分析化學(xué) 高效液相色譜

分析化學(xué)高效液相色譜第一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日3-1概述

HPLC是60年代在GC和經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。GC柱效高，且能分離、定量，但有些熱穩(wěn)定性差，不易揮發(fā)的組分不能用GC直接分析，人們想到模仿GC，用細(xì)顆粒固定相，薄殼固定液，以增加柱效。模仿LC用液體作流動(dòng)相，在室溫下進(jìn)行，但阻力太大，液體流動(dòng)相難以通過，所以又想到加高壓泵，加快流動(dòng)相流速，這樣即增加了柱效，又加快了分析速度，也拓寬了應(yīng)用范圍，把柱子、高壓泵、檢測(cè)器配成儀器，就形成高效液相色譜儀。第二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

HPLC與LC的比較

LCHPLC柱徑1～2cm2～5mm顆粒150～200μm5～10μm壓力常壓高壓tR1～20h1h內(nèi)n2～50105/米用途初步分離高效分離、高靈敏度定量裝置非儀器化精密儀器，自動(dòng)化.智能化

HPLC優(yōu)點(diǎn)：柱效高分析時(shí)間短可定量?jī)x器分析第三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日HPLC與GC的比較

GCHPLC流動(dòng)相gl溫度高溫室溫組分易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好不受限制可測(cè)有機(jī)物20%75%～80%tR1～30min1～60min靈敏度10-12～10-14g/ml10-9～10-11g流出物不易收集易收集

HPLC優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用范圍廣，組分易回收第四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日GC與HPLC選擇：小分子——熱穩(wěn)定性好——GC大分子——熱穩(wěn)定性差——HPLCtR短GC優(yōu)點(diǎn)：g廉價(jià)靈敏度高第五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

二.

HPLC法的特點(diǎn)：1.高效分離n=105/米2.高速使用高壓泵，出峰時(shí)間幾分鐘到幾十分鐘3.高靈敏度檢測(cè)下限：10-9～10-13g（最小檢測(cè)量）4.自動(dòng)化程度高（儀器分析、電腦控制、色譜工作站）5.應(yīng)用范圍廣可測(cè)有機(jī)物75%～80%一.HPLC法的分類吸附色譜l—s離子交換色譜法尺寸排阻色譜法l—l正向色譜反向色譜第六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日二、高效液相色譜法的特點(diǎn)

featureofHPLC

特點(diǎn)：高壓、高效、高速、高靈敏度高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。第七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日分配系數(shù)K=組分在固定相中的濃度/組分在流動(dòng)相中的濃度

=CS/CM

分配系數(shù)的差異是所有色譜分離的實(shí)質(zhì)性原因3-2影響分離的因素

factorsinfluencedseparation第八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日1.影響分離的因素與提高柱效的途徑

在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即：H=A+Cu故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。第九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。第十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

2.流速流速大于0.5cm/s時(shí),H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。

3.固定相及分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。第十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

高效液相色譜儀由五大部分組成：高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢側(cè)系統(tǒng)記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析流程：流動(dòng)相1高壓泵進(jìn)樣器流動(dòng)相貯液槽壓力表流動(dòng)相2微機(jī)梯度洗脫裝置色譜柱餾分收集器檢測(cè)器第十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日儲(chǔ)液瓶分布器過濾2m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計(jì)注樣閥分離柱到檢測(cè)器HPLC儀器詳解第十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日第十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日第十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日一.高壓輸液系統(tǒng)

1.高壓輸液泵：恒壓泵（流量隨阻力變化重現(xiàn)性差）恒流泵（多用）：往復(fù)式注射式

作用：將流動(dòng)相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。性能：①有足夠的壓力②輸出流量恒定，可調(diào)③輸出壓力平穩(wěn)④泵室體積?、荼皿w抗腐蝕、耐酸馬達(dá)往復(fù)式拉動(dòng)密封溶劑球閥脈動(dòng)阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖第十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日2.

梯度洗脫裝置作用：將兩種或兩種以上溶劑按一定程序連續(xù)改變配比，以改變流動(dòng)相極性、離子強(qiáng)度、PH值、提高分離效率。低壓梯度洗脫（常壓混合，高壓進(jìn)柱，1個(gè)泵。）高壓梯度洗脫（高壓混合，高壓進(jìn)柱，2個(gè)泵。）貯液槽1貯液槽2貯液槽1貯液槽2梯度洗脫裝置程序控制高壓泵1高壓泵2混合室高壓泵梯度洗脫裝置進(jìn)柱進(jìn)柱低壓梯度洗脫高壓梯度洗脫不易改變流動(dòng)向配比,自動(dòng)化程度低隨時(shí)改變流動(dòng)向配比,自動(dòng)化程度高第十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日二.進(jìn)樣系統(tǒng)

注射進(jìn)樣：裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。六通閥進(jìn)樣：目前最常用，由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。

圖12-5六通閥進(jìn)樣示意圖a．載樣(樣品進(jìn)入定量管)b．倒閥(樣品導(dǎo)入色譜柱)1．定量管2．樣品進(jìn)入口3．流動(dòng)相進(jìn)口4．色譜柱1.載樣管第十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱第十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

三.分離系統(tǒng)：色譜柱不銹鋼直型分析：內(nèi)徑2～6mm長(zhǎng)10～30cm制備：內(nèi)徑10～25mm長(zhǎng)15～50cm恒溫器：電熱恒溫裝置（室溫～150℃）恒溫水浴類套（70℃以下）作用：保證分析時(shí)溫度恒定，否則對(duì)tR影響較大第二十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

四.檢測(cè)系統(tǒng)1.

紫外—可見光度檢測(cè)器：

①固定波長(zhǎng)：254nm，低壓汞燈。

②可調(diào)波長(zhǎng)：190～800mm，鎢燈，氘燈。

③光電二極管矩陣檢測(cè)器：190～700nm。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液第二十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日光電二極管矩陣檢測(cè)器特點(diǎn)：靈敏度高、分辨率好、方便、快速、準(zhǔn)確，可掃描得三維流出曲線紫外檢測(cè)器的應(yīng)用：

對(duì)紫外有吸收的組分，且吸光度與濃度成正比。

紫外檢測(cè)器的特點(diǎn)：靈敏度高最小檢測(cè)濃度10-9g/ml線性范圍寬對(duì)溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫應(yīng)用范圍廣第二十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日波長(zhǎng)可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖第二十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

2.熒光檢測(cè)器：多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器（濾光片）熒光分光檢測(cè)器（光柵分光）氘燈作激發(fā)光源，波長(zhǎng)范圍250～600nm

應(yīng)用：組分吸收一定波長(zhǎng)紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì)，且熒光強(qiáng)度與濃度成正比。特點(diǎn)：靈敏度更高檢測(cè)限10-12～10-13g/ml（靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)）選擇性好對(duì)溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫所需試樣量少，適于痕量分析應(yīng)用范圍廣

3、電化學(xué)檢測(cè)器電導(dǎo)、庫(kù)侖、極譜、安培、電位等檢測(cè)器。第二十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日一、液-固吸附色譜liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatograph三、離子交換色譜ion-exchange

chromatograph四、離子色譜ionchromatograph五、離子對(duì)色譜ion-pairchromatograph六、排阻色譜size-exclusionchromatograph七、親和色譜(AC)Affinity

chromatograph3-3主要分離類型與原理basicprincipleandmainseparatingtypes第二十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；第二十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日二、液-液分配色譜

liquid-liquidpartitionchromatography固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。第二十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日三、離子交換色譜

ion-exchangechromatography

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽(yáng)離子離子交換樹脂；

流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第二十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日四、離子色譜

ionchromatography

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。

第二十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日五、離子對(duì)色譜

ionpairchromatography

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；

陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；

反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+X-后；在兩相間分配。第三十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日六、排阻色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離第三十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日七、親和色譜(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。第三十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日一、液相色譜固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色譜流動(dòng)相mobilephaseofHPLC3-4液相色譜的固定相與流動(dòng)相stationaryphaseandmobilephaseofHPLC第三十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日一、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC

1.液-液分配及離子對(duì)分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；第三十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N第三十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

第三十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

2.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

第三十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日3.離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽(yáng)離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）第三十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日

4.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植?。第三十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日二、液相色譜的流動(dòng)相

mobilephasesofLC1.流動(dòng)相特性

（1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。第四十頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日2.流動(dòng)相類別

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。第四十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，2022年，8月28日3.流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：