《青藏高原的細(xì)菌耐藥性調(diào)查報(bào)告（論文）》

青藏高原的細(xì)菌耐藥性調(diào)查TOC\o\u1前言 51.1研究背景 51.2殘留抗生素的來(lái)源及危害 61.3細(xì)菌耐藥性的形成機(jī)制 62巴氏桿菌與土壤微生物的相關(guān)實(shí)驗(yàn) 92.1動(dòng)物體巴氏桿菌 92.2土壤微生物 92.3多殺性巴氏桿菌和土壤微生物的相關(guān)研究方法 93巴氏桿菌在土壤微生物的作用下形成的特性及結(jié)果 123.1多殺性巴氏桿菌 123.2土壤微生物 14結(jié)論 17參考文獻(xiàn) -1-致謝 -3-1前言1.1研究背景巴氏桿菌病是一種非常明顯的傳染病，通過(guò)多殺性巴氏桿菌使大部分家畜、家禽、鳥類、野生動(dòng)物等之間傳播，甚至感染人類傳染病,主要在青海地區(qū)牛羊出血性敗血癥、豬肺疾病、性萎縮性鼻炎豬和家禽牲畜和家禽的急性或慢性傳染病如霍亂、兔巴氏桿菌疾病對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了很大的損失。掌握青藏高原動(dòng)物巴氏桿菌疾病發(fā)病率提供科學(xué)依據(jù)將來(lái)控制疾病,研究人員在2008-2009年的10個(gè)縣(市)青海牦牛、藏羊、豬、雞、兔巴氏桿菌病病原體在傳統(tǒng)的分離和鑒定,結(jié)果表明,野生菌株的應(yīng)變和質(zhì)量控制有一定的生化差異,野生菌株耐藥率較高,和質(zhì)量控制菌株無(wú)耐藥性。還發(fā)現(xiàn)復(fù)合巴氏桿菌是青藏高原牦牛出血性敗血癥的病原體，但其致病因素和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。巴氏桿菌是條件致病菌的一種。一旦由于各種原因使其毒力增加或動(dòng)物抵抗力降低，就會(huì)通過(guò)內(nèi)源性傳播引起巴氏桿菌的發(fā)生和流行。由于青海省大部分疫區(qū)地理環(huán)境惡劣、交通不便，部分接受過(guò)短期培訓(xùn)的民間獸醫(yī)或牧民將開展疫情防控工作。在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫時(shí)，經(jīng)常會(huì)射出“飛針”，這可能會(huì)導(dǎo)致防疫工作出現(xiàn)漏洞。此外，受疫情影響的地區(qū)在全省前幾日的雨雪過(guò)程中暴發(fā)疫情。這些因素可能是該疾病的主要原因。從動(dòng)物細(xì)菌分析完后繼續(xù)開始另一方面的研究進(jìn)程。我們研究人員收集了5種15厘米的土壤類型(栗鈣土、山地草甸土、黑鈣土土壤，不同顏色沙漠土壤)都是通過(guò)青藏高原層層篩選得來(lái)，主要通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)手段，分析土壤的主要體系結(jié)構(gòu)以及細(xì)菌群落的特征，和分析之間的關(guān)系基于土壤結(jié)構(gòu)和土壤細(xì)菌群落的多樣性的因素。結(jié)果表明，有機(jī)碳和總氮含量在土壤類型排名如下:栗鈣土大于山地草甸土大于黑鈣土土壤大于，灰色的沙漠土壤大于棕灰色的土壤，也沒(méi)有樣品的高度之間的相關(guān)性情節(jié)和土壤養(yǎng)分的積累。微生物的生長(zhǎng)，是通過(guò)很多的因素構(gòu)成的。比如說(shuō)必須具備一定的營(yíng)養(yǎng)含量，一定的空氣，水分。其次還應(yīng)該有合適的滲透壓，適合的酸堿度和溫度等等條件。但是這種情況是微生物非常喜歡的聲場(chǎng)環(huán)境，不僅有著非常多的種類而且數(shù)量也非常的驚人，因此土壤環(huán)境往往是微生物最佳的發(fā)育環(huán)境。由于土壤的不同機(jī)質(zhì)、水分等要素也會(huì)有不同的區(qū)別從而劃分出不同的關(guān)系。所以根據(jù)這種不同的關(guān)系細(xì)菌微生物等也會(huì)隨之產(chǎn)生不同的變化規(guī)律，例如細(xì)菌大于放線菌，霉菌大于酵母菌，這種類似遞減的變化規(guī)律都可以反映出微生物的不同新陳代謝所需要土壤的種類和要需求，使土壤具有豐富的肥力，后期采用剛剛提到的高通量測(cè)序技術(shù)為土壤環(huán)境體系作出變化規(guī)律和需求的總結(jié)，達(dá)到一定程度上的優(yōu)化和持續(xù)性發(fā)展，從而充分的體現(xiàn)出本研究課題可行并具有實(shí)質(zhì)性的意義。1.2殘留抗生素的來(lái)源及危害當(dāng)和農(nóng)用或醫(yī)用抗生素使用不當(dāng)或處理不規(guī)范時(shí)導(dǎo)致大自然環(huán)境里的抗生素殘留，不同的細(xì)菌感染可以導(dǎo)致相同的疾病，也就是說(shuō)，相同的疾病可能來(lái)自不同的細(xì)菌感染。因此，醫(yī)生必須在開處方之前進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，確認(rèn)患者感染的細(xì)菌類型，然后確定相應(yīng)的處方。在我國(guó)的臨床治療中，只有35%的醫(yī)生僅根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為患者開處方，只有47%的醫(yī)生在服藥前進(jìn)行相關(guān)篩查，而5%的處方是根據(jù)患者的需要開處方的。在一項(xiàng)針對(duì)性調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)在7278例病例中，有5193例接受了藥物治療，其中只有134例在給藥前在感染部位進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)。正常狀況下，細(xì)菌互相制約，以維持一個(gè)平衡的共生狀態(tài)。人體是可以適應(yīng)這種情況的，不會(huì)生病。抗生素長(zhǎng)期使用，更易使原本并不致病的微生物大量增殖，敏感的細(xì)菌被抑制，在敏感的細(xì)菌（例如，抗抗生素的細(xì)菌和霉菌）中繁殖。引起人類感染，即“二重感染”，由金黃色葡萄球菌和白色念珠菌引起的鵝口瘡的偽膜性腸炎的常見(jiàn)原因。嬰兒、老年人、體弱者等，因抵抗力低下，長(zhǎng)期、大量使用廣譜抗菌藥物時(shí)，導(dǎo)致人體發(fā)生感染，臨床稱之為條件致病菌引起的感染。臨床常見(jiàn)的二重感染包括真菌感染（如念珠菌性口腔炎）和對(duì)該抗生素耐藥菌株逐漸增殖感染如霉菌性肺炎、梭狀芽胞桿菌腸炎、尿路感染、白色念珠菌陰道炎，以及霉菌性腸炎等。1.3細(xì)菌耐藥性的形成機(jī)制一般我們把細(xì)菌對(duì)人為的抗細(xì)菌藥物等產(chǎn)生的耐受強(qiáng)度稱之為細(xì)菌的耐藥性又叫抗藥性。根據(jù)產(chǎn)生的原因，耐藥性可分為獲得性耐藥和自然耐藥。一旦發(fā)生，就意味著藥物的治療效果會(huì)大大降低。有一種次生代謝產(chǎn)物值得研究，他是人們最常用的一種天然抗生素，從細(xì)菌身上發(fā)現(xiàn)得來(lái)，讓自身受保護(hù)不讓別的微生物對(duì)自己產(chǎn)生影響，所以這種次生代謝產(chǎn)物常常被人們用來(lái)解決需要處理的微生物。當(dāng)微生物接觸到抗菌藥物時(shí)，一樣的也會(huì)通過(guò)各種手段途徑去不受到抗菌藥物的作用，從而不被抗菌劑通過(guò)改變自身代謝途徑而殺死。例如，金黃色葡萄球菌和淋球菌產(chǎn)生乳酸內(nèi)酰胺，并且對(duì)乳酸內(nèi)酰胺抗生素有耐藥性。獲得性耐藥可以通過(guò)質(zhì)粒遺傳，質(zhì)粒將耐藥基因轉(zhuǎn)移到染色體上，形成內(nèi)在耐藥，也可以通過(guò)不再接觸抗菌藥物而消除獲得性耐藥。細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成代代相傳不會(huì)改變，所以由細(xì)菌的染色體基因決定的天然耐藥一般不會(huì)改變，然后其具體機(jī)制可分為以下5類:滅活酶的產(chǎn)生、抗菌藥物作用靶點(diǎn)的變化、細(xì)菌外膜通透性的變化、活性流出系統(tǒng)的影響、細(xì)菌生物被膜的形成，下面開始詳細(xì)展開介紹。耐藥性通常被分為5種每一種都非常重要，其中最重要機(jī)制之一是產(chǎn)生滅活酶，這是細(xì)菌通過(guò)滅活的抗菌藥物從而讓這種藥物失活，從細(xì)菌進(jìn)入之前就已經(jīng)被產(chǎn)生的滅活酶所解決，達(dá)到一定程度的耐藥性。β-內(nèi)酰胺酶通過(guò)不同的染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)來(lái)表達(dá)出自己的基因體系。經(jīng)過(guò)β-內(nèi)酰胺類的β-內(nèi)酰胺環(huán)的執(zhí)行過(guò)程讓內(nèi)酰胺環(huán)的抗菌作用崩解，讓抗生素的抗菌作用除去。隨著新型抗生素在臨床中的應(yīng)用，鼻內(nèi)酰胺酶的種類迅速增加，其作用機(jī)制在β-內(nèi)酰胺類抗生素一章中進(jìn)行了闡述。氨基苷類抗生素鈍化酶:氨基苷在暴露于抗生素后鈍化酶失去后者抗菌效果,常見(jiàn)的氨基苷鈍化酶乙酰化酶、腺苷磷酸化酶,這些酶基因的質(zhì)粒介導(dǎo)的合成,可以腺苷乙酰和?；柞；c氨基或羥基氨基苷,氨基酸的結(jié)構(gòu)變化類失去抗菌活性;其它酶:細(xì)菌能產(chǎn)生氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶滅活氯霉素;生產(chǎn)酯酶滅活大環(huán)內(nèi)酯類抗生素;金黃色葡萄球菌產(chǎn)生核糖轉(zhuǎn)移酶使林可霉素失活。抗菌作用失敗的時(shí)候一般是靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)膜里發(fā)生了位移，不僅抗生素?zé)o法對(duì)接而且作用性大大降低，調(diào)查研究青霉素就是通過(guò)這種方式使肺炎鏈球菌形成的良好耐藥性，經(jīng)過(guò)抗生素和細(xì)菌的碰撞，產(chǎn)生原敏感菌所不存在的新靶蛋白，使抗生素?zé)o法與新靶蛋白結(jié)合，產(chǎn)生高耐藥性。如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌比金黃色葡萄球菌更敏感青霉素結(jié)合蛋白組成青霉素結(jié)合蛋白；隨著目標(biāo)蛋白數(shù)量的增加，細(xì)菌還是能通過(guò)蛋白數(shù)量的增加達(dá)到穩(wěn)定繁殖發(fā)育，因此讓抗菌藥物形成耐藥性。調(diào)查研究，腸球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類的耐藥非但可以產(chǎn)生生β-內(nèi)酰胺酶，還能夠供給青霉素結(jié)合蛋白的量，然后還降低青霉素與抗生素的結(jié)合親和力，從而有了多重的耐藥機(jī)制。許多廣譜抗生素對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)作用或作用微弱。主要原因是抗菌藥物不能進(jìn)入銅綠假單胞菌，從而發(fā)生自然耐藥。當(dāng)細(xì)菌接觸抗生素時(shí)，隨著改變通道蛋白的特性和數(shù)量來(lái)減少細(xì)胞膜的通透性，然后得到一種性耐藥。在一般情形下外膜通道蛋白OmpF以及OmpC合成特異性的跨膜通道，讓抗生素不同藥物分子結(jié)合細(xì)菌，然后不斷暴露于抗生素細(xì)菌后，應(yīng)變突變，得到OmpF蛋白結(jié)構(gòu)基因失活和阻礙，從而使OmpF通道蛋白破壞，因此β內(nèi)酰胺、喹諾酮藥物延伸到細(xì)菌內(nèi)部的降低。在銅綠假單胞菌中，也有一個(gè)特異的OprD蛋白通道，通過(guò)暈粗亞胺培南通道進(jìn)入細(xì)菌，當(dāng)這個(gè)蛋白通道丟失時(shí)后也產(chǎn)生特異的耐藥性。隨著一些細(xì)菌可以將藥物泵入體內(nèi)，將細(xì)菌排出體外。這種泵需要能量，所以被稱為主動(dòng)流出系統(tǒng)。由于這一活性流出系統(tǒng)的存在及其抗菌選擇性的特點(diǎn)，表皮葡萄球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和彎曲桿菌都可以對(duì)、大環(huán)內(nèi)酯類四環(huán)素、氟喹諾酮類、氯霉素和β-內(nèi)酰胺類產(chǎn)生多重耐藥性。細(xì)菌的流出系統(tǒng)由蛋白質(zhì)組成，主要是膜蛋白。這些蛋白質(zhì)有四個(gè)家族:MF家族；RND家族；ABC家庭以及SMR家族。流出系統(tǒng)由三種蛋白組成，即附加蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外膜蛋白。外膜蛋白類似于位于外膜或細(xì)胞壁的通道蛋白，是藥物從細(xì)胞中泵出的外膜通道。附加蛋白作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與外膜蛋白之間的橋梁，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于細(xì)胞漿膜中，漿膜起著泵的作用。當(dāng)細(xì)菌以生物膜的形式存在時(shí)，耐藥性明顯增強(qiáng)，抗生素的應(yīng)用不僅不能有效去除BF，還會(huì)誘發(fā)耐藥性的出現(xiàn)。還有一種滲透限制為生物膜中許多的胞外多糖產(chǎn)生分子屏障和電荷屏障，阻礙或延緩抗生素的滲透。此外，細(xì)菌在生物膜中分泌的某些水解酶濃度較高，可促進(jìn)進(jìn)入生物膜的抗生素失活。營(yíng)養(yǎng)限制:生物膜的流動(dòng)性較低，生物膜深層的氧和營(yíng)養(yǎng)濃度較低。這種狀態(tài)下細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝是緩慢的。然而，大多數(shù)抗生素對(duì)這種狀態(tài)的細(xì)菌并不敏感，所以抗生素只能破壞外層的細(xì)菌并不可以從根本的解決感染，一旦停止用藥又會(huì)馬上復(fù)發(fā)。

2巴氏桿菌與土壤微生物的相關(guān)實(shí)驗(yàn)2.1動(dòng)物體巴氏桿菌2.1.1實(shí)驗(yàn)樣品：本次無(wú)菌取樣的對(duì)象，都是從病死的動(dòng)物身上獲取的。為了區(qū)別巴氏桿菌和地域的聯(lián)系，本次的取樣對(duì)象，皆為青藏高原的高原動(dòng)物的內(nèi)臟器官（也即心肝脾肺腎），如牦牛（馬尾牛）、藏羊（藏系羊）等。2.1.2實(shí)驗(yàn)所需溶液試劑：血瓊脂平板、血瓊脂斜面和5%胎牛血清；肉湯培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、細(xì)菌生化反應(yīng)培養(yǎng)基；以及上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司專業(yè)生產(chǎn)(供應(yīng))的各種藥敏紙片。2.2土壤微生物2.2.1實(shí)驗(yàn)樣品：筆者這次選取的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，是以包括唐古拉山在內(nèi)的，十余個(gè)具有原生態(tài)意義的土壤，作為采集實(shí)驗(yàn)樣品。該樣品共11份，按五點(diǎn)采樣法，對(duì)30cm內(nèi)的垂直深度進(jìn)行土壤取樣，并均勻混合后，存入滅菌包裝盒。2.2.2實(shí)驗(yàn)所需溶液試劑：高氏1號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉(20g)，KNO3(1g)，NaCl(0.5g)，K2HPO4·3H2O(0.5g)，MgSO4·7H2O(0.5g)，F(xiàn)eSO4·7H2O(0.01g)，H2O(1L)，瓊脂(8g)，pH7.4～7.6．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏(3g)，蛋白胨(10g)，NaCl(5g)，H2O(1L)，瓊脂(8g)，pH7．4～7．6．LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨(10g)，酵母提取物(5g)，NaCl(10g)，H2O(1L)，中性TSBY培養(yǎng)基:胰胨豆湯粉(30g)，蔗糖(340g)，酵母提取物(5g)，H2O(1L)．YEME培養(yǎng)基:酵母提取物(3g)，蛋白胨(5g)，麥芽提取物(3g)，葡萄糖(10g)，蔗糖(340g),H2O(1L)，高壓滅菌后加入MgCl2·6H2O(2.5mol·L－1)。萘啶酮酸:丙酮溶解，制成濃度為5mg·mL－1的母液，終濃度為20μg·mL－1．Tris溶液(20mmol·L－1pH8.0):稱取Tris固體，用去離子水溶解或滅菌蒸餾水溶解，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至所需值．溶菌酶(50mg·mL－1):用20mmol·L－1pH8.0Tris溶液配制．2.3多殺性巴氏桿菌和土壤微生物的相關(guān)研究方法2.3.1多殺性巴氏桿菌發(fā)病情況的調(diào)查：筆者這次分別走訪了班瑪、久治、達(dá)日等縣，并在此期間，和各鄉(xiāng)縣，對(duì)于牲畜有過(guò)了解的獸醫(yī)站獸醫(yī)，以及部分工作人員進(jìn)行了溝通，以期能夠獲取關(guān)于患病的牲畜，是否具有家族遺傳病史，以及流行病等問(wèn)題。病料的采集及病死動(dòng)物剖檢：本次對(duì)于樣品的采集，都是筆者在走訪縣鄉(xiāng)時(shí)，采集到的，已病死的牲畜內(nèi)臟，并依次做好了編號(hào)(Q1～9)便于后期分辨。病料的觸片、染色及鏡檢：依次將各類牲畜的各種內(nèi)臟制作成觸片或印片，分別進(jìn)行革蘭和美藍(lán)染色，然后鏡檢。野生菌的分離、純化：分別剪取各牲畜的各種內(nèi)部組織病料，接種于5%胎牛血清肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，再在鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上純化，置4℃冰箱保存以做備用。生化試驗(yàn)：將純化后的11株野生菌和C47－8分別接種到生化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)兩到三天判定其結(jié)果。同時(shí)分別用接種環(huán)勾取2環(huán)滅菌純化水蘸于氧化酶試紙上，再勾取少許純化后的細(xì)菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，一分鐘內(nèi)判定結(jié)果。動(dòng)物致病性試驗(yàn)：將純化后的11株野生菌(Q1～11)及C47－8分別接種到鮮血瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h制成菌懸液，并與麥?zhǔn)蠞峁苓M(jìn)行比濁，選取濃度3.0×109個(gè)/mL的菌懸液分別腹腔注射12只小白鼠，0.5mL/只。同時(shí)應(yīng)用0.22μm細(xì)菌濾器分別對(duì)上述11株菌懸液過(guò)濾，各取濾液腹腔注射12只小白鼠，每只0.5mL，作為對(duì)照。藥敏試驗(yàn):分別用滅菌棉拭子蘸取動(dòng)物致病性試驗(yàn)中選取的濃度為3.0×109個(gè)/mL的菌懸液均勻涂布于MH平板培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基厚度為4mm)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)[9]。2.3.2土壤微生物鏈霉菌分離：在超凈工作臺(tái)中取土樣0.1g，置于處理過(guò)的，裝有0.9mLLB液體培養(yǎng)基的離心管中，100r·min－1振蕩半小時(shí);取懸液進(jìn)行梯度稀釋,稀釋倍數(shù)為10/3，將稀釋的土壤懸液200μL涂布到高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上,靜置半小時(shí)后倒置培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)．將單菌落分別移種到高氏1號(hào)瓊脂平板上劃線分離，純化好的菌種用20%甘油制成菌懸液,放入凍存管于－20℃冰箱保藏備用。液體培養(yǎng):將凍存的菌懸液分別滴加到帶有萘啶酮酸(20μg·mL－1)的液體培養(yǎng)基中,于150～200r·min－1、30℃下?lián)u床培養(yǎng),直至培養(yǎng)基混濁。基因組DNA提取:菌種DNA用天根生化科技(北京)有限公司是的DNA提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行提取。借助PCR擴(kuò)增法對(duì)DNA序列的測(cè)定及分析:選擇通用引物27F和1492Ｒ［5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’和5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’］．PCR反應(yīng)體系(25μL):2.5μL10×PCＲ，3μL25mmol·L－1MgCl2，0.5μL10mmol·L－1dNTP，2μL10μmol·L－1引物，1μL0.2mol·L－1海藻糖，0.2μL2U·μL－1TaqDNA聚合酶，ddH2O13.8μL。待PCR擴(kuò)增完畢后，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)后即可進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用基于局部比對(duì)算法的搜索工具，從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（GenBank）中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16SrDNA序列用，CLUSTALX做多序列比對(duì)分析，用MEGA4.0軟件，采用鄰接法，進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。拮抗性試驗(yàn):采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基斜面，37℃下培養(yǎng)三到四天時(shí)間，待細(xì)菌長(zhǎng)好后加入2mL無(wú)菌水制備靶標(biāo)菌懸液待用．采用涂抹接種法將供試鏈霉菌接入高氏1號(hào)瓊脂平皿，涂勻，30℃培養(yǎng)一周，在無(wú)菌條件下用8mm打孔器，將鏈霉菌切成圓形菌餅制備鏈霉菌拮抗性篩選瓊脂塊．分別將3株供試靶標(biāo)菌懸液與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合后制成平板，將已制備好的放線菌瓊脂塊置于已接好靶標(biāo)菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)三天時(shí)間，觀察靶標(biāo)菌生長(zhǎng)情況及透明度，測(cè)量拮抗圈直徑。

3巴氏桿菌在土壤微生物的作用下形成的特性及結(jié)果3.1多殺性巴氏桿菌3.1.1病理剖檢結(jié)果:牦牛、豬、藏羊、家兔均有少量皮下出血。部分牦牛、豬、藏羊肝表面有壞死灶，肝腫大易碎。淋巴結(jié)水腫以及肺表面有肝臟改變面積，呈大理石樣，有纖維素性胸膜炎改變；冠狀脂肪，內(nèi)外心包膜出血明顯，心包積水；咽喉、頸部、四肢等部位皮下浸潤(rùn)有漿液，偶有帶血，上呼吸道粘膜顯示卡他性粘膜炎。死雞肝表面有白色或黃色壞死灶；肺部侵蝕，表面大理石斑紋；肌性胃和腸出血明顯，冠狀脂肪和心臟內(nèi)外膜均有出血點(diǎn)或血點(diǎn)，出血最明顯的是十二指腸。3.1.2染色、病料觸片和顯微鏡檢查結(jié)果材料:革蘭氏染色和顯微鏡檢查進(jìn)行肝、肺、脾、腎和其他病材料標(biāo)呈現(xiàn)革蘭陰性、愚鈍兩端、單或雙方式排序、并與統(tǒng)一的形態(tài)可以看到小芽孢桿菌，顯微鏡下顯示兩極有大量強(qiáng)染色的小桿菌。3.1.3菌落形態(tài)及培養(yǎng)特點(diǎn):11株野生菌及c47-8株均在不溶血的血瓊脂培養(yǎng)基上形成蒼白、圓形、微隆起、半透明、潮濕、光滑、整齊、豐富的露珠樣菌落。在5%胎牛血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，肉湯渾濁均勻，連續(xù)培養(yǎng)4-6d后，液體變清，在管底形成粘稠物質(zhì)，振蕩后不分散，產(chǎn)生菌膜。3.1.4生化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表13.1.5致病性試驗(yàn)結(jié)果:試驗(yàn)組小鼠均于兩至三天內(nèi)死亡。尸檢發(fā)現(xiàn)，在心包和胸腔有漿液和纖維狀滲出物。腸出血尤其明顯;肝表面有淺白色壞死灶。收集必要器官，分離革蘭陰性桿菌，對(duì)照組小鼠在3天后后仍然健康。3.2土壤微生物3.2.1菌株培養(yǎng)特點(diǎn):從青藏高原帶來(lái)的10多種的樣品里通過(guò)中共分離剖析出鏈霉菌屬菌株151株，其中43隔離高30度培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基1號(hào)在7至15天的觀察記錄其襯底菌絲菌落形態(tài)、基內(nèi)菌絲、空中菌絲、顏色改變，能不能產(chǎn)生可溶性色素，栽培特點(diǎn)，如表2和圖1所示的結(jié)果。從結(jié)果可以看出，訓(xùn)練43隔離特性符合鏈霉菌屬的一般特征，即殖民地輻射、表面粗糙、干燥，覆蓋一層干粉的孢子，并結(jié)合培養(yǎng)基，不容易掌握，有鮮艷的顏色，正面和負(fù)面的菌落以及中央和邊緣不同的顏色種類，不同的顏色是刺激性氣味等。3.2.2菌株的分子生物學(xué)鑒定:對(duì)151株菌株中的43株進(jìn)行16SrDNA測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)，41株菌株與已知鏈霉菌的相似性均在百分之九十九以上，均確認(rèn)為鏈霉菌。結(jié)果如表3所示。3.2.3抗菌結(jié)果分析：從土壤中分離的151株鏈霉菌屬的青藏高原背景下，68株顯示抗菌活性,包括廣譜強(qiáng)敵對(duì)的菌株或某種細(xì)菌菌株具有較強(qiáng)的拮抗阻力,其中菌株耐所有三個(gè)指標(biāo)細(xì)菌占拮抗細(xì)菌總數(shù)的百分之60左右。在68株拮抗鏈霉菌中，分別有52株、54株和63株拮抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。由此可見(jiàn)，革蘭氏陰性菌分離的鏈霉菌明顯強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌的拮抗作用。

結(jié)論隨著一系列抗生素的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了耐藥性。細(xì)菌耐藥性繼續(xù)增加，藥物研究者和制造商還沒(méi)有生產(chǎn)出新的藥物來(lái)替代已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的抗生素。據(jù)歐洲疾病預(yù)防控制中心估計(jì)，每年可能有25000人死于與抗生素耐藥性有關(guān)的感染。近年來(lái)，由于臨床用藥不合理的現(xiàn)象不斷發(fā)生，細(xì)菌耐藥性呈上升趨勢(shì)，許多病原菌對(duì)抗生素有較強(qiáng)的耐藥性。醫(yī)院內(nèi)巴氏桿菌耐藥性呈上升趨勢(shì)，給醫(yī)院感染控制和臨床治療帶來(lái)了諸多問(wèn)題，因此關(guān)注病原菌的臨床分布特點(diǎn)和耐藥趨勢(shì)對(duì)臨床用藥具有重要意義。一些附著在上呼吸道和腸道的菌株可能在適當(dāng)條件下迅速繁殖，產(chǎn)生大量新的巴氏桿菌。當(dāng)這些細(xì)菌附著在附著的食物上時(shí)，細(xì)菌的繁殖和分泌會(huì)污染食物，對(duì)人體健康造成危害?，F(xiàn)在，全世界的人都被這個(gè)問(wèn)題困擾著。隨著巴氏桿菌對(duì)人體危害的日益嚴(yán)重，這些相關(guān)問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視。因此，有必要建立一種快速、超靈敏的檢測(cè)巴氏桿菌的方法。該檢測(cè)方法的建立將對(duì)它們之間的耐藥鄰域具有非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，以基于青藏高于為基礎(chǔ)對(duì)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行分析，可以為臨床有效防治提供科學(xué)依據(jù)，為更好地指導(dǎo)臨床合理使用抗生素。參考文獻(xiàn)[1]CHOTIANS．Isolation，identificationandserotypingofpasteurellamultocidaisolationfrompneumobiclungsofBovineandtheirsensitivetoseveralantibioties［J］．JurnalImuTernakdanVeterier，1997，2(3):198－203．[2]ARIASME，GONZALEZ-PEREZJA，GONZALEZ-VILAFJ，etal．Soilhealth-anewchallengeformicrobiologistsandchemists［J］．InternationalMicrobiology，2005，8(1):13－21．[3]TALBOTJM，BＲUNSTD，TAYLOＲJW，etal.EndemismandfunctionalconvergenceacrosstheNorthAmericansoilmycobiome［J］．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2014，111(17):6341－6346．[4]李晨華，張彩霞，唐立松，等．長(zhǎng)期施肥土壤微生物群落的剖面變化及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系［J］．微生物學(xué)報(bào)，2014，54(3):319－329．LICH，ZHANGCX，TANGLS，etalEffectoflongtermfertilizingregimeonsoilmicrobialdiversityandsoilproperty［J］．ActaMicrobiologicaSinica，2014，54(3):319－329．(inChinesewithEnglishabstract)[5]鄭燕，賈仲君．新一代高通量測(cè)序與穩(wěn)定性同位素