基因探針的學(xué)習(xí)材料

基因探針的學(xué)習(xí)材料第1頁/共52頁基因探針

基因探針又稱核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的?；蛱结樖侵改芘c特定的靶分子序列發(fā)生特異性相互作用的標(biāo)記分子.也就是指一段能識別(與目的序列或靶序列互補(bǔ))特異性堿基序列(基因)的標(biāo)記同位素等標(biāo)記物的單鏈DNA或RNA的分子。第2頁/共52頁檢測DNA的技術(shù)稱為.Southernblot雜交.檢測RNA的技術(shù)稱為.Northernblot雜交.檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)稱為.Westernblot雜交.還有dotblot,原位雜交技術(shù)等.第3頁/共52頁雜交類型

固相雜交液相雜交第4頁/共52頁核酸分子雜交

(固相雜交)

Northern雜交

Southern雜交

芯片以上方法決定雜交模板核酸性質(zhì),DNASouthern雜交.RNANorthern雜交

第5頁/共52頁探針與核酸雜交的方法

1）斑點(diǎn)雜交(dot-blot)2）菌落/噬菌斑：轉(zhuǎn)印篩選法3）組織/細(xì)胞(DNA或RNA)：原位雜交(insituhybridizationISH).Southern-blot(DNA)、Northern-blot(RNA)DNA和RNA操作基本一樣，只是電泳所用的膠有所不同(RNA易形成二級結(jié)構(gòu))第6頁/共52頁探針基因的分離制備同位素或非同位素標(biāo)記標(biāo)記基因探針的純化檢測樣品核酸制備雜交膜制備或轉(zhuǎn)印預(yù)雜交雜交洗膜圖3-3核酸探針雜交試驗全過程示意圖第7頁/共52頁（a）（b）（c）（d

）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern

凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)第8頁/共52頁RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似,所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng),這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）。第9頁/共52頁斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實驗的加樣過程中使用了特殊設(shè)計的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測。第10頁/共52頁檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)菌落雜交第11頁/共52頁原位雜交

(insituhybridizationISH)原位核酸分子雜交技術(shù)簡稱原位雜交(insituhybridizationISH)是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。第12頁/共52頁一、基因探針1）DNA酶切片段2）用PCR擴(kuò)增出的核酸3）直接用RNA作探針4）人工合成（含標(biāo)記）1.基因探針的類型第13頁/共52頁2.基因探針的要求1）盡量避免高度重復(fù)序列：根據(jù)目的而定。最好用cDNA(要將polyA或polyT去掉)。2）G+C含量：40-60%3）探針本身不能有4個連續(xù)互補(bǔ)堿基，否則本身形成二級結(jié)構(gòu)。4）不主張幾個連續(xù)相同堿基5）檢測目的核酸時，要考慮模板出現(xiàn)率。（兼并性）6）探針比模板短：實際用長探針檢測短模板的也可，不影響結(jié)果。第14頁/共52頁3.核酸探針雜交所用的固相載體1）芯片：種類多，用于工業(yè)生產(chǎn)，見各公司介紹。

2）硝酸纖維膜(NC膜)：吸附單鏈DNA、RNA能力強(qiáng)，80-100ug/cm2；也可非特異性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺點(diǎn)：脆、易折斷；不能吸附小片段DNA。3）尼龍膜：吸附DNA能力比NC膜強(qiáng)，也可吸附小至10bp的DNA。優(yōu)點(diǎn)：易把模板固定在膜上；可反復(fù)使用多次。4）化學(xué)活化膜：用化學(xué)試劑把NC膜處理，可吸附極少量核酸。也可用普通濾紙。5）濾紙第15頁/共52頁核酸雜交常用幾種膜的性能比較第16頁/共52頁硝酸纖維膜(NC膜)硝酸纖維膜有兩種;0.22μm孔經(jīng)0.45μm孔經(jīng)第17頁/共52頁4.基因探針的標(biāo)記物1）同位素：H3、

S35、

P32最常用（缺點(diǎn)：不能保存）2）非同位素：①地高辛：植物中提取。商品化地高辛標(biāo)記dCTP，即合成鏈時，用地高辛標(biāo)記dCTP。dCTP-地高辛與酶標(biāo)抗地高辛抗體反應(yīng)，加底物顯色。②生物素-親和素：用酶標(biāo)親和素測dCTP-生物素③熒光：送生物公司標(biāo)記第18頁/共52頁5.探針標(biāo)記方法1）DNA的切口平移2）隨機(jī)引物法3）單鏈DNA探針4）RNA探針5）DNA的5’或3’末端標(biāo)記6）寡核苷酸標(biāo)記7）PCR標(biāo)記第19頁/共52頁DNA的切口平移法

雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時，大腸桿菌DNA聚合酶I可把核苷酸殘基加到切口處的3’羥基端。且由于此酶具有5’3’外切酶活性，它還可以從切口的5’端除去核苷酸。5’端核苷酸的去除與3’端核苷酸的加入同時進(jìn)行，導(dǎo)致切口沿著DNA鏈移動(切口平移)。第20頁/共52頁切口平移的反應(yīng)體系探針DNA0.5ug10×切口平移緩沖液2.5uL10×dNTP（無dCTP）每種20nmolDNaseI(10ng/mL)2.5uLDNA聚合酶I2.5單位[α-32P]dCTP16pmol加dH2O至25uL14~16℃1~2h

加1uL0.5mol/LEDTA(pH8.0)終止反應(yīng)第21頁/共52頁隨機(jī)引物法DNA聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿單鏈模板合成DNA。如果寡核苷酸的序列不均一，它們就會在模板的許多位置上和模板雜交，因此模板上的每個核苷酸(可能要除去最靠近5’端的一些核苷酸)被拷貝進(jìn)產(chǎn)物中去的頻率相同。使用[α-32P]dNTP作為前體，用此法可合成比活度非常高的標(biāo)記DNA探針。第22頁/共52頁隨機(jī)引物的獲得：1）用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鮭精DNA產(chǎn)生大量6—12核苷酸的單鏈DNA。2）從一些廠家購買用小牛胸腺DNA制備的隨機(jī)引物。如Pharmacia、Boehringer、Mannheim等。3）在自動DNA合成儀上合成一個八聚體集群，這一分子集群在八聚體的每一個位置上都含有所有4種堿基。第23頁/共52頁單鏈DNA探針

單鏈探針僅由特定核酸序列的互補(bǔ)雙鏈之一組成，與傳統(tǒng)的雙鏈探針相比有很大的優(yōu)越性。由于不存在互補(bǔ)鏈，因此可以消除由探針的兩條鏈重退火形成無效雜交體的可能性。當(dāng)用來自某一種生物中的探針去檢測另一種遠(yuǎn)緣生物中可與之交叉雜交的序列時，單鏈探針尤為有用。由DNA模板體外制備單鏈探針有兩種方法：1）合成可與克隆于嗜菌?；騇13噬菌體載體上的序列互補(bǔ)的放射性標(biāo)記DNA（圖3-1）2）將克隆于特定載體上的靶序列轉(zhuǎn)錄成放射性標(biāo)記的RNA，在此載體上帶有可被噬菌體依賴于DNA的RNA聚合枚識別的啟動子。第24頁/共52頁將靶序列克隆于適當(dāng)?shù)腗13噬菌體或噬菌粒載體中，分離出帶有靶序列的單鏈DNA通用引物利用通用引物合成與靶序列互補(bǔ)的放射性標(biāo)記DNA大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段3種未標(biāo)記dNTP1種32p標(biāo)記dNTP用切點(diǎn)位于靶序列遠(yuǎn)端的限制酶來消化DNA

通過凝膠電泳把標(biāo)記探針與未標(biāo)記的的模板分開放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)參照物未標(biāo)記的模板DNA放射性標(biāo)記的DNA來自標(biāo)記DNA3’端的片段利用單鏈DNA載體合成探針(從左到右)第25頁/共52頁RNA探針

在來自鼠傷寒桿菌SP6噬菌體或來自大腸桿菌T7及T3噬菌體的強(qiáng)啟動子下游裝置多克隆位點(diǎn)，組建成質(zhì)粒載體，可合成高比活度的單鏈RNA探針。RNA探針具有許多優(yōu)越性：1）放射性標(biāo)記RNA的合成效率高。因為用于合成RNA的模板可被轉(zhuǎn)錄多次，所以產(chǎn)生的RNA數(shù)倍于模板。2）rNTP的濃度相對交低時(1-20umol/L)，噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶也能在體外發(fā)揮作用，所以合成高比活度全長探針的成本相對較低。3）僅用無RNA酶的DNA酶I處理就可從RNA探針中除去模板DNA。而不必用凝膠電泳進(jìn)行純化。4）由于RNA雜交體的穩(wěn)定性本身就比較高，所以RNA雜交反應(yīng)中產(chǎn)生的信號一般要比相同比活度的DNA探針強(qiáng)。5）RNA探針的使用改進(jìn)了分析哺乳動物基因轉(zhuǎn)錄物的方法。可用RNA酶A來消化RNA∶RNA雜交體，而不必用難以控制的S1核酸酶來消化DNA∶RNA雜合分子。第26頁/共52頁多克隆位點(diǎn)SP6啟動子T7啟動子將靶序列克隆于帶有噬菌體啟動子的質(zhì)粒中，這些啟動子可被噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別用切點(diǎn)位于靶序列遠(yuǎn)端的限制酶消化重組質(zhì)粒產(chǎn)生平端或3’凹端SP6啟動子T7啟動子SP6噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶3種未標(biāo)記rNTP1種32p標(biāo)記rNTP用DNA酶I消化以去除模板DNA32p標(biāo)記的RNA體外轉(zhuǎn)錄合成RNA探針(從左到右)第27頁/共52頁DNA的5’或3’末端標(biāo)記

不同的末端標(biāo)記用不同的酶：1）大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段：3’末端標(biāo)記2）T4噬菌體多核苷酸激酶：標(biāo)記DNA5’端3）T4噬菌體DNA聚合酶：標(biāo)記DNA3’端第28頁/共52頁寡核苷酸標(biāo)記①T4噬菌體多核苷酸激酶：合成的寡核苷酸在合成時其5’端缺少一個磷酸基，因而極易用T4噬菌體多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，從而將γ-32p從[γ-32p]ATP轉(zhuǎn)移至其5’端。②大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段：用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段合成與合成寡核苷酸互補(bǔ)的DNA鏈，可得到高比活度的探針。用一短引物與寡核苷酸模板結(jié)合，后者的序列互補(bǔ)于所用的放射性標(biāo)記探針。該引物隨后在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，從而使[α-32p]dNTP在模板指導(dǎo)下發(fā)生摻入。第29頁/共52頁標(biāo)記基因探針的純化1）乙醇沉淀法2）CPB沉淀法：回收用磷酸鹽緩沖液從羥基磷石灰層析柱洗脫下來的DNA3）放射性標(biāo)記探針的純化:19%PAGE電泳、Bio-GelP-60柱或Sep-Pak柱層析第30頁/共52頁1）探針濃度①同位素標(biāo)記的探針：5-100ug/mL②非同位素標(biāo)記的探針：25-1000ug/mL③原位雜交：0.5-5.0ug/mL注：2）隨機(jī)多聚體①硫酸葡聚糖：5-10%②PEG6000-8000③聚丙稀酸（鈉鹽）：2-4%第31頁/共52頁

轉(zhuǎn)印虹吸印跡法

電轉(zhuǎn)移法

DNA片段大小影響轉(zhuǎn)移速度.第32頁/共52頁

預(yù)雜交用DNA酶I消化并變性的小牛胸腺DNA或鮭精DNA封閉膜.第33頁/共52頁

雜交液5XSSC20mmol/L鱗酸緩沖液

(pH7.0)5XDenholdt氏液

10%硫酸葡聚糖

100μg/ml變性小牛胸腺DNA或鮭精DNA.50%甲酰胺第34頁/共52頁洗滌液2XSSC,0.5%SDS5min.2XSSC,0.1%XSDS15min.(室溫).0.1XSSC,0.1%XSDS37°C30min至1h.0.1XSSC,0.1%XSDS65°C洗滌30min至1h.(水浴)顯影(放射性,非放射性)第35頁/共52頁原位雜交原位雜交1969年美國耶魯大學(xué)Gall和Pardue首先創(chuàng)立的，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。第36頁/共52頁原位雜交技術(shù)的基本方法：(一),雜交前探針種類選擇。(二),雜交前探針標(biāo)記方法選擇。(三),探針的純化。(四),雜交前準(zhǔn)備,包括固定、取材、玻片和組織的處理，增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等。(五),組織的前處理。(六),預(yù)雜交。(七),原位雜交。(八),雜交后處理(漂洗)。(九),雜交后顯色。第37頁/共52頁原位雜交固定目的是為了保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，最大限度地保存細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA更易被酶降解，應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。第38頁/共52頁固定劑最常用多聚甲醛固定組織。醋酸酒精的混合液和Bouin′s固定劑也能獲得較滿意的效果。mRNA的定位將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1~2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃切片可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。第39頁/共52頁在病理學(xué)活檢取材時多用福爾馬林固定和石蠟包埋。其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲滿意效果。各種固定劑均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如沉淀性(Precipitating)固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件,但它們不能最大限度地保存RNA,而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu),但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交聯(lián),從而大大地影響了核酸探針的穿透性。第40頁/共52頁雜交雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，或采用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片,加蓋片防止孵育過程中雜交液的蒸發(fā)。在蓋玻片周圍加液體石蠟封固或加橡皮泥封固。玻片進(jìn)行雜交的載玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standardsalinecitrate,SSC)溶液的濕盒中進(jìn)行孵育。第41頁/共52頁雜交后漂洗雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高漂洗。第42頁/共52頁顯示顯示又可稱為檢測系統(tǒng)(Detectionsystem)。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。第43頁/共52頁非特異性染色非特異性染色可能會來自探針、組織內(nèi)源性酶、組織細(xì)胞、顯色系統(tǒng)等;探針特異性不高以及組織細(xì)胞內(nèi)某些成分與顯示系統(tǒng)中的抗體成分非特異結(jié)合也可造成非特異性染色。組織細(xì)胞內(nèi)源性酶是原位雜交中非特異性著色的重要原因,目前最常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶,這兩種酶都廣泛存在于組織細(xì)胞中,因此用這些酶時應(yīng)有消除內(nèi)源性酶的相應(yīng)步驟。如過氧化物酶用3%H2O2處理5~10min;10%冰醋酸處理組切片10min,或在底物顯色液中加入1mmol/L左旋咪唑可防止內(nèi)源性堿性磷酸酶的染色。NBT/BCIP顯示堿性磷酸酶時如果在光照下顯色也會增強(qiáng)非特異性染色。必須根據(jù)檢測系統(tǒng)不同的標(biāo)記酶作不同的內(nèi)源酶處理。第44頁/共52頁常用的對照試驗

1將cDNA或cRNA探針進(jìn)行預(yù)雜交(吸收試驗)。2與非特異性(載體)序列和不相關(guān)探針雜交(置換試驗)。3將切片應(yīng)用RNA酶或DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后雜交。應(yīng)用同義RNA探針(Senseprobe)進(jìn)行雜交。4以不加核酸探針雜交液進(jìn)行雜交(空白試驗)。5組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進(jìn)行雜交對照。6應(yīng)用未標(biāo)記探針做雜交進(jìn)行對照。第45頁/共52頁通常用地高辛(Dig),生物素,熒光素,同位素,等標(biāo)記探針;(一)、地高辛(Dig)標(biāo)記DNA探針在石蠟切片檢測病毒DNA的方法。(二)、生物素標(biāo)記DNA探針在石蠟切片上檢測目的DNA的方法。(三)、cRNA探針檢測組織切片中的RNA原位雜交。(四)、用寡核苷酸探針檢測組織切片中的RNA原位雜交。

(五)、用cDNA探針檢測體外培養(yǎng)細(xì)胞中的RNA原位雜交。(六)、RNA原位雜交與免疫組化雙重檢測技術(shù)。(七)、多重RNA原位雜交技術(shù)。(雙重原位雜交是在同一標(biāo)本或同一細(xì)胞內(nèi)同時檢測兩種或兩種以上的靶核酸序列的技術(shù)。)(八)、原位雜交的PCR增敏法。第46頁/共52頁引物原位標(biāo)記技術(shù)(PrimedinsituLabeling,PRINS)

針對染色體的特異性α-衛(wèi)星DNA序列設(shè)計和合成引物。

利用未標(biāo)記的寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結(jié)合,然后用熒光素標(biāo)記的脫氧核苷酸(dUTP)與未標(biāo)記的脫氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸反應(yīng),標(biāo)記了的dUTP將以堿基配對的形式摻入到新合成的DNA單鏈中,最后用相應(yīng)的熒光抗體與標(biāo)記物結(jié)合以顯示檢測結(jié)果。

第47頁/共52頁原位雜交技術(shù)應(yīng)用原位雜交技術(shù)已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究如基因組圖(Genemapping),轉(zhuǎn)基因檢測,基因表達(dá)定位(localizationofgeneexpression),核DNA和RNA的mRNA的排列和運(yùn)輸(arrangementandtransportofmNA),復(fù)制(replication)和細(xì)胞的分類(Sortingofcells)。臨床研究應(yīng)用在細(xì)胞遺傳學(xué)(Cytogenetics),產(chǎn)前診斷(Prenataldiagnosis),腫瘤和傳染性疾病的診斷,生物學(xué)劑量測定(biologicaldosimetry)和病毒學(xué)的病原學(xué)診斷等。第48頁/