核苷酸組成催化中心。2）H為切割位點（H為除G外任意核苷酸）。切割部位遵循NUH原則。3）頸環(huán)III可以不是環(huán)狀結(jié)構(gòu)當(dāng)前38頁，總共92頁。錘頭結(jié)構(gòu)的五種類型R表示酶；S表示底物；箭頭表示剪切位點當(dāng)前39頁，總共92頁。紡錘頭結(jié)構(gòu)作用機制核酶和含有剪切位點的底物共同組成錘頭結(jié)構(gòu)，底物部分是切割部位兩端的核苷酸，與核酸酶莖I和莖III結(jié)合。切割后，該底物被釋放。一個新的沒有被切割的底物繼續(xù)結(jié)合上去，使切割反應(yīng)不斷重復(fù)進(jìn)行。當(dāng)前40頁，總共92頁?！馬NA的種類與功能●基本概念●原核生物的轉(zhuǎn)錄●真核生物的轉(zhuǎn)錄●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●RNA合成與DNA合成異同點Contents當(dāng)前41頁，總共92頁。6.1.2真核基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)當(dāng)前42頁，總共92頁。6.2真核生物的DNA水平調(diào)控

6.2.1基因丟失在原生動物、昆蟲等生物的細(xì)胞分化過程中有染色體丟失的現(xiàn)象，馬蛔蟲受精卵有2條染色體，當(dāng)個體發(fā)育到一定階段，分化為體細(xì)胞的那些細(xì)胞中的染色體斷裂為小的片段，有著絲點的小片段保留下來，其他的不能分配到下一代而失去，基因的丟失決定了細(xì)胞的壽命。但在高等生物的細(xì)胞分化中沒有此現(xiàn)象。當(dāng)前43頁，總共92頁。6.2.2基因擴(kuò)增即基因組中的特定段落在某些情況下會復(fù)制產(chǎn)生許多拷貝。最早發(fā)現(xiàn)的是蛙的成熟卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過程中其rRNA基因(可稱為rDNA)可擴(kuò)增2000倍，以后發(fā)現(xiàn)其他動物的卵細(xì)胞也有同樣的情況，這很顯然適合了受精后迅速發(fā)育分裂要合成大量蛋白質(zhì)，需要有大量核糖體。又如MTX(methotrexate)是葉酸的結(jié)構(gòu)類似物，一些哺乳類細(xì)胞會對含有利用葉酸所必需的二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因的DNA區(qū)段擴(kuò)增40?00倍，使DHFR的表達(dá)量顯著增加，從而提高對MTX的抗性?；虻臄U(kuò)增無疑能夠大幅度提高基因表達(dá)產(chǎn)物的量，但這種調(diào)控機理至今還不清楚。當(dāng)前44頁，總共92頁。6.2.3基因重排即胚原性基因組中某些基因會再組合變化形成第二級基因。例如編碼完整抗體蛋白的基因是在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育過程中，由原來分開的幾百個不同的可變區(qū)基因經(jīng)選擇、組合、變化，與恒定區(qū)基因一起構(gòu)成穩(wěn)定的、為特定的完整抗體蛋白編碼的可表達(dá)的基因。這種基因重排使細(xì)胞可能利用幾百個抗體基因的片段，組合變化而產(chǎn)生能編碼達(dá)108種不同抗體的基因，其中就有復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控機理。6.3真核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)

DNA絕大部分都在細(xì)胞核內(nèi)與組蛋白等結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響轉(zhuǎn)錄，至少有以下現(xiàn)象：當(dāng)前45頁，總共92頁。1、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄細(xì)胞分裂時染色體的大部分到間期時松開分散在核內(nèi)，稱為常染色質(zhì)(euchromatin)，松散的染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄。

染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)(heterochromatin)。（1）異染色質(zhì)中從未見有基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)；（2）原本在常染色質(zhì)中表達(dá)的基因如移到異染色質(zhì)內(nèi)也會停止表達(dá)；例：哺乳類雌體細(xì)胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質(zhì)者，這條X染色體上的基因就全部失活。

可見緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止基因表達(dá)。當(dāng)前46頁，總共92頁。2、組蛋白的作用早期體外實驗觀察到組蛋白與DNA結(jié)合阻止DNA上基因的轉(zhuǎn)錄，去除組蛋基因又能夠轉(zhuǎn)錄。（1）組蛋白是堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基相結(jié)合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉(zhuǎn)錄；（2）染色質(zhì)中的非組蛋白成分具有組織細(xì)胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉(zhuǎn)錄作用。

3、DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化天然雙鏈DNA的構(gòu)象大多是負(fù)性超螺旋。當(dāng)基因活躍轉(zhuǎn)錄時，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄方向前方DNA的構(gòu)象是正性超螺旋，其后面的DNA為負(fù)性超螺旋。（1）正性超螺旋會拆散核小體，有利于RNA聚合酶向前移動轉(zhuǎn)錄；（2）而負(fù)性超螺旋則有利于核小體的再形成。

當(dāng)前47頁，總共92頁。4、轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾?/p>

染色質(zhì)DNA受DNaseⅠ作用通常會被降解成400bp左右的片段，反映了完整的核小體規(guī)則的重復(fù)結(jié)構(gòu)。（1）但活躍進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)域受DNaseⅠ消化常出現(xiàn)100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結(jié)構(gòu)有變化，出現(xiàn)了對DNaseⅠ高敏感點(hypersensitivesite)。（2）這種高敏感點常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄基因的5′側(cè)區(qū)(5′flankingregion)、3′末端或在基因上，多在調(diào)控蛋白結(jié)合位點的附近。分析該區(qū)域核小體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能有利于調(diào)控蛋白結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前48頁，總共92頁。5、DNA堿基修飾變化真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活躍轉(zhuǎn)錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。

這種甲基化最常發(fā)生在某些基因5′側(cè)區(qū)的CpG序列中。

實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉(zhuǎn)錄，甲基化可能阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA特定部位的結(jié)合從而影響轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前49頁，總共92頁。6.4真核基因翻譯水平的調(diào)控本節(jié)重點——真核生物mRNA5’末端結(jié)構(gòu)對翻譯的影響。——真核生物mRNA3’末端結(jié)構(gòu)對翻譯的影響。

翻譯過程主要涉及到細(xì)胞的四種裝置：(1)核糖體，它是蛋白質(zhì)生物合成的場所；(2)mRNA，它是蛋白質(zhì)生物合成的模板;(3)tRNA，它是氨基酸的攜帶者；(4)可溶性蛋白因子，它是蛋白質(zhì)生物合成的起始物所必需的因子?？扇苄缘鞍滓蜃臃N類繁多，按功能可分為三類：一是起始因子，如eIF-2、eIF-2B，eIF-3，eIF-4A，eIF-4F，eIF-5等；二是延伸因子，如EFl，EF2等；三是終止因子，如RF等。當(dāng)前50頁，總共92頁。6.4.1可溶性蛋白因子的修飾與翻譯起始的調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，對許多可溶性蛋白因子的修飾也會影響翻譯起始。1、肽鏈起始因子eIF-2在激酶的作用下發(fā)生磷酸化，可以抑制蛋白質(zhì)的合成。例如：用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞粗抽提液研究蛋白質(zhì)的合成時發(fā)現(xiàn)，（1）如果不向這—體系中添加氯高鐵血紅素，幾分鐘之內(nèi)蛋白質(zhì)的合成活性將急劇下降，直到消失。即，當(dāng)沒有氯高鐵血紅素存在時，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞粗抽提液中的蛋白質(zhì)合成抑制劑HCl將被活化。（2）現(xiàn)已查明，該抑制劑是受氯高鐵血紅素調(diào)節(jié)的，它其實是eIF-2的激酶，可以使eIF-2的a亞基磷酸化，由活性型變成非活性型，而沒有生物學(xué)活性的HCl也可以通過自身的磷酸化變成活性型。當(dāng)前51頁，總共92頁。（3）氯高鐵血紅素能夠阻斷HCl的活化過程，但作用機制尚不清楚。（4）eIF-2發(fā)生磷酸化后不影響其與GTP及Met-tRNA形成中間復(fù)合物，同時也不阻礙40S和80S起始復(fù)合物的形成，但它主要抑制eIF-2B催化GDP/GTP的交換反應(yīng)，以致使eIF-2不能產(chǎn)生，由此，沒有eIF-2進(jìn)入中間復(fù)合物的再循環(huán)，導(dǎo)致翻譯的終止。2、酵母eIF-2磷酸化對GCN4mRNA翻譯起始有激活作用。（1）GCN4是一轉(zhuǎn)錄因子，特異性地結(jié)合在一些氨基酸合成酶基因啟動子的TGACTC上。（2）在5’端除了有起始密碼子外，在前端還有4個上游開放的閱讀框，每個都有起始密碼子，但GCN4是從第五個開始翻譯，上游的起始密碼子對下游的翻譯有抑制效應(yīng)。當(dāng)前52頁，總共92頁。（3）在非饑餓條件下，eIF-2處于正常水平，上游的閱讀框翻譯完成后，釋放的核糖體隨即向下游的閱讀框滑動，并啟動翻譯，而GCN4的翻譯被阻止。（4）在饑餓條件下，細(xì)胞處于應(yīng)急狀態(tài)，eIF-2磷酸化，活化型eIF-2的減少，翻譯起始復(fù)合物的再循環(huán)必然受到限制，因此上游的閱讀框（1號）翻譯后釋放的核糖體加速滑動，很快穿過其他的閱讀框，而結(jié)合于第五個起始密碼子處，開始翻譯。當(dāng)前53頁，總共92頁。6.4.2mRNA的“掃描模式”與蛋白質(zhì)合成的起始1、真核生物蛋白質(zhì)合成起始的“掃描模式”（Kozak）：在真核生物起始蛋白質(zhì)的合成時，40S核糖體亞基及有關(guān)的合成起始因子首先與mRNA模板靠近5’末端處結(jié)合，然后向3’方向滑行，發(fā)現(xiàn)AUG起始密碼子時再與60S大亞基結(jié)合，形成80S起始復(fù)合物。（1）40S起始復(fù)合物總是在碰到第一個AUG時就停下來，并在這里與60S亞基結(jié)合，形成第一個肽鍵。也就是說，只有最接近mRNA5’末端的讀碼框才能被翻譯。

注意：真核生物mRNA的這種特性與其說是由mRNA的結(jié)構(gòu)決定的，不如說是由真核生物核糖體的性質(zhì)所決定的。

當(dāng)前54頁，總共92頁。

實驗1：如果將大腸桿菌或小麥胚的核糖體與1噬茵體的多聚順反子（它具有類似于真核mRNA的5’帽子結(jié)構(gòu)）一起保溫，會發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌核糖體中，多聚順反子的第一個和第二個AUG都能順利起始蛋白質(zhì)的合成，而小麥胚核糖體只能以第一個AUG作為起始位點。實驗2：有人將大腸桿菌gal操縱子的多聚順反子（它也有5’帽子結(jié)構(gòu)）放入真核生物無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體中，發(fā)現(xiàn)它雖然也能被翻譯，但是只讀了5’末端的第一個讀碼框。從這些實驗可以看出，真核生物細(xì)胞的核糖體并不直接結(jié)合于mRNA內(nèi)部的起始密碼，所以在讀完第一個讀碼框之后并不能接下去讀第二個。當(dāng)前55頁，總共92頁。（2）為什么核糖體滑行到mRNA的第一個AUG，即在離5’末端最近的起始密碼子位點就停下來，并起始翻譯呢?

現(xiàn)在認(rèn)為，這是由AUG的前后序列所決定的。a.在調(diào)查了200多種真核生物mRNA5’末端第一個AUG的前后序列后發(fā)現(xiàn)，除有17個例外之外，其余都是A/GNNAUGG，說明這樣的序列對翻譯起始來說最為合適。b.如果從mRNA5’末端向3’端移動的40S起始復(fù)合物碰到了第一個AUG，而且這一AUG又處在最合適的前后序列中，核糖體小亞基就在這里與60S亞基會合，并開始合成蛋白質(zhì)。注意：mRNA的“掃描模式”相當(dāng)合理地說明了許多真核生物mRNA的單一順反子性質(zhì)。當(dāng)前56頁，總共92頁。6.4.3mRNA5’末端帽子結(jié)構(gòu)的識別與蛋白質(zhì)合成

當(dāng)前57頁，總共92頁。1、帽子的類型和功能（1）第一個甲基出現(xiàn)在所有的真核細(xì)胞mRNA中（單細(xì)胞真核mRNA主要是這種結(jié)構(gòu)），由鳥苷酸-7-甲基轉(zhuǎn)移酶催化，稱為O帽子（capO）。（2）帽子結(jié)構(gòu)的下一步是在第二個核苷酸（原mRNA的第一位）2’-OH位上加上另一個甲基，我們把有這兩個甲基的結(jié)構(gòu)稱為I類帽子（capl）。真核生物mRNA中以這類帽子為主。（3）在某些生物細(xì)胞內(nèi)，mRNA鏈上的第三個核苷酸的2’-OH位也可能被甲基化，因為這個反應(yīng)只以I類帽子為底物，所以被稱為Ⅱ類帽子（capⅡ），有這類帽子的mRNA只占有帽RNA總量的10~15％以下。當(dāng)前58頁，總共92頁。2、帽子結(jié)構(gòu)與mRNA的合成效率之間關(guān)系十分密切，下述證據(jù)可以說明這一點：(1)帽子結(jié)構(gòu)是前體mRNA在細(xì)胞核內(nèi)的穩(wěn)定因素，也是mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定因素，沒有帽子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將很快被核酸酶所降解；(2)帽子可以促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成起始復(fù)合物的生成，因而提高了翻譯強度；(3)沒有甲基化的帽子以及用化學(xué)或酶學(xué)方法脫去帽子的mRNA，其翻譯活性顯著下降；(4)帽子結(jié)構(gòu)的類似物，如m7GMP，m7GDG和m7G（5’）等都能強烈抑制有帽子mRNA的翻譯，但對沒有帽子mRNA的翻譯沒有影響。當(dāng)前59頁，總共92頁。

例如：大鼠有兩個等量表達(dá)的胰島素基因，可生產(chǎn)出等量的胰島素1和胰島素2。但在b腫瘤細(xì)胞中這一平衡被打破了，胰島素1的產(chǎn)量為胰島素2的10倍左右。研究表明，此時胰島素2的mRNA失去了5’帽子，因此抑制了它作為模板合成蛋白質(zhì)的過程。大鼠胰島素基因的表達(dá)調(diào)控，充分說明了帽子結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)合成的重要性。當(dāng)前60頁，總共92頁。6.4.4反義RNA對翻譯的調(diào)控作用前面我們已經(jīng)講了反義RNA對原核基因翻譯水平的調(diào)控。天然反義RNA首先在原核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，近年來，在真核生物中也發(fā)現(xiàn)了一些可能的天然反義RNA。例如禽類C-myc基因可反向不連續(xù)地轉(zhuǎn)錄出三個反義RNA，分別位于第一外顯子上游，第一內(nèi)含子、第二內(nèi)含子和第三外顯子之間，推測它可與mRNA互補，參與翻譯調(diào)控。

在蛋白質(zhì)的生物合成過程中，特別是在起始反應(yīng)中，mRNA的“可翻譯性”是起決定作用的，其5’末端的帽子結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)與rRNA的互補性，以及起始密碼附近的核苷酸序列都是蛋白質(zhì)生物合成的信號系統(tǒng)。蛋白質(zhì)生物合成的調(diào)控，就是通過mRNA本身所固有的這些信號與可溶性蛋白因子或者與核糖體之間的相互作用而實現(xiàn)的。當(dāng)前61頁，總共92頁。6.4.5mRNA3′---UTR(untranslatedregion)1、控制mRNA的降解在許多哺乳動物和酵母的mRNA的降解過程中，去除ploy(A)是首要的關(guān)鍵的一步，ploy(A)尾部的縮短率由位于編碼區(qū)內(nèi)的順式作用元件所調(diào)節(jié)，存在于許多高度不穩(wěn)定的哺乳動物的mRNA3′---UTR內(nèi)的AU富集元件就是一個常見的序列，它介導(dǎo)mRNA的降解，是決定mRNA穩(wěn)定性的重要因素。對mRNA3′---UTR的保守序列介導(dǎo)的mRNA的降解的機制目前所知較少，但有人提出AU富集元件介導(dǎo)的降解的一般模式可能有普遍意義。

AU富集元件結(jié)合蛋白及其輔助因子與靶序列結(jié)合，激活去ploy(A)，形成中間體，最終由核酸內(nèi)/外切酶降解，從而使mRNA得以更新。當(dāng)前62頁，總共92頁。2、介導(dǎo)翻譯調(diào)控（1）體內(nèi)蛙卵母細(xì)胞和體外網(wǎng)織紅細(xì)胞抽提物實驗表明帶有ploy(A)尾的mRNA的翻譯頻率明顯高于脫尾的mRNA，ploy(A)尾對翻譯的影響與其長度成正比關(guān)系，當(dāng)少于20個堿基時，mRNA的活性迅速降低。（2）ploy(A)促進(jìn)翻譯還必須有與其結(jié)合的蛋白(ploy(A)結(jié)合蛋白），ploy(A)與ploy(A)結(jié)合蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物對翻譯起始復(fù)合物的形成有重要的作用，但幾具體機制仍不明確。（3）此外，此尾部結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)，也與病毒的侵染有關(guān)。

當(dāng)前63頁，總共92頁。mRNA3′---UTR中的某些元件與蛋白因子相互作用而調(diào)控翻譯，果蠅的性狀決定基因mRNA的翻譯有賴于它們在胚胎細(xì)胞前后軸上的定位，此定位是由mRNA3′---UTR所決定；在小鼠精子的發(fā)生過程中，精蛋白mRNA由轉(zhuǎn)錄形成后，需在精原細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)儲藏3到7天才被翻譯，這是由精蛋白的mRNA3′---UTR所控制的；所有這些研究表明mRNA3′---UTR不僅調(diào)控翻譯產(chǎn)物，而且控制翻譯發(fā)生的時間、地點。

3、控制某些特殊遺傳密碼的辨認(rèn)在密碼子表中沒有密碼與硒代半胱氨酸對應(yīng)，在真核生物中，硒代半胱氨酸由位于mRNA編碼框內(nèi)的UGA密碼子所編碼，而它在一般情況下是終止密碼子，此時，它所編碼的罕見氨基酸的功能就是由mRNA3′---UTR內(nèi)的硒代半胱氨酸插入序列所指導(dǎo)的。當(dāng)前64頁，總共92頁。4、終止密碼子的選用研究表明，通用的終止密碼子雖然有三個，但是，它們在不同的真核生物中出現(xiàn)的頻率是不同的，脊椎動物和單子葉植物中使用頻率最高的是UGA,其他真核生物中主要使用UAA,而UGA的使用頻率最低，終止密碼子的選用與mRNA中GC的含量有關(guān)，賴氨酸的密碼子AAG經(jīng)常出現(xiàn)在終止密碼子的5′端位置，但其作用不明。5、UA序列的作用

UA序列是終止密碼子與polyA之間的非編碼區(qū)的一部分保守序列，一些細(xì)胞因子（生長因子）的mRNA3′UTR中含有相間分布的UUAUUUAU8核苷酸組成的保守序列，UA序列是蛋白質(zhì)翻譯的終止的協(xié)同信號，又是抑制翻譯起始的元件，UA序列作為一些低效起始因子的結(jié)合元件，通過再與起始復(fù)合物相互作用而抑制翻譯，其抑制效率隨其在mRNA3′UTR中拷貝數(shù)的增加而增高，但他抑制的步驟仍不清楚。當(dāng)前65頁，總共92頁。6.4.6mRNA穩(wěn)定性

mRNA的穩(wěn)定性也就是其壽命，原核生物的mRNA壽命較短，半衰期約為3分鐘，高等真核生物的細(xì)胞中mRNA的半衰期平均為3小時。壽命的長短除決定與其內(nèi)在因素（如二級結(jié)構(gòu)）外，還與轉(zhuǎn)錄后的修飾有關(guān)，而且不同的mRNA會與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合形成mRNP，mRNA壽命的長短可改變細(xì)胞內(nèi)某種mRNA的濃度，因而改變了蛋白質(zhì)的合成速度。1、mRNA5′帽子結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定性絕大多數(shù)真核生物的mRNA5′有帽子結(jié)構(gòu)，可以增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)其免遭核酸外切酶的攻擊，帽子結(jié)構(gòu)是前體mRNA在細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定的因素，同時也是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定的因素。當(dāng)前66頁，總共92頁。2、mRNA3′poly(A)與mRNA的穩(wěn)定性

mRNA3′poly(A)的長度一般為40---200個堿基，在轉(zhuǎn)錄后加上poly(A)短的mRNA的壽命也短。實驗：若用大腸桿菌的多核苷酸酶處理珠蛋白的mRNA，除掉poly(A），然后將有poly(A）和沒有poly(A）的兩種mRNA分別注射入非洲爪蟾的卵母細(xì)胞，觀察他們合成珠蛋白的能力，發(fā)現(xiàn)：（1）在注射后30到40分時，利用二者合成蛋白質(zhì)基本無差異；（2）但在1小時后，沒有poly(A）尾部的mRNA合成的蛋白質(zhì)急劇減少；（3）到56小時，有poly(A）的合成蛋白質(zhì)的能力還維持相當(dāng)水平，但無尾部的蛋白合成能力只有15%。當(dāng)前67頁，總共92頁。

此實驗很好地說明mRNA3′poly(A）的存在提高了mRNA的穩(wěn)定性，因而也提高了蛋白質(zhì)的合成總量。

另外，研究表明，poly(A）對mRNA穩(wěn)定性作用還需要poly(A）結(jié)合蛋白的參與，一旦，poly(A）結(jié)合蛋白與poly(A）分開，mRNA3′暴露，容易引起降解；最近的研究表明poly(A）對翻譯有激活作用在于促進(jìn)80S的核糖體翻譯起始物的形成，是通過與60S亞基的相互作用實現(xiàn)的。

當(dāng)前68頁，總共92頁。6.4.7mRNA5′---UTR1、帽子的功能主要有：（1）增強翻譯效率的作用，只有甲基化的帽子結(jié)構(gòu)才能使mRNA有效翻譯，（2）還有利于mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)。（3）增加mRNA的穩(wěn)定性，（4）與mRNA3′尾部協(xié)同翻譯效率。2、起始密碼子與翻譯的起始對大多數(shù)核糖體來講，只要第一個AUG的-3位為A，即可滿足從此開始翻譯。對于高等生物而說，在上游還有多個AUG，翻譯并不是從第一個開始。當(dāng)前69頁，總共92頁。3、AUG旁側(cè)序列與翻譯的起始效率（1）一般而言，-3位為A和-4位為G，對AUG的識別有促進(jìn)作用。（2）與AUG前導(dǎo)序列的長度有關(guān)，利用不同長度的mRNA5′---UTR，表明長度在17—80個核苷酸是，翻譯效率與長度成正比，結(jié)構(gòu)過短，則核糖體不識別AUG，會滑落下去。4、mRNA5′---UTR二級結(jié)構(gòu)對翻譯的影響一般說來，mRNA5′---UTR二級結(jié)構(gòu)對翻譯有抑制效應(yīng)，當(dāng)AUG距帽子有12個nt，由于位阻，阻擋了40S小亞基起始因子與mRNA的結(jié)合，導(dǎo)致翻譯不能開始。當(dāng)AUG距帽子有50個nt，則不影響它們的結(jié)合，對翻譯有促進(jìn)作用。在AUG下游14nt形成二級結(jié)構(gòu)，增強翻譯起始效率。當(dāng)前70頁，總共92頁。

綜上所述，對于有效翻譯必須有一個適當(dāng)?shù)拈L度的高級結(jié)構(gòu)區(qū)，否則翻譯會受影響。而對于富含G+C或者富含AUG的復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，不論長度多少，對翻譯均為抑制作用。當(dāng)前71頁，總共92頁。6.5翻譯后水平調(diào)控真核生物的基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工、mRNA的修飾、蛋白質(zhì)合成等生化過程生成基因產(chǎn)物后，基因表達(dá)的任務(wù)還不算最終完成。這是因為初生的原始狀態(tài)的蛋白質(zhì)大多是沒有生物學(xué)活性的，必須經(jīng)過一系列的加工才能成為有活性的蛋白質(zhì)。翻譯后加工主要包括多肽的切割、剪接與修飾等。

6.5.1多肽的切割6.5.2多肽的剪接和化學(xué)修飾當(dāng)前72頁，總共92頁。6.5.1多肽的切割多肽的切割主要有兩個內(nèi)容，一是與蛋白質(zhì)分泌有關(guān)的切割，二是與蛋白質(zhì)活化有關(guān)的切割。蛋白質(zhì)的合成是在核糖體中進(jìn)行的，核糖體根據(jù)DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯成各種蛋白質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中的核糖體主要有以下兩類：一類附著于膜上，主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜和線粒體內(nèi)膜，參與清蛋白、胰島素等分泌蛋白的合成；另一類游離于胞質(zhì)中，主要參與細(xì)胞固有蛋白的合成。在部分細(xì)胞中，核糖體上所合成的蛋白質(zhì)要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入高爾基體，在高爾基體中濃縮成酶原小粒并貯藏起來，直到分泌出去為止。人們發(fā)現(xiàn)，如果將某些分泌蛋白質(zhì)的mRNA在麥胚無細(xì)胞體系中進(jìn)行翻譯，其產(chǎn)物的分子量要比預(yù)期的大得多。例如，胰島素由51個氨基酸殘基組成，在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞體系中的翻譯產(chǎn)物為86個氨基酸殘基組成的胰島素原，但在麥胚無細(xì)胞體系中的翻譯產(chǎn)物則為約由110個氨基酸殘基組成的前胰島素原。這類分泌蛋白質(zhì)有一個特點，就是在它們的N端都有一段可稱為信號肽的小肽，這種帶有信號肽的蛋白質(zhì)稱為前蛋白。前蛋白必須在切除信號肽之后才具有生物活性。當(dāng)前73頁，總共92頁。1、信號肽的切割（1）信號肽假說（Signalpeptidehypothesis）信號肽假說是Blobel和Dobberstein于1975年首先提出的。該假說認(rèn)為，穿膜蛋白質(zhì)是由mRNA編碼的。在起始密碼子之后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA片段，這個氨基酸序列就稱為信號序列。信號序列在結(jié)合核糖體上合成后，便與膜上的特定受體相互作用，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(EndoplasmicReticulumER)中形成孔道，使生長中的肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，而存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔壁上的信號肽酶可將信號肽切下。早在1972年就有研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白（1gG）輕鏈可能是以“前體”形式合成的，其N端比成熟蛋白多一段由20個氨基酸殘基組成的多肽，推測該多肽具有信號作用，能使1gG蛋白得以順利穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜并分泌到細(xì)胞外。

當(dāng)前74頁，總共92頁。主要有三個方面的研究支持上述設(shè)想：

a.當(dāng)IgG輕鏈的mRNA在無細(xì)胞體系內(nèi)被翻譯時，在沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在的情況下將產(chǎn)生IgG輕鏈的前體；如果在翻譯時加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，就能得到成熟的IgG輕鏈；

b.加入蛋白水解酶并不能使合成的IgG輕鏈水解，但若同時加入去垢劑，IgG蛋白就能被水解，暗示IgG的合成伴隨跨膜轉(zhuǎn)運過程；

c.用去垢劑處理多核糖體使之與膜分離，然后進(jìn)行體外新生肽合成實驗，發(fā)現(xiàn)短時溫育可得到成熟型的IgG輕鏈，而較長時間溫育則得到IgG輕鏈的前體，這表明位于mRNA5’端的核糖體攜帶了尚未進(jìn)行加工的新生肽，而鄰近3’端的核糖體則帶著已加工的新生肽，從而證實信號肽的分解是與翻譯過程同時發(fā)生的。當(dāng)前75頁，總共92頁。（2）信號肽的結(jié)構(gòu)特點信號肽在結(jié)構(gòu)上具有以下特點：

a.信號肽的氨基端至少含有一個帶正電荷的氨基酸，為一親水區(qū)段。不同信號肽的親水區(qū)段所含氨基酸殘基的多少不同，從而造成信號肽長短不齊，但其長度通常為1~7個AA。

b.信號肽的中部有10~15個氨基酸，是由高度疏水性的氨基酸組成的肽鏈。常見的氨基酸有Ala、Leu、Ile、Val、Phe等。該疏水區(qū)很重要，其中某一個氨基酸被極性氨基酸置換便可使信號肽失去功能。該區(qū)段長5.5nm，以側(cè)鏈較短的氨基酸（如G1y、Ala）結(jié)尾，其結(jié)尾的氨基酸恰好在信號肽酶的切點之前。

c.信號肽的C末端有一個可被信號肽酶識別的位點，此位點上游的第一個(1)及第三個(3)氨基酸常為具有一個小側(cè)鏈的氨基酸(如Ala)。

d.信號肽無同等性及專一性。各種分泌蛋白質(zhì)的信號肽在順序上并未發(fā)現(xiàn)有同等性，也未發(fā)現(xiàn)信號肽存在于已完成的多肽上。信號肽也無嚴(yán)格的專一性，表現(xiàn)在信號肽對所輸送蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的要求不嚴(yán)格，例如，大鼠前胰島素原如果接上真核細(xì)胞或原核細(xì)胞的信號肽，也能通過大腸桿菌的質(zhì)膜分泌到胞外，甚至在信號肽的氨基端額外連接著18個氨基酸殘基時也仍可以輸出。當(dāng)前76頁，總共92頁。（3）信號識別蛋白和對接蛋白

a.信號識別蛋白(或信號識別顆粒，signalrecognitionparticle，SRP)

蛋白質(zhì)在體內(nèi)的合成速度極快，信號肽段一旦在核糖體上伸出，必須在幾秒鐘內(nèi)固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，這是因為肽鏈的加長會形成二級結(jié)構(gòu)，妨礙信號肽與酶的結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)存在著信號肽的一種識別顆粒，在核糖體上剛露出信號肽段時，該識別顆粒就可以與此核糖體上的信號肽結(jié)合，阻斷此種分泌蛋白的合成，使mRNA與核糖體的復(fù)合體有足夠的時間找到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜?，F(xiàn)在已知識別顆粒是由六條多肽鏈（分子量分別為72、68、54、19、14、9KD）和7SRNA構(gòu)成的核糖核酸蛋白體復(fù)合體。b.對接蛋白（dockingprotein，DP）

1982年，Meyer等人發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在著一種“對接蛋白”，又稱?？康鞍谆蜃R別顆粒受體蛋白。它是一種內(nèi)在膜蛋白，由單個多肽鏈的650個氨基酸殘基組成，分子量為72KD。對接蛋白可使SRP-信號肽-新生肽鏈-核糖體復(fù)合物結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，解除SRP對核糖體合成肽鏈的抑制。當(dāng)它們結(jié)合后，核糖體又恢復(fù)新生肽鏈的延長，隨后，新生肽鏈緊跟信號肽伸入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，信號肽被水解，形成“成熟型蛋白質(zhì)”（主要是分泌蛋白、溶酶體蛋白和膜蛋白）。這時核糖體也離開膜，分成大、小兩個單位游離在胞質(zhì)溶液中，準(zhǔn)備下一個循環(huán)。最后多肽鏈的C端也進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。N末端的信號肽SRP和它的受體（對接蛋白）僅在開始轉(zhuǎn)運新生肽鏈時結(jié)合在一起，隨后SRP從核糖體-新生肽鏈復(fù)合體上分離下來，又回到胞質(zhì)中準(zhǔn)備下一個循環(huán)。當(dāng)前77頁，總共92頁。

（4）信號肽受體和核糖體受體在真核生物中信號肽可識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種蛋白質(zhì)，即信號肽受體，并與之結(jié)合，使膜上形成一個孔眼或隧道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上還存在核糖體受體，當(dāng)核糖體與其相應(yīng)的受體結(jié)合時，可加固上述孔眼或隧道。（5）信號肽酶

真核生物的信號肽酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上。新生的肽鏈通過孔眼進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔以后，信號肽酶可切除信號肽段。對于多數(shù)蛋白質(zhì)，信號肽段的切除是在多肽鏈已合成到80%以上時才開始進(jìn)行的。當(dāng)前78頁，總共92頁。（6）翻譯協(xié)同分泌如上所述，大多數(shù)蛋白質(zhì)在合成時即開始其穿越生物膜的過程，這就是所謂的與翻譯偶聯(lián)的分泌——翻譯協(xié)同分泌。在真核生物中，以胰島素的分泌為例，可將翻譯協(xié)同分泌的具體過程歸結(jié)如下：分泌蛋白質(zhì)新生多肽鏈的信號肽段在核蛋白體上出現(xiàn)后，識別顆粒便使翻譯暫停，使該核蛋白體有足夠時間找到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。信號肽段與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體結(jié)合的同時，核糖體60S亞基也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的核糖體受體結(jié)合，此時對接蛋白去除識別顆粒，使翻譯繼續(xù)進(jìn)行。信號肽與其受體結(jié)合后，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成孔道，核糖體與其受體結(jié)合后，可加固此孔道，信號肽段即可突入此孔道，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔壁上有信號肽段酶，通常在多肽鏈全鏈合成80%以上時將信號肽段切下（此時前胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素原）。信號肽段切下后，肽鏈本身繼續(xù)增長，直至合成終止。多肽鏈合成完成后，多肽鏈(胰島素原)釋下，全部進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的RER面向SER面移動，最后進(jìn)入高爾基體（Golgibody），在高爾基體中經(jīng)過進(jìn)一步加工后（由胰島素原成為胰島素）儲存于分泌小泡。最后，分泌小泡與質(zhì)膜融合，形成出口，分泌蛋白(胰島素)即可排出胞外。當(dāng)前79頁，總共92頁。當(dāng)前80頁，總共92頁。2、多肽的水解加工（1）胰島素原（proinsulin）的加工在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)合成結(jié)束時，前胰島素原就轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素原。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中形成的胰島素原可被運送到高爾基體，經(jīng)加工，切去連接肽段，即成為胰島素，儲于分泌小泡。這些小泡可與質(zhì)膜融合，形成出口，將胰島素排出胞外。已合成好的胰島素原為一條肽鏈，這條肽鏈由84個氨基酸殘基組成，存在三個-S-S-鍵。在酶的作用下整個肽段被切三段，去掉由33個氨基酸組成的肽段（這一段有掩蓋胰島素活性的作用），余下的部分即為由兩條肽鏈構(gòu)成的有活性的胰島素。其中，A鏈為原羧基端所在肽鏈，含21個氨基酸；B鏈為原氨基端所在肽鏈，含30個氨基酸。當(dāng)前81頁，總共92頁。當(dāng)前82頁，總共92頁。（2）纖維球蛋白原的加工纖維球蛋白原是由、和這三種肽鏈各兩條所組成的蛋白質(zhì)。其中和鏈都有一個“中央突出”，妨礙了纖維球蛋白分子之間的聚合。經(jīng)過蛋白水解酶的作用，切去這些突起的部位后，三個多肽才能緊密聚合在一起，形成不溶性的纖維球蛋白。這種由纖維球蛋白原變成纖維球蛋白的過程，就是血液凝固的最后階段中所發(fā)生的生物化學(xué)反應(yīng)。血液凝固的過程其實是不同蛋白質(zhì)因子經(jīng)有限水解不斷被活化的過程。血凝因子原來以非活性形式存在，當(dāng)血液流出血管表面（傷口處）時，非活性的XIII因子被活化。這些因子又使前凝血酶原和纖維球蛋白原活化，產(chǎn)生不溶性纖維球蛋白，使血液凝固。當(dāng)前83頁，總共92頁。6.5.2多肽的剪接和化學(xué)修飾1、多肽的剪切初生蛋白質(zhì)接受切割、有限水解或化學(xué)修飾而成為有活性的成熟蛋白質(zhì)，這就是蛋白質(zhì)活化的主要機制。近年來，不少科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)前體可以通過多肽的剪輯被切成數(shù)個片段，然后再以一定的順序結(jié)合起來，最后形成成熟的有活性的蛋白質(zhì)。具有這種加工機制的蛋白質(zhì)包括紅細(xì)胞凝集素、T細(xì)胞的促細(xì)胞分裂劑、豆類植物的凝集素和伴刀豆球蛋白等。例：伴刀豆球蛋白：實際上是以混合物的形式存在于成熟的大豆種子中，其中“誘導(dǎo)型”伴刀豆蛋白是一個四聚體，相對分子質(zhì)量為1.0×l05，由4條含237個氨基酸的肽鏈構(gòu)成；

“分裂型’伴刀豆球蛋白是斷裂型多聚體，相對分子質(zhì)量為5.0×104，每條肽鏈在第118位的天冬酰胺與119位的絲氨酸之間被切斷。當(dāng)前84頁，總共92頁。

研究編碼這些蛋白的基因序列發(fā)現(xiàn)，伴刀豆蛋白前體可由五部分組成，即：信號肽（由29個氨基酸組成）、成熟伴刀豆球蛋白的C末端（第119~237位氨基酸）、連接肽（含15個氨基酸）、成熟伴刀豆球蛋白的N末端（1~118位氨基酸），以及伴刀豆球蛋白C