細胞工程和胚胎工程課件

第二章細胞工程----細胞克隆一、克隆的概念

即無性繁殖系。指不經(jīng)過兩個分子、兩個細胞或兩個個體的結(jié)合，只由一個模板分子、母細胞或母體直接形成新的分子、細胞或個體的過程。

在分子水平：基因的克?。◤?fù)制）在細胞水平：雜交瘤的制備和單克隆抗體技術(shù)在個體水平：無性生殖。如：植物的營養(yǎng)繁殖，動物“克隆羊---多莉”的培育等無性生殖與有性生殖的區(qū)別

無性生殖：不經(jīng)過生殖細胞的結(jié)合，直接由母體產(chǎn)生下一代新個體的繁殖過程。特點是子代保留了親代的遺傳物質(zhì)，性狀基本相同。

有性生殖：經(jīng)過生殖細胞的兩兩結(jié)合，形成合子，再由合子發(fā)育成新個體的繁殖過程。特點是后代繼承了雙親的遺傳物質(zhì)，具有更強的生活能力和變異性，對生物的生存和進化具有重要意義離體器官、組織或細胞脫分化愈傷組織芽、根再分化植物體實例（組織培養(yǎng)非洲紫羅蘭）

外植體：離體的組織、細胞或器官。愈傷組織：一群高度液態(tài)化的原始的薄壁細胞。脫分化：分化的細胞（組織或器官）經(jīng)過處理形成愈傷組織的過程。再分化：由愈傷組織經(jīng)過處理再重新分化出不同的組織（細胞或器官）。概念：細胞的全能性是指生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能。原因：是生物體的每一個細胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)及發(fā)育為完整個體所必需的全部基因。幾乎所有的植物細胞都具有全能性人工誘導(dǎo)與兩種激素的關(guān)系——在植物組織培養(yǎng)過程中，細胞分裂素/生長素的比例對愈傷組織的形成，以及叢芽和根的分化影響極大——人工誘導(dǎo)過程的激素應(yīng)用如下：應(yīng)用：（1）快速繁殖（2）培養(yǎng)無病毒感染植株（3）獲取細胞代謝產(chǎn)物（愈傷組織階段）（4）生產(chǎn)人工種子（胚狀體階段）（5）可用于培育優(yōu)良植物品種（轉(zhuǎn)基因植物、單倍體育種和雜種植物）

2.植物組織培養(yǎng)形成的愈傷組織進行培養(yǎng)，又可以分化形成根、芽等器官，這一過程稱為：()

A、脫分化B、去分化C、再分化D、脫分化或去分化3.下列不能作為植物組織培養(yǎng)的材料是：()A、秋海棠的葉B、馬鈴薯的塊莖C、成熟的花粉D、木質(zhì)部中的導(dǎo)管細胞CD2.植物體細胞雜交過程：去細胞壁酶解法（纖維素酶、果膠酶）原生質(zhì)體物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)（振蕩、離心和電刺激，聚乙二醇）融合的原生質(zhì)體雜種細胞產(chǎn)生新的細胞壁雜種植物植物的組織培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：

細胞膜的流動性和細胞的全能性成功實例：

白菜和甘藍、煙草和海島煙草、胡蘿卜和羊角芹等研究意義：克服遠源雜交不親和的障礙，增大了親本組合范圍，培育了作物的新品種。白菜---甘藍（二）動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合核移植單克隆抗體技術(shù)胚胎工程動物細胞的培養(yǎng)過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)單個細胞動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)原代培養(yǎng)：

從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。

細胞株和細胞系的區(qū)別：

細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用：1.利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)可生產(chǎn)疫苗、干擾素、單克隆抗體。2.用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性。3.臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用：皮膚的移植、器官移植等動物組織培養(yǎng)胚胎或幼齡動物的臟器單個細胞機械消化、胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)培養(yǎng)液葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等傳代培養(yǎng)藥物研究治療癌癥的藥物及其療效某物質(zhì)檢測有毒物質(zhì)、致癌物質(zhì)等細胞株或細胞系②制備檢測細胞ⅰ配置細胞懸浮液:

ⅱ將細胞懸浮液分裝到兩個以上的培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間.③

配置培養(yǎng)液:取兩個培養(yǎng)瓶,分別編號1、2，

將上述組織用剪刀剪碎，再用胰蛋白酶使其分散成單個細胞，然后利用培養(yǎng)液配置成一定濃度的細胞懸浮液分別往其中加入等量的配置好的培養(yǎng)液，再往1號瓶中滴加幾滴0.09%的“三氯生”試劑，搖勻④將上述某一個培養(yǎng)狀況較好的培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液分成兩份，分別加入1、2號培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)一段時間。⑤檢測過程：分別從1、2號培養(yǎng)瓶中取樣做多次鏡檢，計算出變異細胞占觀察培養(yǎng)細胞的百分數(shù)。⑥預(yù)期結(jié)果和結(jié)論：a:若1號和2號培養(yǎng)瓶中變異細胞的百分比相當，則說明“三氯生”對人體無害。b:若1號培養(yǎng)瓶中變異細胞百分數(shù)大于2號，則說明“三氯生”對人體有害。獲得細胞細胞的全能性細胞株、細胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果或細胞分泌蛋白快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較2.動物的細胞融合細胞融合是將不同種類的兩種細胞經(jīng)過特殊處理后放在一起，在某些促融因子作用下發(fā)生融合，形成雜種細胞。細胞融合與細胞雜交——細胞融合是指由兩個或多個細胞融合成一個細胞的現(xiàn)象——基因型不同的細胞融合稱為細胞雜交——細胞融合是研究細胞之間遺傳信息轉(zhuǎn)移、染色體基因定位，以及創(chuàng)造新細胞株的有效途徑。誘導(dǎo)細胞融合的技術(shù)手段——滅活的仙臺病毒、聚乙二醇等介導(dǎo)——低壓交流電場中擊穿細胞膜脂雙層

病毒顆粒黏附細胞表面病毒顆粒穿通細胞膜細胞膜連接細胞融合動物細胞融合的原理：利用:細胞膜的流動性植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合細胞融合原理細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞融合的方法去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合誘導(dǎo)方法電刺激化學(xué)（聚乙二醇）電融合、PEG、滅活的仙臺病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體3.單克隆抗體技術(shù)：

抗體：來源、化學(xué)性質(zhì)、作用傳統(tǒng)獲取抗體的方法：傳統(tǒng)方法獲取抗體，產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。某種抗原注射到動物體內(nèi)（需要反復(fù)注射）動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體從動物的血清中分離出所需要的抗體科學(xué)家分析、探索過程：1.體內(nèi)B淋巴細胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體；2.每一個淋巴細胞只分泌一種特異性抗體3.臨床醫(yī)學(xué)目的：獲得大量的單一抗體理論方法：

用單個B淋巴細胞進行無性繁殖，也就是通過克隆，形成細胞群，由該細胞群就能產(chǎn)生出單克隆抗體（化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體）

遇到的難題：體外培養(yǎng)時，一個B淋巴細胞不可能無限繁殖，無法得到大細胞群解決的辦法：雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體單克隆抗體——是指通過克隆，形成遺傳物質(zhì)完全相同的細胞群，由該細胞群產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性、靈敏度高的抗體。設(shè)計的實驗方案：——將某抗原注入小鼠體內(nèi)，從其脾臟獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細胞；——用仙臺病毒或聚乙二醇誘導(dǎo)B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合；——在選擇性培養(yǎng)基中對雜交瘤細胞進行篩選，從雜交瘤細胞中挑選產(chǎn)生某種抗體的細胞；——將選擇細胞進行規(guī)模培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖；——從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中提取大量的單克隆抗體。

單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體的特點特異性高、靈敏度高、可以大量制備等優(yōu)越性。單克隆抗體的應(yīng)用——用同位素標記的單克隆抗體，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病——實驗在單克隆抗體上連接抗癌藥物，制成“生物導(dǎo)彈”，定向地將藥物帶到癌細胞，消除癌細胞但不傷害健康細胞。練習：

下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷風桿菌的實驗方案2、該方案能達到預(yù)期效果嗎？為什么？4、圖中B為________過程，常用_________作為誘導(dǎo)劑，該細胞繼承___________的遺傳特性，既能__________,又能___________。1、該實驗方案的目的是__________3、A是從小鼠的脾臟中取得_______,該細胞能夠產(chǎn)生______制備單克隆抗體效應(yīng)B細胞抗體細胞融合滅活病毒雙親細胞分泌抗體無限增殖B體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞足夠數(shù)量的細胞群注射到小鼠腹腔AC1.動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是：（）

A．動物細胞融合

B．胚胎移植

C．動物細胞培養(yǎng)

D．核移植Ｃ２．在動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較中，正確的是（）A．結(jié)果是相同的

B．雜種細胞的形成過程基本相同C．操作過程中酶的作用相同D．誘導(dǎo)融合的手段相同Ｂ３.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（）①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C4.核移植技術(shù)和動物的克隆繁殖卵細胞去核加供體細胞核核移植技術(shù)：重組細胞克隆動物

體核移植技術(shù)實例——童第周教授用極細的玻璃管從鯽魚未受精卵中吸出細胞核，再把鯉魚囊胚細胞的核移植到去核卵中，組裝成的新細胞經(jīng)過培育長成鯉鯽。

——小鼠的核移植——黑斑蛙的核移植——英國愛丁堡大學(xué)羅斯林研究所的伊恩·威爾莫特和基恩·坎貝爾于1997年2月27日首次用體細胞克隆培育出“多莉”（Dolly）?！岸嗬颉迸嘤^程是：從一只綿羊體內(nèi)取出未受精卵，用顯微操作技術(shù)去核；取另一只成年綿羊的單個乳腺細胞，將其細胞核注入去核卵細胞中；待融合細胞發(fā)育成胚胎后，將其植入第三只綿羊子宮內(nèi)，由它產(chǎn)下的羔羊就是“多莉”。核移植應(yīng)用前景加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群的繁殖增家瀕危物種的存活數(shù)量器官移植轉(zhuǎn)基因動物作為生物反應(yīng)器，產(chǎn)生醫(yī)用蛋白（疾病治療）克隆技術(shù)的社會倫理問題

禁止生殖性克隆人

不反對治療性克隆

胚胎工程體外受精（試管嬰兒）和胚胎體外發(fā)育胚胎移植胚胎工程體外受精和胚胎體外發(fā)育-----試管嬰兒的培育過程藥物誘發(fā)排卵取精體外受精著床→取卵胚胎移植↓↓胚胎體外培養(yǎng)（3～5天）監(jiān)測卵泡↓妊娠胎兒發(fā)育↓“試管內(nèi)”發(fā)育試管嬰兒的研究現(xiàn)狀——第一、二代試管嬰兒的研究，分別針對女性或男性因素導(dǎo)致的不孕問題——第三代試管嬰兒的研究主要是解決優(yōu)生優(yōu)育，即從多個受精卵中選擇基因型最佳的進行胚胎移植。例如，通過PGD技術(shù)選擇核型46，XX受精卵進行胚胎移植，可避免新生男嬰患Y連鎖遺傳病?！壳芭咛ヒ浦渤晒β手挥?0%-40%，通常移植多枚受精卵。這種做法能夠獲得較高成功率，也造成了多胎懷孕、嬰兒早產(chǎn)、出生時體重過重或過輕等問題，并可能導(dǎo)致新生兒腦癱胚胎移植1.牛胚胎移植的基本程序——用激素促使供體母牛超級排卵——選擇良種公牛配種或人工授精——將供體母牛子宮內(nèi)的胚胎沖洗