生物技術概論細胞工程課件

第四章細胞工程

CellEngineering主要講授內容：1細胞工程概述2植物細胞工程3動物細胞工程4微生物細胞工程本章要求：理解細胞工程的概念；掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法；理解植物非試管快繁的基本原理和方法；理解植物細胞培養(yǎng)、人工種子、細胞融合的基本原理和方法；了解植物細胞工程的研究進展與應用前景；理解單克隆抗體技術、細胞核移植與動物克隆、染色體轉移、干細胞等研究的基本原理與方法；了解動物細胞工程的研究進展與應用；了解微生物細胞工程的基本原理；了解微生物細胞工程的研究進展與應用。1.1細胞工程概念細胞工程：在細胞水平上研究、開發(fā)、利用各類細胞的工程，即人們根據科學設計改變細胞的遺傳基礎，并通過無菌操作，大量培養(yǎng)細胞、組織乃至完整個體的技術（教材P60）。細胞工程：應用細胞學的方法，按照我們人類的需要和預定的設計，有目的、有計劃地保存、改變和創(chuàng)造新細胞及其遺傳物質，從而產生新的種或者品種的技術。細胞工程：應用細胞生物學和分子生物學的方法，在細胞水平進行的遺傳操作。1細胞工程概述細胞工程：是指以細胞為基本單位進行培養(yǎng)、增殖（細胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)）或按照人們的意愿改造細胞的某些生物學特性，從而創(chuàng)造新的生物和物種，以獲得具有經濟價值的生物產品。它主要由兩部分構成，其一是上游工程，包含細胞培養(yǎng)、細胞遺傳操作和細胞保藏三個步驟。另一個則是下游工程，是將已轉化的細胞應用到生產實踐中去，以生產生物產品的過程。1.1細胞工程概念1.2細胞工程研究的對象

細胞或其組成部分和構成的組織、器官等如染色體、細胞核、原生質體、整個細胞、受精卵、胚胎、組織或器官。1細胞工程概述1.4細胞工程的優(yōu)點1.4.1

細胞工程開辟了基因重組的新途徑，它不需要經過分離、提純、剪切、拼接等基因操作只需將細胞遺傳物質直接轉移到受體細胞中，就能夠形成雜交細胞，因而提高了基因轉移的效率。1細胞工程概述1.4.2細胞工程克服了常規(guī)雜交的局限性，使遠緣雜交有了新的途徑。它不僅可以在植物一植物之間，動物與動物之間，微生物與微生物之間進行遠緣雜交，甚至可以在動物與植物、動物與微生物之間進行細胞融合，形成雜交物種。土豆—番茄、山綿羊、大豆—煙草、芹菜—胡蘿卜。1.4.3用細胞工程的技術來改造和創(chuàng)造新生物，比起用基因工程技術來稍為容易些。1.4細胞工程的優(yōu)點1.5細胞工程與其他生物工程的關系細胞工程與其他生物工程的關系1細胞工程概述優(yōu)質植物快速培育與繁殖動物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種利用動植物細胞培育生產活性產物、藥品新型動植物品種的培育供醫(yī)學器官修復或移植的組織工程轉基因動植物的生物反應器工程珍稀動植物資源的保存與保護在遺傳學發(fā)育學等領域的理論研究在能源、環(huán)境保護等領域的應用1.6細胞工程的應用2植物細胞工程2.1植物組織培養(yǎng)2.2植物細胞培養(yǎng)2.3植物非試管快繁2.4植物原生質體培養(yǎng)與融合2.5人工種子的研制2.6植物細胞工程研究進展（綜述）2.1植物組織培養(yǎng)

（Planttissueculture）2.1.1幾個重要概念2.1.2對植物組織培養(yǎng)實驗室的要求2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.4主要植物組織培養(yǎng)技術2植物細胞工程

脫分化

再分化

外植體愈傷組織生長點

幼莖、根

小植株

植物組織培養(yǎng)：

在無菌條件下，將離體的植物器官（根尖、莖尖、葉、花、果實、種子等）、組織（花藥、胚乳、皮層、髓組織等）、細胞（體細胞、生殖細胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生質體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產生愈傷組織、叢生芽或長成新的完整的植株的一種實驗技術。由于在試管內培養(yǎng)，且培養(yǎng)的是脫離植株母體的培養(yǎng)物，所以也叫“離體培養(yǎng)”（Cultureinvitro）或“試管培養(yǎng)”（Intest-tubeculture）。2.1.1幾個重要概念外植體(Explant)：植物組織培養(yǎng)中用來進行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質體等。愈傷組織(Callus)：外植體產生的排列疏松而無規(guī)則且沒有發(fā)生分化的薄壁細胞。

脫分化（dedifferentiation）：原來已經分化,并且具有一定功能的體細胞(或性細胞),喪失了原有的結構和功能,又重新恢復了分裂功能,就叫做植物細胞的脫分化。2.1.1幾個重要概念接種室培養(yǎng)室2.1.2對植物組織培養(yǎng)實驗室的要求觀察與鑒定室大棚2.1.2對植物組織培養(yǎng)實驗室的要求2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟

()2.1.3.1培養(yǎng)基配制2.1.3.2滅菌2.1.3.3接種2.1.3.4培養(yǎng)2.1.3.5試管苗馴化移栽2.1.3.6試管苗增殖率的估算2.1.3.7快速繁殖工作的計劃安排

2.1植物組織培養(yǎng)有機營養(yǎng)成分：（配成母液

）碳水化合物：蔗糖和葡萄糖，白糖節(jié)約成本一般的使用濃度為2%—4%。植物生長調節(jié)物質（常稱為激素）：配成母液

生長素：NAA、IAA、IBA、2，4－D；細胞分裂素：KT(激動素)、6-BA(6-芐基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2－iP（2－異戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效?。┖蚑DZ（噻重氮苯基脲）。其它：赤霉素（GA3）；脫落酸（ABA）；多效唑（PP333

）水：①一個完善的培養(yǎng)基成分

②培養(yǎng)基的種類：按培養(yǎng)基組成特點分類第一類為含鹽量高的培養(yǎng)基，如MS、LS、BL、ER。第二類為硝酸鉀含量高的培養(yǎng)基，如B5、N6、SH。第三類是無機鹽中等含量培養(yǎng)基，如H和Nitsch培養(yǎng)基。第四類為低鹽含量基本培養(yǎng)基，如White、WS和HE培養(yǎng)基。

按培養(yǎng)基的功能分類脫分化培養(yǎng)基初代培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基２.1.3.1培養(yǎng)基

的配制2.1.3.1培養(yǎng)基

的配制③怎樣選取最佳培養(yǎng)基方案（例：MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Su3%+Agar0.6%）對于某個待培養(yǎng)的目的植物來講：查資料-----預備性試驗----觀察培養(yǎng)物的反映-----調整：單因子試驗，多因子試驗和正交設計-----逐步添加和逐步排除基本培養(yǎng)基的選擇激素的選擇：激素種類、濃度、激素配比糖的選擇：糖的種類、濃度的選擇瓊脂的選擇：主要是濃度的選擇附加物的選擇：香蕉汁、活性炭、椰子汁等濃度為mg/L細胞分裂素0.5

1.5

34.5生長素0

（1）（2）（3）（4）0.5

（5）（6）（7）（8）1.0

（9）（10）（11）（12）1.5

（13）（14）（15）（16）④培養(yǎng)基的配制方法（藥品室進行）MS+6-BA0.5+NAA1+Su3%+Agar0.6%500mL

水+母液：激素或其他成分：如活性碳等糖類：一般30g/L瓊脂：一般6－8g/L加熱溶化：pH值調整：定容：分注、封口：滅菌：2.1.3.1培養(yǎng)基

的配制2.1.3.2滅菌①濕熱滅菌：培養(yǎng)基及布制品的滅菌幾種排氣的方法：時間與體積的關系：放氣方法：容器的體積/mL在121℃滅菌所需最少時間/min20-501575-15020250-500251000302.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟②灼燒滅菌：用于無菌操作的器械95%的酒精+酒精燈火焰上灼燒接種器殺菌器：如圖③過濾滅菌：不耐熱的物質2.1.3.2滅菌④干熱滅菌：玻璃器皿及耐熱用具等⑤紫外線和熏蒸滅菌：空間滅菌所用（培養(yǎng)室、接種室等）⑥一些物體表面用藥劑噴霧滅菌

2.1.3.2滅菌⑦消毒劑表面滅菌：植物材料（超凈工作臺上，接種室）

消毒劑因素材料采集的因素老嫩因素部位因素天氣因素季節(jié)因素時間因素

外植體消毒步驟2.1.3.2滅菌消毒劑因素消毒劑使用濃度去除難易消毒時間（分）效果次氯酸鈣9％－10％易5－30很好次氯酸鈉2％易5－30很好過氧化氫10％－12％最易5－15好溴水1％－2％易2－10很好硝酸銀1％較難5－30好氯化汞0.1％－1％較難2－25最好抗生素4－50mg/L中30－60較好酒精70％－75％易數秒－5分好漂白粉飽和易5－30很好2.1.3.2滅菌外植體消毒步驟材料→自來水→蒸餾水→75%酒精30~60S無菌水3~4次→10%次氯酸鈉或次氯酸鈣飽和液或0.1~0.2%升汞（吐溫）5~15min→無菌水洗5~8次。2.1.3.2滅菌２.1.3.３接種（接種室）2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.3.４培養(yǎng)Culture（培養(yǎng)室）培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng)法

液體培養(yǎng)法

培養(yǎng)步驟

初代培養(yǎng)：愈傷組織；原球莖；頂芽和腋芽的發(fā)育；不定芽的發(fā)育；體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育；初代培養(yǎng)外植體的褐變繼代培養(yǎng)：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等生根培養(yǎng):2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟培養(yǎng)條件：環(huán)境培養(yǎng)條件：溫度（Light)、濕度（Humidity)、光照［光質（Lightwave)、光強（Lightintensity)、光周期（Lightperiod)］化學環(huán)境條件：滲透壓（Penetratingpressure)、ｐＨ、氣體（Gas)1.3.４培養(yǎng)2.1.3.5試管苗馴化移栽①試管苗與大田苗在生理、形態(tài)等方面的差異②異養(yǎng)型自養(yǎng)型③無菌有菌④管理：保持小苗的水分供需平衡。防止菌類滋生。一定的溫、光條件。保持基質適當的通氣性。

2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.3.6試管苗增殖率的估算①基本數據的統計每一周期（從接種當天到再次可供接種的當天）需要多少天每一周期每一瓶能接種多少瓶每瓶有多少苗①基本數據的統計每一周期（從接種當天到再次可供接種的當天）需要多少天每一周期每一瓶能接種多少瓶每瓶有多少苗2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟②計算出年增殖率的理論值年增殖率：Y；每周期增殖的倍數：X；

全年可增殖的周期數：n=365/每一周期的天數；

Y=Xn

2.1.3.6試管苗增殖率的估算仙茅（石蒜科）葡萄（葡萄科）茶樹（山茶科）麻瘋樹（大戟科）油樟（樟科）生姜（姜科）蘭草（蘭科）蘆薈蘭草麻瘋樹移栽2.1.3.7快速繁殖工作的計劃安排人工的配置安排實驗啟動的時間安排增殖瓶數的控制污染的估測2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.4植物主要的組織培養(yǎng)技術2.1.4.1植物脫毒與快繁技術2.1.4.2花藥及花粉培養(yǎng)2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)2.1植物組織培養(yǎng)2.1.4.1植物脫毒與快繁技術2.1.4植物主要的

組織培養(yǎng)技術①意義快速繁殖，保持優(yōu)良品質生產無毒苗，提高苗木品質節(jié)約土地快速繁殖：一片樹葉能變一座森林一年內可從一個蘭花莖尖繁殖出400萬株遺傳性狀均一的健康植株；花葉芋：常規(guī)繁殖：幾倍——幾十倍組培繁殖：幾萬——數百萬倍月季、菊花、牡丹、山茶等。脫毒花卉：去病毒后，植株生長勢強，花朵變大，色澤鮮艷，抗逆能力提高，產花數量上升。預計在21世紀，這一技術的應用將更為廣泛。如：蘭花、大麗花、水仙、天竺葵菊花等。脫毒馬鈴薯：增產40-200%(2000-2500kg/畝)。紅薯：增產30%以上。草莓：增產500-1000千克/畝2.1.4.1植物脫毒與快繁技術2.1.4.1植物脫毒與快繁技術②植物脫毒技術為什么植物需要脫毒?脫毒方式：熱處理脫毒→病毒鈍化(寄主植物很少或不會受到傷害)溫湯浸漬處理：在50℃左右的溫水中浸漬10分鐘至數小時。缺點：易使材料受傷。熱空氣處理：35-40℃，幾十分鐘，長可達數月溫熱治療室（箱）內。缺點：缺陷是并非能脫除所有病毒熱處理需與其他方法配合應用才可獲得良好的效果。

生長點（約0.1-1MM區(qū)域）幾乎不含或含病毒很少.分生區(qū)域內無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細胞不斷分裂和活躍的生長速度。

莖尖培養(yǎng)脫毒2.1.4.1植物脫毒與快繁技術其他途徑脫毒

愈傷組織培養(yǎng)脫毒

僅有部分單個細胞含有病毒——病毒的復制速度趕不上細胞的增殖速度或有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。缺陷——植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產生變異植株，并且一些作物的愈傷組織尚不能產生再生植株。

化學療法脫毒

許多化學藥品（包括嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸、抗菌素等）對離體組織和原生質體具有脫毒效果。2.1.4.1植物脫毒與快繁技術③脫毒效果檢測抗血清(antiserum)鑒定：已知植物病毒——核蛋白（抗原）制備抗體；抗血清+未知的病毒植物→可見的沉淀（試管）酶聯免疫吸收鑒定（ELISA）：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制備）——二抗（酶）——酶的顯色底物溶液——酶標儀檢測電子顯微鏡（electricmicroscope)檢查法：直接觀察病毒的有無或種類指示植物法(indicatingplant)：被鑒定植物的汁液接種指示植物或嫁接接種法（指示植物作為砧木，被鑒定植物作接穗）指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的?；园Y狀的寄主植物。2.1.4.1植物脫毒與快繁技術2.1.4.2花藥及花粉培養(yǎng)①概念與意義花藥培養(yǎng)：花藥培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培養(yǎng)基上，來改變花粉的發(fā)育程序，使其分裂形成細胞團，進而分化成胚狀體，產生再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。屬器官培養(yǎng)還是細胞培養(yǎng)？花粉培養(yǎng)：花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養(yǎng)的技術。由于花粉已是單倍體細胞，誘發(fā)它經愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株。優(yōu)點：不受花藥的藥隔，藥壁、花絲等體細胞的干擾；缺點是較比花粉培養(yǎng)難度大。屬器官培養(yǎng)還是細胞培養(yǎng)？為何更多的要花藥培養(yǎng)?(藥壁提供營養(yǎng))共同的目的：花粉細胞→單倍體(haploid)細胞→單倍體植株（但不是最終目的但具應用潛力，為什么？）→經染色體加倍→正常結實二倍體植株。

2.1.4植物主要的

組織培養(yǎng)技術2.1.4.2花藥及花粉培養(yǎng)單倍體植物三個明顯的特點：

體細胞染色體數減半；

生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；

雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代。單倍體的應用潛力：迅速獲得純合型材料，縮短育種年限

獲得育種中間材料

與誘變育種相結合可以提高誘變頻率與細胞融合相結合，使這一育種途徑更具有實際應用意義

作為遺傳工程受體更為有效（當代表達）

用作基礎遺傳研究的各個領域加倍后的二倍體特點：屬于真正的純系。和常規(guī)多代自交純化方法相比，可節(jié)省大量的時間和勞力。

2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)②花藥培養(yǎng)的基本程序是：

外植體選擇－外植體(花蕾)預處理—外植體消毒—剝取花藥—接種—誘導培養(yǎng)—分化培養(yǎng)花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。

煙草、茄子3～5℃72小時

水稻10℃10～14天

柑橘3℃5～10天

馬鈴薯4℃48小時低溫處理的作用：可以激發(fā)花粉母細胞產生兩個相等核:一個營養(yǎng)核一個生殖核；

保持高比例的強生活力花粉，同時延緩體細胞組織的衰老；激發(fā)花粉產生原胚；

促使細胞同步分裂。2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)③花藥培養(yǎng)中單倍體形成的途徑營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑:生殖核退化,營養(yǎng)核發(fā)育生殖細胞發(fā)育途徑:營養(yǎng)核退化，生殖核發(fā)育營養(yǎng)細胞和生殖細胞同時發(fā)育的途徑:花粉均等分裂途徑:

2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)形成胚狀體或愈傷組織④花粉及小孢子培養(yǎng)花粉培養(yǎng)的基本程序是：

取材時期的確定－外植體(花蕾)預處理—外植體消毒—花粉或小孢子的分離—接種—培養(yǎng)取材時期的確定四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期預處理有利于改變正常的發(fā)育途徑，而且還可以促進花粉植株的形成花粉或小孢子的分離:花藥→小燒杯(有基本培養(yǎng)基)→擠壓花藥(注射器內管)花粉釋放→過濾(尼龍篩)→低速離心（100-160r/min)→吸管吸掉碎片→加入新鮮培養(yǎng)基→連續(xù)進行兩次過濾，到每毫升含103-104個花粉/mL

培養(yǎng)方法

花藥看護培養(yǎng)

花粉懸浮培養(yǎng)（微室培養(yǎng)）

2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)⑤單倍體植株的鑒定與二倍化鑒定方法：形態(tài)學鑒定染色體分析單倍體植株的二倍化：繼代加倍創(chuàng)傷法加倍秋水仙素處理加倍2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)包括胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)。①植物胚培養(yǎng)(embryocultureofplants)克服雜交育種中雜種胚的早期夭折胚培養(yǎng)包括成熟胚(matureembryo)培養(yǎng)；幼胚(immatureembryo)培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)中，常見的生長方式有三種：(1)、胚性發(fā)育(embryonaldevelopment)幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然按照在活體內的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚(有時甚至可能類似種子)，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株，這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個幼胚將來就是一個植株。(2)、早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長，而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，通常稱之為早熟萌發(fā)。在大多數情況下，一個幼胚萌發(fā)成一個植株，但有時會由于細胞分裂產生大量的胚性細胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現象就是所謂的叢生胚現象。(3)、愈傷組織(callus)在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細胞增殖，形成愈傷組織。一般來講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)②子房培養(yǎng)子房培養(yǎng)包括授粉前和授粉后的子房培養(yǎng)。材料的選擇品種間的差異胚囊發(fā)育時期與花粉發(fā)育時期的相關性（大麥）花粉發(fā)育時期胚囊發(fā)育時期

單核中期大孢子四分體

單核靠邊期單核至四核胚囊

二核花粉期八核胚囊

三核花粉期成熟胚囊

2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)中單倍體的來源和發(fā)育途徑由助細胞或胚囊的無配子生殖產生單倍體卵細胞、助細胞、反助細胞均可發(fā)育產生單倍體非正常發(fā)育的大孢子四分體產生單倍體2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)③胚乳培養(yǎng)胚乳細胞的全能性？被子植物與裸子植物胚乳（三倍體或單倍體？）（在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細胞是否與其它體細胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。）大多數被子植物的胚乳是三倍體，能否通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無籽結實；通過胚乳培養(yǎng)技術，探索改良農、林及園藝植物三倍體育種技術的可能性。到目前為止，已有40多種植物的胚乳進行了培養(yǎng)。其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、葉等或得到愈傷組織。2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它是單倍體組織。在被子植物中胚乳是雙受精的產物，在倍性上屬于三倍體，事實上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)2.2.1細胞懸浮培養(yǎng)

2.2.2固定化細胞培養(yǎng)2.2.3植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質生產2.2植物細胞培養(yǎng)(suspensionculture)2植物細胞工程2.2.1細胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.1細胞懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。植物細胞培養(yǎng)中常用方法。怎樣獲得單個游離細胞?（酶解）怎樣獲得小細胞團？（愈傷組織分割；機械法；單細胞聚集）2.2.1.2基本過程：外植體（幼胚、胚軸、子葉等）→培養(yǎng)基→愈傷組織（松散性好、增殖快、再生能力強）或酶解物→震蕩培養(yǎng)→大量植物細胞→次生代謝產物2.2植物細胞培養(yǎng)(suspensionculture)2.2.1.3懸浮培養(yǎng)三個優(yōu)點：改善營養(yǎng)供應：增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面；避免細胞代謝產生的有害物質在局部積累而對細胞自身產生毒害；可以適當改善氣體的交換。2.2.1細胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.4一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：·懸浮培養(yǎng)物分散性良好：細胞團較小，一般在30～50個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系?！ぞ恍院茫杭毎螤詈图毎麍F大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色?！ぜ毎L迅速：懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加一倍。2.2.1細胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.5植物懸浮培養(yǎng)系統：封閉式培養(yǎng)系統組成、操作、有缺點（→半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)）實例（銀杏、冬青、薔薇等）2.2.1細胞懸浮培養(yǎng)機械攪拌式培養(yǎng)系統

機械攪拌式生物反應器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎上改進設計的，根據植物細胞的特性，其設備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎上作如下改進：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因為植物細胞生長周期長，需要隨時補充水分和營養(yǎng)，因此必須設計加液裝置；由于植物細胞的生理活動需要新鮮空氣，且細胞代謝也可能產生有害氣體，所以必須設計通氣裝置；為便于取樣觀察，一般還設計有取樣口。優(yōu)點：很高的溶氧系數，適于耐剪切力強的植物細胞培養(yǎng)。缺點：剪切力大實例：煙草細胞、水母雪蓮細胞等氣壓攪拌式培養(yǎng)系統

考慮到機械攪拌式反應器的剪切作用難以避免，同時攪拌器轉動的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應器，但其缺點是攪拌不均勻。2.2.1細胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.6植物懸浮培養(yǎng)（小細胞團）的目的（或應用）：種質保存—固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)得到大量植物細胞產物——基上進行，如人參干細胞粉；紫草細胞消炎藥物得到次生代謝產物——液體培養(yǎng)(主要應用)生物轉化——利用酶系的作用將第五轉化為所需的產物2.2.1細胞懸浮培養(yǎng)2.2.2固定化細胞培養(yǎng)2.2.2.1固定化細胞：指固定在載體上，在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞。優(yōu)點：穩(wěn)定性好，產物易分離，利于連續(xù)化生產缺點：只適合分泌到細胞外的次生代謝物的生產細胞生長分裂旺盛時，次生代謝物產量低。采用固相培養(yǎng)，將細胞培養(yǎng)在惰性基質中，細胞生長緩慢，可提高次生代謝物質的產量.2.2植物細胞培養(yǎng)(suspensionculture)2.2.2.2植物細胞固定化的方法①吸附法:利用各種固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法。吸附材料：多孔陶瓷、多孔塑料、多孔玻璃等。實例：多孔泡沫放入辣椒細胞的培養(yǎng)液中；2.2.2固定化細胞培養(yǎng)②包埋法包埋式固定化培養(yǎng)系統：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；

·附著式固定化培養(yǎng)系統：支持物采用尼龍網、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。2.2.2.2植物細胞固定化的方法2.2.2.3固定化植物細胞的特點（與植物細胞懸浮培養(yǎng)對比）①減輕剪切力和其它外界因素對植物細胞的影響，提高植物細胞的存活率和穩(wěn)定性（載體的保護作用）②細胞不易聚集成團（細胞被束縛在一定的范圍）③更換培養(yǎng)液容易④縮短生產周期（可以從培養(yǎng)基中不斷提取產物，因此，它可以進行連續(xù)生產）。⑤固定化細胞易與培養(yǎng)液分離⑥細胞生長緩慢，可提高次生代謝物質的產量。2.2.2固定化細胞培養(yǎng)消除代謝產物積累對細胞生長的抑制作用(培養(yǎng)周期——延遲期（細胞很少分裂或剛剛開始分裂），直線生長期（對數生長期，細胞生長分裂旺盛時，次生代謝物產量低，細胞數目迅速增長，生長速率保持不變生長期，細胞數增長最快，而細胞的干重和蛋白質含量增長較慢），減緩期（細胞數目的增長速度減緩），靜止期（細胞分裂停止，細胞數目恒定。培養(yǎng)基中營養(yǎng)耗盡，必須進行繼代培養(yǎng)，進入靜止期之前，細胞數增長減慢，而細胞鮮重和干重增長超過了細胞數的增長，并一直持續(xù)到靜止期）

2.2.2固定化細胞培養(yǎng)

2.2.2.4固定化植物細胞培養(yǎng)系統平床培養(yǎng)系統立體培養(yǎng)系統2.2.2固定化細胞培養(yǎng)2.2.2.5固定化植物細胞培養(yǎng)的應用2.2.2固定化細胞培養(yǎng)掃描圖：P115（細胞培養(yǎng)書）2.2.2固定化細胞培養(yǎng)2.2.3植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質生產

利用培養(yǎng)細胞生產有用物質（次生代謝物質）的原理細胞的全能性：培養(yǎng)細胞具有該物種的藥物生物合成（次生代謝物質）的全能性。每個植物活細胞都具有該物種的新陳代謝、應激性和自體復制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現這些特征屬性。。植物次生代謝產物是指植物中一大類非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。2.2.3.1一般程序

①選材培養(yǎng)器官、組織的選擇：取有藥效成分的部位，且該部位較易形成愈傷組織。細胞生長狀態(tài)的選擇：自然條件下，一般植物生長不活躍的部分，如老葉、果實和種子，傾向于積累次生代謝物，而分生組織等快速生長的部分，次生代謝物的含量低。植物離體培養(yǎng)下，一般脫分化的細胞生長旺盛，很難積累次生物質。當細胞接近于衰老時，才趨向于積累次生代謝物質。2.2.3植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質生產②細胞株系建立建立懸浮細胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）合成能力高的細胞株系的篩選與更新：篩選高產的細胞株系是提高生產率、降低生產成本的重要因素。

對細胞培養(yǎng)的選擇有兩個基本要求：（1）有用物質的合成積累能力強（2）生長速度快

2.2.3.1一般程序③大量培養(yǎng)將選出的優(yōu)良細胞株擴大繁殖后，可作為細胞工廠化培養(yǎng)的生產“種子”，進行大量培養(yǎng)。④產品提取與純化從植物細胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產品。2.2.3.1一般程序2.2.3.2培養(yǎng)方法——二步培養(yǎng)法

細胞生長與次生物質的產生對培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的要求不同，因而在細胞工廠化培養(yǎng)中采用二步培養(yǎng)方法，既使細胞生長快，又使次生物質代謝多。第一步，促進細胞分裂，解決生物量生產問題；第二步，促進次生代謝物合成，解決次生物質的積累問題。在細胞指數生長停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質的積累。（一部分細胞用于提取物質，另一部分用于繼續(xù)培養(yǎng)，進行下一個細胞周期）

2.2.3.2

培養(yǎng)方法——二步培養(yǎng)法

2.2.3.3提高有用物質生產效率的技術因素

①細胞株系生物合成能力以特異的器官為材料篩選生物合成能力強的細胞株

Wayner等用檸檬葉、雞眼藤的培養(yǎng)物，經過篩選細胞株系，其次生代謝物是該植物完整植株的10倍。Zenk從長春花的培養(yǎng)物中，篩選出高產細胞株系，其生產根堿和阿瑪堿的總量，比親本植物高1.5倍，是親本植物根含量的5倍。②培養(yǎng)基中添加前體前體：有用次生代謝物的前驅物。煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質—煙堿酸加入，會增加煙堿的生成量。（前體物質的加入時間非常重要，應注意。）③培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑（激素）的作用植物生長調節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代謝物質的產生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加吲哚乙酸（IAA），能合成煙堿，而在含有2,4-D的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。2.2.3.3提高有用物質生產效率的技術因素④培養(yǎng)條件的影響光照、溫度等影響次生代謝在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。2.2.3.3提高有用物質生產效率的技術因素2.2.3.4細胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質的生產生物堿類黃酮類萜類菑體類蛋白質和多肽類①生物堿苦參的愈傷組織——苦參堿——降血壓、擴張血管，治冠心病。烏頭愈傷組織——烏頭堿——驅寒、散風、通經、止痛長春花愈傷組織——長春花堿——治白血病高效藥喜樹葉愈傷組織——喜樹堿——抗腫瘤黃連愈傷組織——小蘗堿（黃連素的主要成分）——抗菌消炎②萜類物質利用人參愈傷組織培養(yǎng)生產皂苷已進入工廠化生產。紫杉醇③醌類物質利用紫草、決明等愈傷組織培養(yǎng)，生產具有抗細菌活性的醌類物質。④蛋白質商品胰島素多數從動物的胰臟提取，但價格昂貴。從苦瓜離體培養(yǎng)物種可提取胰島素。SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶⑤類黃酮類：銀杏黃酮、花青素、查爾酮⑥菑體類：VD、激素、強心苷2.2.3.4若干有用物質的生產2.2.3.5存在問題

植物細胞培養(yǎng)生產有用物質盡管有種種優(yōu)點，但與微生物培養(yǎng)比還存在許多問題。生長速度較慢，通常完成一次生產周期需4~5周才能完成；而微生物的工業(yè)發(fā)酵只需幾天就可完成發(fā)酵全過程。植物細胞培養(yǎng)生產次生代謝物的總量一般比植物本身低，這主要是由于大多數離體培養(yǎng)細胞不能合成和積累所期望的化合物，當然也有些細胞株系產量高，這與微生物大不相同。2.2.3.5存在問題生產技術上還存在一些問題。培養(yǎng)過程需要復雜的培養(yǎng)基及附加物，且易受細菌、真菌的污染；次生物的產量不甚穩(wěn)定，成本較高等。2.2.3.5存在問題2.3植物非試管克隆技術TechniqueofEfficient&RapidNon-tubePlantCloning該技術是基于一個集溫度、濕度、光照、二氧化碳濃度、蒸發(fā)系數、營養(yǎng)液濃度等為一體的傳感器（智能葉片），通過計算機控制系統為植物的離體材料創(chuàng)造最佳的生根環(huán)境，并采用無土栽培及技術，實現苗木快速繁殖的一項高新技術。2植物細胞工程基本流程：插床設置（苗床或營養(yǎng)袋）→鋪設基質→插穗來源→插穗規(guī)格（硬枝或綠枝）扦插專用藥劑處理（藥劑型號）→扦插生產周期安排→插后智能葉片管理(T、R、光照、殺菌、補充營養(yǎng)液)→育苗生根成活→煉苗移栽→定植大田或苗圃繼續(xù)培養(yǎng)非試管繁殖與組培的區(qū)別非試管繁殖組培培養(yǎng)地點試管內大田內成活率移栽成活率低移栽成活率高成本投入成本高投入成本低操作操作復雜操作簡易品種范圍快繁品種范圍窄繁品種范圍廣非試管繁殖與傳統營養(yǎng)繁殖的區(qū)別非試管繁殖傳統營養(yǎng)繁殖季節(jié)限制不受季節(jié)限制受季節(jié)限制集約化程度土地使用率高，有高度的集約化與規(guī)模化土地使用率低，集約化與規(guī)模化不高品種限制品種限制不大，傳統扦插品種限制大插穗需求量對插穗需求量小傳統扦插對插穗需求量大操作管理與勞動投入有優(yōu)勢無優(yōu)勢根系發(fā)達，成活率高不發(fā)達，成活率較低智能葉片智能模擬計算機豆腐菜（馬鞭草科）桂花（木樨科）葡萄（葡萄科）松（松科）2.4植物原生質體制備與融合幾個概念：什么是原生質體：？原生質體制備：將旺盛生長的植物細胞起來，懸浮在含滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中，加入適量的細胞壁水解酶，在一定條件下作用一段時間，使細胞壁破壞。除去細胞壁碎片、未作用的細胞等，即得。原生質體培養(yǎng)是將植物原生質體在一定條件下培養(yǎng)，經過細胞壁再生而形成細胞，再分裂成細胞團的過程。2植物細胞工程植物原生質體的特點（與植物細胞比）：仍然具細胞全能性：？（學生總結）吸收能力增強→利于….?（學生總結）分泌能力增強→利于….?（學生總結）穩(wěn)定性較差→不利于….?（學生總結）解決？原生質體融合，即體細胞雜交。用人工的方法，把分離的不同品種或不同種的原生質體誘導成融合細胞，再經離體培養(yǎng)誘導分化和再生完整植株的整個過程。若取材為體細胞，則成為體細胞雜交。原生質體制備和培養(yǎng)是原生質體融合的先導技術2.4.1基本程序：原生質體制備（材料的選擇、酶的使用、滲透壓的調控、原生質體的收集與純化、原生質體活力的測定）→原生質體融合（自發(fā)融合、誘導融合）→雜種細胞選擇→雜種細胞培養(yǎng)→由雜種組織再生植株→雜種或胞質雜種植株的鑒定2.4植物原生質體制備與融合電融合法：不存在對細胞的毒害問題；二是融合效率高；三是融合技術操作簡便。PEG誘導融合法：融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。雜種細胞選擇設計一個選擇程序，使在某種條件下只有雜種細胞生長，而任一親本卻不能在此條件下生長，或生長速度緩慢、或中途夭折借助于精巧的顯微操作技術將融合體和雜種細胞直接挑選出來進行單獨培養(yǎng)雜種細胞的選擇系統1、外觀選擇·互補選擇·熒光標記選擇2．體細胞雜種的鑒定2.4植物原生質體制備與融合鑒定：通過雜種植株和親本植株的形態(tài)學特征來鑒定細胞學鑒定：雜種和親本的核型分析生化鑒定：雜種和親本的同工酶譜分析分子生物學的方法：RFLP鑒定、RAPD標記鑒定雜種植株和親本植株的其它特性2.4植物原生質體制備與融合2.4.2細胞融合的意義克服遠緣雜交不親和性，為廣泛重組遺傳物質開辟新途徑(如野生種的有效利用等）

可縮短育種年限利用細胞融合技術轉移細胞器（如葉綠體、線粒體等）及目的基因等。

2.4植物原生質體制備與融合2.５人工種子（artificialseeds）的研制2.５.1合成種子（syntheticseeds）或體細胞種子（somaticseeds）任何一種繁殖體，無論是在涂膜膠囊中包裹的、裸露的或經過干燥的，只要能夠發(fā)育成完整的植株，均可稱之為人工種子。2植物細胞工程2.5.2優(yōu)點：2.5.2.1在無性繁殖植物中，有可能建立一種高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品種的種性，又可以使之具有實生苗的復壯效應；2.5.2.2可以對優(yōu)異雜種種子不通過有性制種而快速獲得大量種子，特別是對于那些制種困難的植物更具有重要的實用意義；

·2.５人工種子的研制2.5.2.3對于一些不能正常產生種子的特殊植物材料如三倍體、非整倍體、基因工程植物等，有可能通過人工種子在短期內加大繁殖應用；2.5.2.4與田間制種相比，可以節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實現工廠化生產，同時還避免了種子攜帶病原菌的危險；2.5.2.5與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實現機械化操作，同時還便于儲藏和運輸。2.５人工種子的研制

2.5.3人工種子包被繁殖體的預處理（脫水干燥和強制休眠）→繁殖體的包埋(海藻酸鈉作包埋介質)→貯存與萌發(fā)2.５人工種子的研制2.5.4人工種子的發(fā)展和應用前景2.5.4.1微器官人工種子可能最先用于無性繁殖植物2.5.4.2人工種子可用于天然種子繁殖后代群體變異大的植物2.5.4.3以體細胞胚為繁殖體應用的可能性及需要注意的問題2.５人工種子的研制小結：植物細胞工程的應用快速繁殖：一片樹葉能變一座森林一年內可從一個蘭花莖尖繁殖出400萬株遺傳性狀均一的健康植株；花葉芋：常規(guī)繁殖：幾倍——幾十倍組培繁殖：幾萬——數百萬倍月季、菊花、牡丹、山茶等。植物育種胚培養(yǎng)：對遠緣雜交后雜種胚早期敗育的雜種植物進行胚培養(yǎng)，得到遠緣雜種：如山茶花、百合和鳶尾等許多花卉。煙草與大豆、煙草與天仙子、矮牽牛與小花矮牽牛、番茄與矮牽牛都得到了雜種植株。單倍體育種：花粉培養(yǎng)，如在矮牽牛的育種中已應用。芽變：如蘭花；綠色菊花花瓣培養(yǎng)——開紫花的植株；玉簪嵌合體培養(yǎng)——金色斑點兼綠色斑點的植株；百合——四倍體：花大早花。體細胞突變體篩選：在組織培養(yǎng)過程中，植物的體細胞會發(fā)生各種各樣的變異。利用植物細胞的全能性，可以將突變細胞培養(yǎng)成完整的植株，從而豐富植物的遺傳變異，選育出新的品種和類型。離體誘變育種：可采用愈傷組織誘變、花粉培養(yǎng)等多種方法，來進行花卉育種。體細胞雜交和植物基因工程：如番茄與馬鈴薯的細胞融合。輻射育種培育無病毒苗(脫毒苗）脫毒花卉：去病毒后，植株生長勢強，花朵變大，色澤鮮艷，抗逆能力提高，產花數量上升。預計在21世紀，這一技術的應用將更為廣泛。如：蘭花、大麗花、水仙、天竺葵菊花等。脫毒馬鈴薯：增產40-200%(2000-2500kg/畝)。紅薯：增產30%以上。草莓：增產500-1000千克/畝植物種質保存用組織培養(yǎng)方法保存愈傷組織、胚狀體、莖尖等組織：可節(jié)省大量人力和物力。也不會受自然環(huán)境的變化和病蟲危害而流失。保存800個品種的葡萄種質需占地15畝，維持費用也十分昂貴。用試管保存，在溫度9℃以下，植株便暫停生長，每年只需換轉1次。8OO個葡萄品種，每個品種重復6個，只需1平方米場所。如有需要，隨時可按極快速度再復制出來。有的在液氮（-196℃）中保存。P1772.6植物細胞工程研究進展

（學生綜述）3動物細胞工程3.1動物細胞工程概述3.2動物細胞工程的主要技術及其實踐意義單克隆抗體技術細胞核移植與動物克隆染色體轉移干細胞研究3.3動物細胞工程研究進展與應用3.1動物細胞工程概述3.1.1動物細胞特性3.1.1.1動物細胞與植物細胞比較3.1.1.2動物細胞在活體內的特性動物細胞在胚胎期即已高度分化，而且這種分化是不可逆轉的，

·活體內的動物細胞按照分裂能力可以分為三大類：

第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細胞；

第二類細胞群是永久失去分裂能力的細胞；

第三類是靜止細胞群，即所謂的G0細胞。3動物細胞工程3.1.2動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境與營養(yǎng)要求3.1.2.1動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求溫度pH溶氧及氣體環(huán)境滲透壓3.1動物細胞工程概述3.1.2.1動物細胞的營養(yǎng)需求天然培養(yǎng)基其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果好；缺點是成分復雜、個體差異大、來源有限。

·天然培養(yǎng)基的種類主要包括生物性體液（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）、水解乳蛋白等。3.1.2動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境與營養(yǎng)要求合成培養(yǎng)基·合成培養(yǎng)基是根據天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質對細胞體內生存環(huán)境中已知物質在體外人工條件的模擬，經過反復試驗篩選、強化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。

·合成培養(yǎng)基的優(yōu)點：既能給細胞提供一個近似于體內的生存環(huán)境，又便于控制和提供標準化體外生存環(huán)境。

·合成培養(yǎng)基的主要成分：氨基酸、維生素、糖類、無機離子和其它輔助成分。3.1.2.1動物細胞的營養(yǎng)需求3.2動物細胞工程的主要技術及其實踐意義3.2.1單克隆抗體技術路線單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology)。3動物細胞工程技術路線抗體的檢測與雜交瘤選擇單克隆抗體的大量生產單克隆抗體的鑒定3.2.1單克隆抗體技術路線應用廣泛地由于臨床醫(yī)學的疾病診斷（高度的特異性與靈敏性）。生產各種免疫疫苗（降低生產成本，增加了疫苗的安全性

）某些腫瘤的治療廣泛用于各種基礎醫(yī)學研究3.2.2細胞核移植與動物克隆細胞核移植技術：是一種利用顯微操作技術將一種動物的細胞