基因工程原理章外源目的基因表達(dá)與調(diào)控

基因工程原理章外源目的基因表達(dá)與調(diào)控第1頁(yè)/共52頁(yè)目的基因載體受體細(xì)胞外源基因表達(dá)DNA重組載體第2頁(yè)/共52頁(yè)第六章外源目的基因表達(dá)與調(diào)控第3頁(yè)/共52頁(yè)第一節(jié)外源基因表達(dá)機(jī)制DNA轉(zhuǎn)錄翻譯ATCGAUCG43=64遺傳密碼氨基酸折疊密碼RNA蛋白質(zhì)第4頁(yè)/共52頁(yè)。第5頁(yè)/共52頁(yè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程啟動(dòng)子和調(diào)控序列——轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵原核生物啟動(dòng)子：lac、trp、λPR、λPl等一、外源基因的起始轉(zhuǎn)錄第6頁(yè)/共52頁(yè)第7頁(yè)/共52頁(yè)二、外源基因mRNA的有效翻譯起始密碼子：AUG是首選核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列AGGAGG：至少包含4個(gè)堿基SD與AUG之間距離為3-9個(gè)堿基翻譯起始區(qū)不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞無(wú)SD序列，但大多含共同序列：5’-CCA(G)CCAUGG-3’第8頁(yè)/共52頁(yè)（1）氨基酸活化和肽鏈的起始：AA+tRNA+ATP——AA-tRNA+AMP+PPi（2）肽鏈的起始：原核生物：30S+mRNA——+AA-tRNA——+50S真核生物：40S+AA-tRNA——+mRNA——+60S（3）肽鏈的延伸：肽基轉(zhuǎn)移酶（4）肽鏈的終止：終止密碼子(UAA、UAG、UGA)和終止因子（5）折疊和加工翻譯過(guò)程第9頁(yè)/共52頁(yè)氨酰tRNAaa＋tRNA+ATPaa-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRAN合成酶

氨基酸的活化第10頁(yè)/共52頁(yè)第11頁(yè)/共52頁(yè)B：延伸第12頁(yè)/共52頁(yè)C：終止第13頁(yè)/共52頁(yè)

DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域，在許多情況下，還包括促進(jìn)這一過(guò)程的調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。一、啟動(dòng)子（promoter)：第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件

特征：序列特異性：不同啟動(dòng)子對(duì)RNA聚合酶親和力不同方向性：5‘→3’位置特異性：位于調(diào)控基因的上游種屬特異性：親緣越近通用的可能性越大第14頁(yè)/共52頁(yè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)：通常是一個(gè)嘌呤(A或G)Pribnow框，又叫-10區(qū)：TATAATSextama框，又叫-35區(qū)：TTGACA間隔區(qū)（一）原核生物的啟動(dòng)子典型的原核啟動(dòng)子有四大要素：第15頁(yè)/共52頁(yè)TATAATTATAATTTGACAA/GTTGACAA/G第16頁(yè)/共52頁(yè)P(yáng)ribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列Sextamabox第17頁(yè)/共52頁(yè)rRNA基因啟動(dòng)子（Ⅰ型）：rRNAmRNA基因啟動(dòng)子（Ⅱ型）：mRNA、部分核內(nèi)小分子RNA（snRNA）tRNA基因啟動(dòng)子（Ⅲ型）：5SrRNA、tRNA、snRNA（二）真核生物的啟動(dòng)子第18頁(yè)/共52頁(yè)rRNA基因啟動(dòng)子（Ⅰ型）核心啟動(dòng)子（corepromoter）（-45—+20位核苷酸）上游調(diào)控元件（-170—-107位序列）（增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率）（單獨(dú)存在即可起始轉(zhuǎn)錄）第19頁(yè)/共52頁(yè)mRNA基因啟動(dòng)子（Ⅱ型）沒(méi)有廣泛的同源性多數(shù)含TATA序列,通常處于-30區(qū)無(wú)TATA盒的啟動(dòng)子稱無(wú)TATA盒啟動(dòng)子第20頁(yè)/共52頁(yè)tRNA基因啟動(dòng)子（Ⅲ型）第21頁(yè)/共52頁(yè)真核和原核的啟動(dòng)子有很多不同：（1）有多種元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）結(jié)構(gòu)不恒定。有的有多種框盒如組蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期轉(zhuǎn)錄蛋白；（3）它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同；（4）有的有遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件存在，如增強(qiáng)子；（5）這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作用；（6）不直接和RNApol結(jié)合。轉(zhuǎn)錄時(shí)先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合，再和聚合酶結(jié)合。第22頁(yè)/共52頁(yè)二、增強(qiáng)子(enhancer)：增強(qiáng)基因啟動(dòng)子工作效率的順式作用序列，能夠在相對(duì)于啟動(dòng)子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。特性：雙向性重復(fù)序列功能與位置無(wú)關(guān)組織特異性可調(diào)控同源基因和異源基因第23頁(yè)/共52頁(yè)結(jié)構(gòu)基因的增強(qiáng)子第24頁(yè)/共52頁(yè)1.增強(qiáng)效應(yīng)十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10-200倍。經(jīng)人巨大細(xì)胞病毒增強(qiáng)子增強(qiáng)后的珠蛋白基因表達(dá)頻率比該基因正常轉(zhuǎn)錄高600-1000倍!2.增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無(wú)關(guān)，不論增強(qiáng)子以什么方向排列（5'→3'或3'→5'），甚至和基因相距3kp，或在基因下游，均表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng)；3.大多為重復(fù)序列，一般長(zhǎng)約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個(gè)核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)時(shí)所必需的；第25頁(yè)/共52頁(yè)4.增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性，說(shuō)明只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能；5.沒(méi)有基因?qū)Ｒ恍?，可以在不同的基因組合上表現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)；6.許多增強(qiáng)子還受外部信號(hào)的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動(dòng)區(qū)上游所帶的增強(qiáng)子，就可以對(duì)環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應(yīng)。第26頁(yè)/共52頁(yè)細(xì)胞專一性增強(qiáng)子：許多增強(qiáng)子的增強(qiáng)效應(yīng)有很高的組織細(xì)胞專一性，只有在特定的轉(zhuǎn)錄因子(蛋白質(zhì))參與下，才能發(fā)揮其功能。誘導(dǎo)性增強(qiáng)子：這種增強(qiáng)子的活性通常要有特定的啟動(dòng)子參與。例如，金屬硫蛋白基因可以在多種組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，又可受類固醇激素、鋅、鎘和生長(zhǎng)因子等的誘導(dǎo)而提高轉(zhuǎn)錄水平。第27頁(yè)/共52頁(yè)三、沉默子(silencer)

是真核基因中的一種特殊的序列，與增強(qiáng)子有許多類似之處。沉默子能夠同反式因子結(jié)合從而阻斷增強(qiáng)子及反式激活因子的作用，并最終抑制該基因的轉(zhuǎn)錄活性。第28頁(yè)/共52頁(yè)四、絕緣子（insulator）真核生物基因組的調(diào)控元件之一，是一種邊界元件。絕緣子能夠阻止鄰近的增強(qiáng)子或沉默子對(duì)其界定的基因的啟動(dòng)子發(fā)揮調(diào)控作用。絕緣子的抑制作用具有“極性”的特點(diǎn)，即只抑制處于絕緣子所在邊界另一側(cè)的增強(qiáng)子或沉默子，而對(duì)處于同一染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的增強(qiáng)子或沉默子沒(méi)有作用第29頁(yè)/共52頁(yè)轉(zhuǎn)錄因子的作用方式：第30頁(yè)/共52頁(yè)終止子（Terminator）是一段位于基因或操縱子末端的DNA片段，可中斷轉(zhuǎn)錄作用。原核生物擁有兩種類型的終止子，包括：本體轉(zhuǎn)錄終止子（Intrinsictranscriptionterminators），一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ρ-依賴轉(zhuǎn)錄終止子（Rho-dependenttranscriptionterminators），ρ因子與RNA螺旋酶蛋白復(fù)合物。五、終止子(terminator):（一）原核生物的終止子

第31頁(yè)/共52頁(yè)ρ-依賴轉(zhuǎn)錄終止子第32頁(yè)/共52頁(yè)本體轉(zhuǎn)錄終止子第33頁(yè)/共52頁(yè)富含GC第34頁(yè)/共52頁(yè)第35頁(yè)/共52頁(yè)回文結(jié)構(gòu)：palindromestructure,雙鏈DNA中含有的二個(gè)結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列稱為反向重復(fù)序列，也稱回文結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)反向重復(fù)序列不一定是連續(xù)的第36頁(yè)/共52頁(yè)（二）真核生物的終止子

真核生物終止子，在mRNA前體的近3'-端處轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一組共同序列，即AAUAAA和GU-rich序列，為轉(zhuǎn)錄終止的識(shí)別位點(diǎn)和poly(A)修飾識(shí)別位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄越過(guò)修飾點(diǎn)后，RNA鏈在修飾點(diǎn)處被水解切斷，轉(zhuǎn)錄終止，隨即進(jìn)行加尾修飾。第37頁(yè)/共52頁(yè)一、大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)1.復(fù)制子常見(jiàn)復(fù)制子：pMB1、ColE1、pSC101。松弛型復(fù)制子，10-20個(gè)拷貝/細(xì)胞第三節(jié)外源基因表達(dá)與調(diào)控（一）大腸桿菌基因表達(dá)載體第38頁(yè)/共52頁(yè)（二）宿主菌第39頁(yè)/共52頁(yè)（三）常見(jiàn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)第40頁(yè)/共52頁(yè)1.Lac表達(dá)系統(tǒng)包括正調(diào)控系統(tǒng)和負(fù)調(diào)控系統(tǒng)：CAP因子：環(huán)腺苷酸(cAMP)與受體蛋白CRP(cAMPreceptorprotein)結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱激活蛋白CAP(cAMPactivatedprotein)

，促進(jìn)RNA聚合酶結(jié)合在啟動(dòng)子上。正調(diào)控系統(tǒng)：調(diào)控因子CAP負(fù)調(diào)控系統(tǒng)：負(fù)調(diào)控因子lacI第41頁(yè)/共52頁(yè)…RPOS1S2……DNA調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因與阻遏蛋白結(jié)合1.RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)2.cAMP及其受體蛋白復(fù)合物（cAMP-CRP）結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生阻遏蛋白mRNA操縱子第42頁(yè)/共52頁(yè)（四）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式包涵體——在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起形成無(wú)膜的裸露結(jié)構(gòu)。1.包涵體蛋白具有正確的氨基酸順序，但沒(méi)有生物活性；水難溶的性質(zhì)；少受受體細(xì)胞蛋白酶影響；易于分離純化。第43頁(yè)/共52頁(yè)優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：第44頁(yè)/共52頁(yè)融合蛋白——將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變2個(gè)基因閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白叫融合蛋白。2.融合蛋白受體菌蛋白N端，外源蛋白在C端穩(wěn)定性大大增加水溶性好易于分離純化。第45頁(yè)/共52頁(yè)構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，將多個(gè)外源基因串聯(lián)連接，形成寡聚型外源蛋白。有3種方式：多表達(dá)單元的重組：每單元有自己的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白不須裂解處理。多順?lè)醋又亟M：共同啟動(dòng)子和終止子，各自的表達(dá)單元：SD序列、翻譯起始合終止信號(hào)。多編碼序列重組：共同表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，但各外源基因接口有蛋白酶切位點(diǎn)。3.寡聚型外源蛋白第46頁(yè)/共52頁(yè)——將外源基因整合到宿主細(xì)胞染色體上，必須整合到染色體的非必需區(qū)同源交換選擇不能在受體細(xì)胞自主復(fù)制的質(zhì)粒。4.整