分子生物 第3章 DNA體外重組 第7、8章 外源基因在原核、真核細(xì)胞中的表達(dá)(林小聰)

DNA體外重組第三章DNArecombinationinvitro*1授課：廣東醫(yī)科大學(xué)林小聰*2即基因克隆：它涉及到特定DNA片段的獲取、載體的選擇及準(zhǔn)備、DNA片段與載體重組、重組DNA的轉(zhuǎn)化、重組DNA的克隆化及鑒定等操作。是操作基因的最基本技術(shù)，也是分子生物學(xué)的核心技術(shù)；是通過(guò)體外連接重組、體內(nèi)克隆擴(kuò)增，將2個(gè)或2個(gè)以上的DNA分子組成1個(gè)新的DNA分子的過(guò)程。第三章DNA體外重組第一節(jié)

基本流程和必備工具*3一、基本流程二、常用工具酶三、基因載體分－－(1)獲取目的基因并進(jìn)行必要的改造切－－(2)選擇載體并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶切割接－－(3)將目的基因與載體連接成重組DNA

轉(zhuǎn)－－(4)將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩－－(5)含重組DNA宿主細(xì)胞的克隆化及鑒定一、DNA體外重組的基本流程*4思考題1重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程（1）*5重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程（2）*6

(一)限制性核酸內(nèi)切酶

是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，又稱(chēng)為內(nèi)切酶或限制酶（restrictionenzyme）。主要是從原核生物中分離純化而來(lái)。在原核生物中與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。*7二、常用工具酶（restricton

Endonuclease）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)斜體；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)斜體；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。限制酶的命名：HindⅢ

屬種

株序Haemophilus

influenzae

d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶*8Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相對(duì)分子量較大的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，同時(shí)具有內(nèi)切酶和甲基化酶活性，反應(yīng)過(guò)程中需有Mg2+和ATP參與。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）。限制酶的分類(lèi)：Ⅱ型限制酶通常以同源二聚體形式存在，只具有核酸內(nèi)切酶活性而無(wú)甲基化酶活性，反應(yīng)過(guò)程中只需有Mg2+參與而不需有ATP參與。*9Ⅱ類(lèi)酶識(shí)別序具有回文結(jié)構(gòu)(palindrome)特點(diǎn)，

即具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的兩條DNA鏈的堿基序列的反向重復(fù)。１.識(shí)別位點(diǎn)：大部分Ⅱ型限制酶都能識(shí)別由4~8個(gè)核苷酸組成的特定序列。*10*11BamHⅠGGATCCCCTAGGGTCCAGGACCTG+平端切口GCCTAGGATCCG+粘端切口HindⅡGTCGACCAGCTG平或鈍末端（bluntend)粘性末端（stickyend)切口：平端切口、粘端切口*12*13*14

2.酶切效率限制性?xún)?nèi)切酶的活性單位定義為：影響酶切效率的因素：*151小時(shí)內(nèi)完全酶解1μgλ噬菌體DNA中所有相同酶切點(diǎn)所需要的酶量。（1）緩沖液：商品化的內(nèi)切酶均提供高鹽、中鹽和低鹽緩沖液；進(jìn)行雙酶切時(shí)要遵循先低鹽反應(yīng)后高鹽反應(yīng)的原則。影響酶切效率的因素：（2）酶切位點(diǎn)的側(cè)翼序列：大多數(shù)限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)只含有識(shí)別序列的寡核苷酸沒(méi)有催化活性，需在兩側(cè)各延長(zhǎng)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸才能被有效酶切。盡量不要選擇兩個(gè)位點(diǎn)相鄰的內(nèi)切酶，以避免側(cè)翼序列縮短或丟失影響酶切效率。（3）酶切位點(diǎn)的化學(xué)修飾：酶切位點(diǎn)的甲基化修飾可導(dǎo)致酶切失敗?？蓪①|(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化另一種菌株，再提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切。影響酶切效率的因素：（4）甘油含量：商品化的限制性?xún)?nèi)切酶保存在50%的甘油溶液中。酶切反應(yīng)體系中酶的體積應(yīng)控制在10%以?xún)?nèi)（即甘油含量在5%以?xún)?nèi)），以防止甘油抑制酶活性。（5）反應(yīng)時(shí)間：酶切反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)說(shuō)明書(shū)確定。若需延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，應(yīng)適當(dāng)減少酶的用量，以避免產(chǎn)生星號(hào)活性（內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)條件下也能切割一些與其特異識(shí)別序列類(lèi)似的序列）。影響酶切效率的因素：（6）加樣順序：配制酶切反應(yīng)體系時(shí)酶要最后加。（7）酶的稀釋?zhuān)荷唐坊膬?nèi)切酶都是濃度很高的濃縮酶，使用時(shí)可用酶切緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)荒苡盟M(jìn)行稀釋?zhuān)駝t可導(dǎo)致酶失活。限制性?xún)?nèi)切酶酶切中常見(jiàn)的問(wèn)題和原因能使在DNA雙鏈上相鄰的5-磷酸基和3-羥基之間形成3,5-磷酸二酯鍵從而封閉DNA鏈上的缺口或連接2個(gè)DNA片段。

(二)DNA連接酶(DNAligase)*20(2)T4DNA連接酶在ATP和Mg2+存在條件下，可使DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA片段間的，2個(gè)互補(bǔ)黏性末端或平末端連接。(1)大腸埃希菌DNA連接酶

只能連接具有互補(bǔ)黏性末端的兩個(gè)雙鏈DNA分子。連接黏性末端作用模式圖：*******GAATTC*****************CTTAAG**********5′3′5′3′EcoR

IDNA連接酶*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—+*21連接平末端作用模式圖：*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′Alu

IT4DNA連接酶—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************+*22

(三)DNA聚合酶能催化以DNA或RNA為模板合成DNA的反應(yīng)，把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地添加到雙鏈DNA分子的或引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。1.大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ2.Klenow片段具有53聚合酶，

35及53核酸外切酶活性。具有53聚合酶，

35核酸外切酶活性。*233.TaqDNA聚合酶4.反轉(zhuǎn)錄酶：依賴(lài)RNA的DNA聚合酶。具有53聚合酶，53核酸外切酶活性，對(duì)Mg2+濃度非常敏感。是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的、耐熱的、依賴(lài)DNA的DNA聚合酶，

最佳反應(yīng)溫度為70~75℃。

普遍使用的是來(lái)源于AMV(鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反轉(zhuǎn)錄酶，具有53聚合酶。*241.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyl

transferase）

(四)

其它修飾酶是一種無(wú)需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3-OH末端上。(1)底物是單鏈DNA或有3突出末端的雙鏈DNA。5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A/G/C/T)n*25(2)底物是3’平端或3’凹端的雙鏈DNA。Co2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)n用途：

（1）主要作用是在載體或目的基因3末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重組。（2）使DNA3末端帶上標(biāo)記物。*26

2.堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）能特異地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基團(tuán)。

3.多核苷酸激酶（polynuleotide

kinase）又稱(chēng)T4多核苷酸激酶，能催化ATP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA片段的5’-OH末端。*27載體（vector）的概念是指能攜帶目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)自主自制或表達(dá)的DNA分子。*28三、基因載體(1)質(zhì)粒載體：最常用的目的基因克隆載體；粘粒載體：用于克隆大片段DNAM13噬菌體載體：用于Sanger雙脫氧DNA測(cè)序(2)噬菌體載體：構(gòu)建基因組DNA或cDNA文庫(kù)(3)病毒載體：包括人或哺乳動(dòng)物病毒、昆蟲(chóng)及植物病毒，用于在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白(4)人工染色體載體：用于更大DNA片段的克隆

(一)質(zhì)粒(plasmid)載體細(xì)菌培養(yǎng)

質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色質(zhì)以外，具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA。小的約2~3kb,大的數(shù)百kb。大腸桿菌染色質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒:復(fù)制受到嚴(yán)格控制,1個(gè)細(xì)胞周期復(fù)制1-2次松弛型質(zhì)粒:復(fù)制控制較寬松,1個(gè)細(xì)胞周期復(fù)制10-200次*30１.克隆用質(zhì)粒載體含有復(fù)制起始點(diǎn)OriC、多個(gè)可供插入DNA片段的酶切位點(diǎn)MCS和篩選標(biāo)志（藥物抗性基因或代謝酶編碼基因）。

主要功能是攜帶目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制擴(kuò)增，可經(jīng)過(guò)克隆篩選獲得克隆化的重組DNA。分子質(zhì)量相對(duì)較小，以容納較大的外源DNA；拷貝數(shù)較多，易于與受體細(xì)胞的染色體DNA分開(kāi)；具有較高的遺傳穩(wěn)定性。amprORItetr

(1)質(zhì)粒pBR322：最早商業(yè)化的克隆載體ORI：ampr,

tetr：兩個(gè)抗性基因，用于篩選陽(yáng)性克隆。PstI,BamHI：兩個(gè)酶切位點(diǎn)，用于插入目的基因分子量較小拷貝數(shù)較高復(fù)制起始點(diǎn)，保證高拷貝自我復(fù)制。*31陽(yáng)性克隆*32含Amp培養(yǎng)板含Tet培養(yǎng)板BamH

I酶切插入目的基因，

Tetr失效：

(2)質(zhì)粒pUC18/19:pBR322衍生的克隆載體OripUC192686bpAmprP(BLA)PlacAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCS多個(gè)酶切位點(diǎn)用于克隆操作LacZ’藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆分子量更小拷貝數(shù)更高*33

pUC質(zhì)粒載體插入了β半乳糖苷酶N端α肽片段的編碼基因lacZ’；表達(dá)的產(chǎn)物α肽也無(wú)酶活性，也不能分解培養(yǎng)基中的X-gal。藍(lán)白斑篩選

DH5a宿主菌染色體插入了β半乳糖苷酶的C端ω肽片段的編碼基因lac’△M15；能表達(dá)ω肽但無(wú)酶活性；不能分解培養(yǎng)基中的X-gal。有活性的β半乳糖苷酶由α肽和ω肽互補(bǔ)(α互補(bǔ))而成，可使培養(yǎng)基中的X-gal分解形成藍(lán)色化合物而出現(xiàn)藍(lán)色菌落。*34α*35X-gal藍(lán)色化合物-半乳糖苷酶（α+ω）白色藍(lán)白斑篩選：ωDH5a宿主菌藍(lán)色菌落：陰性克隆;

白色菌落：陽(yáng)性克隆*36藍(lán)白斑篩選

(3)

TA克隆載體

許多耐熱的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)擴(kuò)增時(shí)，都在PCR產(chǎn)物3’-末端加上了A堿基。是專(zhuān)為克隆PCR產(chǎn)物而設(shè)計(jì)的，在其MCS兩側(cè)的3′-末端攜帶有未配對(duì)的T堿基。3′3′5′PCR產(chǎn)物AA5′Taq酶T載體TT5′5′3′3′*37在連接酶的作用下可直接將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體中是在克隆載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點(diǎn)的上下游加上特殊啟動(dòng)子序列，從而使其既可作為克隆載體又可在體外將插入的DNA片段轉(zhuǎn)錄成mRNA的雙重功能載體。如pGEM-3Z/4Z。*382.克隆-體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體由pUC系列質(zhì)粒載體派生而來(lái)，在MCS兩側(cè)分別加上了噬菌體T7啟動(dòng)子和SP6的強(qiáng)啟動(dòng)子序列，為RNA聚合酶的附著提供了特異性識(shí)別位點(diǎn)。*39PT7Psp6是在克隆載體的基礎(chǔ)上，加上可使插入基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的必要元件，如啟動(dòng)子、終止子、核糖體識(shí)別位點(diǎn)、起始密碼和終止密碼等。*403.表達(dá)用質(zhì)粒載體(1)原核表達(dá)質(zhì)粒載體在原核克隆質(zhì)粒載體MCS的上下游分別加上啟動(dòng)子和終止子，與插入基因組成轉(zhuǎn)錄單位；加入RBS、起始和終止密碼，與插入基因組成翻譯模板。

pET28a在起始密碼的上游還加入了操縱基因（阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)），在閱讀框中還加入了6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(histag)的編碼序列。*41DNA聚合酶RNA聚合酶多聚組氨酸標(biāo)簽(His-tag)：由6個(gè)組氨酸殘基組成，位于目的蛋白的C末端或N末端，以融合表達(dá)方式與目的蛋白一起表達(dá)。分子量小，對(duì)目的蛋白的生物學(xué)特性及其功能沒(méi)有影響，可通過(guò)固定化金屬離子親和層析對(duì)帶有His-tag的目的蛋白進(jìn)行分離、純化。*42(1)真核表達(dá)質(zhì)粒載體－－穿梭載體

一般由兩部分組成，一部分用于在原核細(xì)胞中復(fù)制及篩選，另一部分用于在真核細(xì)胞中復(fù)制、篩選及表達(dá)。如pRc/CMV：前一部分來(lái)源于pUC質(zhì)粒，包括復(fù)制起始點(diǎn)OriC和ampr基因，用于在原核細(xì)胞中復(fù)制及篩選；另一部分來(lái)源于病毒，包括PCMV（巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子）、新霉素抗性基因(neo)及polyA加尾信號(hào)序列，用于在真核細(xì)胞中復(fù)制、篩選及表達(dá)。*43

(二)病毒載體(viralvector)

是通過(guò)改造病毒基因組DNA，使其具備攜帶目的基因并能在宿主細(xì)胞中包裝成病毒顆粒的DNA分子。*44常用的RNA病毒載體（整合型）：逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus,RV)慢病毒(lentivirus):也屬于RV家族常用的DNA病毒載體（游離型）：腺病毒(adenovirus,Ad)腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus,AAV)桿狀病毒(baculovirus)原核病毒（噬菌體）載體：*45

2.慢病毒載體

是將人類(lèi)免疫缺陷I型病毒(HIV-1)基因組改造而獲得的載體，可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久表達(dá)外源基因的目的。ψgagpropol

envU5RU3U5RU3LTR-3’5’-LTRU3=增強(qiáng)子，R=啟動(dòng)子，U5=轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；Ψ=病毒包裝信號(hào)；gag=編碼核心抗原，pro=切割蛋白前體所需蛋白酶，pol=病毒復(fù)制所需的聚合酶，env=胞膜蛋白。

(1)pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LTR=長(zhǎng)末端重復(fù)序列;PBS=引物結(jié)合位點(diǎn);Ψ=病毒包裝信號(hào);RRE=反式激活因子Rev蛋白的應(yīng)答元件;cPPT/CTS=Poly(A)n加尾信號(hào),輔助病毒包裝;IRES=核糖體結(jié)合位點(diǎn);PCMVIE=人類(lèi)巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子; ZsGreen1=綠色熒光蛋白的基因;WPRE=轉(zhuǎn)錄后調(diào)解元件

(2)病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper1.0CMV=人類(lèi)巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子;gag=編碼核心抗原;pro=切割蛋白前體所需蛋白酶;pol=病毒復(fù)制所需的聚合酶;RRE=反式激活因子Rev蛋白的基因;EEnv=胞膜蛋白。

(3)病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper2.0CMV=人類(lèi)巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子;VSVG=單純皰疹病毒來(lái)源的VSV-G基因，提供病毒包裝所

需要的包膜蛋白。

(三)人工染色體載體

酵母人工染色體載體，簡(jiǎn)稱(chēng)YAC載體，由酵母染色體、酵母2μmDNA質(zhì)粒的復(fù)制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb～2,000kb外源DNA片段，是人類(lèi)基因組計(jì)劃中物理圖譜繪制采用的主要載體。

細(xì)菌人工染色體載體，簡(jiǎn)稱(chēng)BAC載體，以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成；可插入100kb～300kb外源DNA片段，是人類(lèi)基因組計(jì)劃中序列分析采用的主要載體。*49第二節(jié)

DNA重組前的準(zhǔn)備工作*50一、選擇載體二、載體的準(zhǔn)備三、目的DNA的設(shè)計(jì)*51一、載體的選擇

(一)選擇載體的基本原則1.目的DNA的大??； 2.明確重組的目的；①表達(dá)融合蛋白，載體需要攜帶一段融合肽序列3.適合的克隆位點(diǎn)； 4.載體的穩(wěn)定性。1.載體結(jié)構(gòu)；

(二)選擇載體時(shí)需要考慮的因素②載體是否攜帶基因表達(dá)用的起始和終止密碼子專(zhuān)用載體：如T載體專(zhuān)用于PCR產(chǎn)物的克隆表達(dá)載體：2.載體上可操作的酶切位點(diǎn)3.載體在宿主細(xì)胞中的行為方式③插入目的基因后，載體提供的閱讀框是否與目的基因的閱讀框一致，是否需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整④對(duì)載體進(jìn)行酶切處理不能影響一些重要的原件，如保證核糖體結(jié)合的SD序列表達(dá)載體：除了MCS可插入目的基因外，載體上其它的酶切位點(diǎn)也可以使用。如利用啟動(dòng)子兩端的酶切位點(diǎn)可更換載體的啟動(dòng)子明確載體屬于獨(dú)立復(fù)制型還是整合型載體*53二、載體的準(zhǔn)備1.質(zhì)粒載體的線性化(1)單酶切：用一種限制性?xún)?nèi)切酶切割質(zhì)粒載體，使環(huán)狀質(zhì)粒變成線狀質(zhì)粒。(2)雙酶切：用兩種合適的限制性?xún)?nèi)切酶同時(shí)或分別切割質(zhì)粒載體，在去掉載體上一段序列的同時(shí)使環(huán)狀質(zhì)粒變成線狀質(zhì)粒。避免使用同尾酶！*542.線性載體的純化最簡(jiǎn)單的方法是用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA,然后將線性載體DNA條帶從凝膠上切割下來(lái)，再?gòu)哪z中回收載體DNA。從凝膠中回收載體DNA

(1)用DNA回收試劑盒回收

(2)擠膠法回收DNA：將切出的含DNA條帶的凝膠條用封口膜包好，-70oC短時(shí)間冷凍，取出溶化后用拇指及食指擠壓凝膠條，收集擠壓出的液體即可。*55三、目的DNA的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)1.根據(jù)載體設(shè)計(jì)目的DNA片段的結(jié)構(gòu)

(1)目的DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)通常是根據(jù)載體的酶切位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)的，可采用目的DNA內(nèi)部的酶切位點(diǎn)，也可額外加上酶切位點(diǎn)。

(2)選用T載體時(shí)對(duì)目的DNA片段的考慮：線性T載體3’-端為不配對(duì)的T；Taq酶可在PCR產(chǎn)物末端加A,高保真酶不能在PCR產(chǎn)物末端加A。*562.根據(jù)研究目的設(shè)計(jì)DNA片段的結(jié)構(gòu)

(1)擴(kuò)增目的DNA片段時(shí)引物的選擇：以檢測(cè)特異DNA序列存在與否為目的，可隨意根據(jù)DNA序列設(shè)計(jì)引物；以獲得表達(dá)產(chǎn)物為目的，則需要根據(jù)編碼序列（通常選擇cDNA序列全長(zhǎng)）設(shè)計(jì)引物。

(2)串聯(lián)目的DNA片段時(shí)酶切位點(diǎn)的選擇：在DNA單體片段的末端設(shè)計(jì)同尾酶(如BamHⅠ和BglⅡ)。

(3)選用表達(dá)載體時(shí)DNA片段酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)：目的DNA的起始密碼與載體上SD序列等重要元件的距離要適當(dāng)。如酶切位點(diǎn)遠(yuǎn)離SD序列，可在目的DNA片段上設(shè)計(jì)一段與起始密碼距離適當(dāng)?shù)腟D序列。第一節(jié)基本流程和必備工具*57一、基本流程：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩二、常用工具酶：限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶三、基因載體：質(zhì)粒載體、病毒載體、人工染色體載體克隆載體、克隆-轉(zhuǎn)錄載體、表達(dá)載體第二節(jié)DNA重組前的準(zhǔn)備工作一、選擇載體：基本原則、考慮因素二、載體的準(zhǔn)備：線性化、分離純化三、目的DNA的設(shè)計(jì)：根據(jù)載體、根據(jù)研究目的第三節(jié)

目的DNA片段的獲取及準(zhǔn)備*58一、獲取DNA片段的方法二、DNA片段的末端處理目前多采用PCR法或化學(xué)合成-PCR搭接法合成目的基因片段。*59一、獲取DNA片段的方法選擇

(一)獲取DNA片段的主要方法1.酶切法直接分離目的DNA片段2.PCR和RT-PCR技術(shù)體外擴(kuò)增合成目的DNA片段從載體上切割目的DNA片段(1)根據(jù)一段已知序列設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA或mRNA為模板，合成全長(zhǎng)目的DNA片段。(2)在PCR引物上，可直接加上合適的酶切位點(diǎn)或其它重要元件，或通過(guò)錯(cuò)配改變堿基序列。思考題2反轉(zhuǎn)錄AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶重復(fù)上述步驟擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)退火延伸PCR或RT－PCRgDNA文庫(kù)：g-文庫(kù)cDNA文庫(kù)：c-文庫(kù)方法：

用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫(kù)中的DNA作核酸雜交，從基因文庫(kù)中“釣出”有目的基因的克隆。*613.篩選文庫(kù)獲得目的DNA片段Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization.化學(xué)合成：德國(guó)K&A公司的DNA合成儀,可合長(zhǎng)200bp。②從氨基酸序列推測(cè)的DNA序列：*63直接用氨基酸序列從GenBank等網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)搜索4.化學(xué)合成-PCR搭接法獲取目的DNA片段①長(zhǎng)度約200bp的已知核苷酸序列的合成；避免使用稀缺密碼子，顧及宿主細(xì)胞的密碼偏好*64*65

(二)根據(jù)目的和條件選擇獲取DNA片段的方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的方法用于獲取目的DNA片段。(1)直接從重組載體上將目的DNA片段酶下來(lái)或擴(kuò)增出來(lái)。(2)計(jì)算機(jī)克隆法：首先將擬克隆的DNA序列在種屬間進(jìn)行同源性或相似性比較，找出目的DNA的保守序列設(shè)計(jì)引物，從特定細(xì)胞或組織分離DNA或mRNA作為模板合成目的DNA。*66二、DNA片段的末端處理1.PCR產(chǎn)物的末端及修飾2.DNA片段末端加尾修飾

5’-末端可做多種修飾；Taq酶可在PCR產(chǎn)物的3’-末端加A(高保真酶無(wú)此功能)。(1)用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈DNA的3’-端加上單鏈多聚核苷酸。(2)用DNA連接酶在DNA末端加上一段稱(chēng)為“接頭(adaptor)”序列。第四節(jié)

DNA片段與載體的重組*67一、DNA片段與載體連接的方式二、連接反應(yīng)時(shí)需要考慮的一些因素BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶，15oC+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連

(一)黏性末端連接1.單酶切的黏性末端連接一、DNA片段與載體連接的方式EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶，15oC重組體2.雙酶切的黏性末端連接*69目的基因載體限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶T4DNA連接酶，15oC重組體載體自連目的基因自連

(二)平頭末端連接

*705′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA

T(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體3′A(A)nA

A(A)nA3′5′5′

(1)同聚物加尾連接法*71EcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

(2)接頭連接法*72PCR擴(kuò)增+3′3′5′PCR產(chǎn)物AA5′T載體TT5′5′3′3′連接轉(zhuǎn)化藍(lán)白篩選Taq酶2.PCR產(chǎn)物的黏性末端T-A連接*73

(三)PCR產(chǎn)物的連接

1.PCR產(chǎn)物的平頭末端連接1.連接反應(yīng)的溫度和時(shí)間

一般采用T4DNA連接酶連接的反應(yīng)溫度設(shè)定在14-16oC，反應(yīng)時(shí)間為4-16小時(shí)。二、連接反應(yīng)時(shí)需要考慮的一些因素2.連接反應(yīng)的緩沖液3.連接酶的濃度4.DNA的濃度--目的DNA與載體DNA的比值

一般用50mmol/LTris-HCl緩沖液，pH7.4~7.8,10mmol/LMgCl2,10mmol/LDTT,1mmol/LATP,20~50μg/mlBSA。黏性末端連接：3~5

:1平頭末端連接：10:1

平末端連接所用酶量是黏性末端連接的10-100倍，進(jìn)行黏性末端連接時(shí)，連接酶一般需要用酶緩沖液進(jìn)行稀釋。第五節(jié)

重組DNA的克隆化及鑒定*75一、重組DNA轉(zhuǎn)化大腸埃希菌二、重組DNA的克隆篩選及鑒定1.轉(zhuǎn)化(transformation)

將質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞細(xì)菌(大腸埃希菌)的過(guò)程。2.轉(zhuǎn)染(transfection)

將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。3.感染(infection)以噬菌體或病毒載體構(gòu)建的重組DNA，經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體或病毒顆粒后，通過(guò)感染宿主細(xì)胞而將重組DNA注入到宿主細(xì)胞的過(guò)程。*76三個(gè)基本概念：

(一)大腸埃希菌作為宿主細(xì)胞①基因型：野生型：基因符號(hào)右上標(biāo)記+，如his+突變型：基因符號(hào)右上標(biāo)記-，如his-②表型：“+”代表有，“-”代表缺失；④缺失的基因：“Δ”，融合的基因：“Φ”一般經(jīng)過(guò)一定的改造使其具有適合重組DNA擴(kuò)增或表達(dá)的特性；具有其特定的基因型和表型。*77一、重組DNA轉(zhuǎn)化大腸埃希菌1.大腸埃希菌的特性標(biāo)識(shí)③特殊標(biāo)記，如氨芐西林抗性標(biāo)記：ampr、

Ampr*782.大腸埃希菌作為宿主細(xì)胞的基本條件①限制性缺陷、重組整合缺陷、感染寄生缺陷；②具有較高的轉(zhuǎn)化效率；③具有與載體選擇性標(biāo)記互補(bǔ)的表型。3.常用大腸埃希菌的基本特性①遺傳背景清楚；②載體-受體系統(tǒng)比較完備；③細(xì)胞生長(zhǎng)周期短，倍增時(shí)間約為20分鐘；④重組DNA穩(wěn)定。4.大腸埃希菌的選擇選擇依據(jù)：載體上的一些重要結(jié)構(gòu)元件，包括復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基因等。*79

(二)重組DNA的轉(zhuǎn)化1.制備感受態(tài)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞：是指用物理化學(xué)方法處理而產(chǎn)生的易于接納外源DNA的細(xì)胞。使大腸埃希菌轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞的最常用方法是CaCl2法。*802.轉(zhuǎn)化重組DNA應(yīng)注意的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：

①在冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，減少機(jī)械損傷；

②加入細(xì)胞膜保護(hù)劑，如DMSO或β-巰基乙醇。影響轉(zhuǎn)化效率主要因素：

①感受態(tài)細(xì)胞的狀態(tài)②轉(zhuǎn)化初始低溫操作③重組DNA結(jié)構(gòu)及濃度

(一)重組DNA的克隆篩選一般是通過(guò)單克隆宿主細(xì)胞的表型特征進(jìn)行篩選。*81二、重組DNA的克隆篩選及鑒定1.抗性篩選；2.藍(lán)白篩選；3.菌落PCR篩選4.原位雜交篩選

是從基因文庫(kù)中挑選含有目的基因的陽(yáng)性克隆的常用方法。

根據(jù)MCS兩側(cè)保守序列設(shè)計(jì)跨越MCS的通用引物，直接挑取單菌落作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增,然后瓊脂糖凝膠電泳分析。

(二)重組質(zhì)粒的提取鑒定*821.質(zhì)粒的提取*832.重組質(zhì)粒的鑒定

主要是對(duì)插入的DNA片段分子量及序列進(jìn)行鑒定。酶切DNA片段后電泳分離是最常用的方法。

(1)酶切電泳：

采用重組DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)切割質(zhì)粒后電泳。

(2)DNA序列分析：重組質(zhì)粒鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。DNA體外重組的主要技術(shù)操作載體質(zhì)粒噬菌體-病毒人工染色體目的基因（外源基因）酶切法

文庫(kù)擴(kuò)增化學(xué)合成-PCR搭接體外擴(kuò)增限制酶消化開(kāi)環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳原位雜交*84菌落PCR

外源基因表達(dá)涉及目的基因的克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過(guò)程，需要在適合的表達(dá)系統(tǒng)中完成。*85第七章外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1973年，美國(guó)科學(xué)家CohenS建立了體外DNA重組技術(shù)，并在細(xì)菌中成功表達(dá)了外源基因。

表達(dá)體系(expressionsystem)由表達(dá)載體(vector)和表達(dá)宿主(host)兩部分組成。根據(jù)受體細(xì)胞的不同分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。

*86

表達(dá)體系的建立包括表達(dá)載體的構(gòu)建、受體細(xì)胞的建立和表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)和策略。*87第一節(jié)常用表達(dá)系統(tǒng)及其選擇*88一、大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)

(一)大腸埃希菌表達(dá)載體的構(gòu)成1.復(fù)制子

是一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)、反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段。2.篩選標(biāo)記

大多采用抗生素抗性基因作為顯性篩選標(biāo)記。ampr、tetr、chlr、neor和kanr等。3.啟動(dòng)子與終止子啟動(dòng)子是一段包含DDRP識(shí)別位點(diǎn)和mRNA轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的DNA序列(20~300bp)；終止子使轉(zhuǎn)錄終止。*894.核糖體結(jié)合位點(diǎn)

是緊靠啟動(dòng)子下游的、從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開(kāi)始延伸幾十個(gè)bp的一段DNA序列，翻譯起始密碼ATG通常位于它的中心位置。核糖體結(jié)合位點(diǎn)中與核糖體16S亞基rRNA3′-端互補(bǔ)的核心部分稱(chēng)為SD序列，位于起始密碼上游5~13bp處；與核糖體16S亞基rpS-1蛋白質(zhì)結(jié)合的rpS-1識(shí)別序列緊密相鄰。*90信號(hào)肽序列常用pET系列核糖體結(jié)合位信號(hào)肽序列*91

(二)大腸埃希菌表達(dá)載體及其表達(dá)方式1.非融合表達(dá)載體2.融合表達(dá)載體3.分泌表達(dá)載體：加入了信號(hào)肽編碼序列。4.表面展示表達(dá)載體5.帶分子伴侶的表達(dá)載體：促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊。

僅表達(dá)目的基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽。表達(dá)融合基因(目的基因+附加基因)編碼的蛋白質(zhì)或多肽。噬菌體表面展示技術(shù)、細(xì)菌表面表達(dá)技術(shù)思考題3*92二、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用宿主細(xì)胞為枯草桿菌(Bacillussubtilis)；載體有自主復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒和噬菌體。(一)優(yōu)點(diǎn)

細(xì)胞壁內(nèi)不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白質(zhì)到細(xì)胞外。除炭疽和蠟樣芽孢桿菌外，均對(duì)人畜無(wú)毒。(二)缺點(diǎn)自身分泌蛋白酶，使目的基因表達(dá)產(chǎn)物降解；質(zhì)粒不穩(wěn)定。*93三、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)常用宿主細(xì)胞為變鉛青鏈霉菌(Streptomyces

lividans)；載體有高拷貝載體、低拷貝載體、穿梭載體、黏粒、噬菌體載體等。(一)優(yōu)點(diǎn)分泌蛋白酶量較少；可借助其胞外酶分泌系統(tǒng)分泌表達(dá)目的基因。(二)缺點(diǎn)基因操作難度比大腸埃希菌復(fù)雜得多，外源基因引入鏈霉菌的轉(zhuǎn)化率較低。

----最常用的是大腸桿菌（E.coli）表達(dá)體系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn):*94培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、迅速、經(jīng)濟(jì)而又適合大規(guī)模生產(chǎn)。外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)第二節(jié)外源基因的表達(dá)和鑒定產(chǎn)品功能生長(zhǎng)素治療侏儒癥胰島素促治療糖尿病顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類(lèi)白細(xì)胞組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII進(jìn)凝血超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品②不宜用于表達(dá)真核基因組DNA，只適于表達(dá)cDNA；

③表達(dá)真核蛋白不能形成正確的折疊和各種修飾；④高效表達(dá)時(shí)產(chǎn)物多形成無(wú)生物活性的包含體；⑤難以實(shí)現(xiàn)大量分泌性蛋白的表達(dá)；⑥真核蛋白不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解；⑦原核細(xì)胞周質(zhì)中常含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素。*96一、蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)①受原核細(xì)胞啟動(dòng)子和SD序列等元件控制；*97二、包含體的變性與復(fù)性包含體為無(wú)定型的蛋白質(zhì)聚合物。其中，50%以上是外源基因表達(dá)的空間結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤的產(chǎn)物；此外，主要有宿主細(xì)胞蛋白及膜蛋白片段，還有DNA和RNA、質(zhì)粒編碼蛋白以及脂多糖等。

(一)包含體的組成與形成*98

(二)包含體的變性與復(fù)性*99三、蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控在原核細(xì)胞中，與外源基因表達(dá)有關(guān)的調(diào)控因素主要有啟動(dòng)子(如IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá))和SD序列等。四、外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的鑒定外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的鑒定主要包括目的基因序列的正確性，和表達(dá)產(chǎn)物的理化性質(zhì)(分子量、氨基酸組成與含量、等電點(diǎn)等)及生物學(xué)功能(如抑癌、抗菌等)的鑒定。*100第三節(jié)外源基因表達(dá)條件和優(yōu)化一、表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)與選擇

(一)選擇適當(dāng)?shù)膹?qiáng)啟動(dòng)子選用具有可控表達(dá)型的啟動(dòng)子，即誘導(dǎo)前本底表達(dá)很低或無(wú)，僅在誘導(dǎo)（溫度或化學(xué)誘導(dǎo)劑）后目的基因才能獲得較高的表達(dá)效率。利用強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)外源性基因時(shí)必須在其下游加入不依賴(lài)于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以防止轉(zhuǎn)錄過(guò)程的通讀。

(二)引入原核增強(qiáng)子樣序列在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)遠(yuǎn)端（TSS上游至少100bp以上），引入增強(qiáng)子樣序列（長(zhǎng)度為50-1500bp）。其可通過(guò)增強(qiáng)mRNA與核糖體的相互作用來(lái)提高翻譯的效率。*101

(三)設(shè)計(jì)合理的SD序列改善核糖結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)起始密碼子ATG與SD序列之間的距離和堿基組成要處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。載體設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意：①SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3-6倍。②ATG與UAAGGAGG至少相隔3-4bp（最適距離為6-8bp），與AAGGA至少相隔5bp（最適距離為5-7bp），否則不能進(jìn)行翻譯。