儀器分析毛細(xì)管電泳法

儀器分析毛細(xì)管電泳法第一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日第二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

本章要求⒈了解電泳、淌度、電滲的概念⒉了解毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu)⒊了解六種毛細(xì)管電泳分離模式第三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）又稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE），是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的液相分離技術(shù)。CE實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機(jī)。第四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日5.1基本概念和原理在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在直流電場(chǎng)的作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場(chǎng)方向遷移的現(xiàn)象。陰離子向正極方向遷移，陽(yáng)離子向負(fù)極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運(yùn)動(dòng)。

利用這些帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳。1.電泳第五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日2.毛細(xì)管電泳：CE以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，利用被分析離子在電場(chǎng)作用下移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的，主要用于分析在毛細(xì)管緩沖溶液中離解為離子的物質(zhì)。第六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日毛細(xì)管的內(nèi)徑比頭發(fā)絲還細(xì)得多10-30千伏電壓第七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日3.淌度淌度：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)下的電泳速度。絕對(duì)淌度：在無限稀釋溶液中（稀溶液數(shù)據(jù)外推）測(cè)得的淌度稱為絕對(duì)淌度，0em電泳速率：待測(cè)物從進(jìn)樣端到檢測(cè)窗口的遷移速度，vemem：cm2/(sV)；

vem：cm/s；E：V/cm第八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日4.電滲毛細(xì)管內(nèi)充滿溶液pH>3時(shí)，管內(nèi)Si-OH電離SiO-基，毛細(xì)管壁帶負(fù)電，與溶質(zhì)界面上形成雙電層。在雙電層的擴(kuò)散外層中，陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，帶動(dòng)溶液形成軸向流動(dòng)。第九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日在毛細(xì)管中電滲速度可比電泳速度大一個(gè)數(shù)量級(jí)，所以能實(shí)現(xiàn)樣品組分同向泳動(dòng)。正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳速度，在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。離子的出峰次序?yàn)椋赫x子>中性分子>負(fù)離子第十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日電滲流的作用：㈠可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離。㈡改變電滲流的大小和方向，可改變分離效率和選擇性，也是CE與HPLC相比能優(yōu)化分離的重要因素。㈢電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性，控制電滲流恒定是CE分析關(guān)鍵所在。㈣電滲流在CE中起到像HPLC中的泵一樣作用。第十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日鉑電極緩沖溶液高壓電源毛細(xì)管5.2毛細(xì)管電泳裝置第十二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日1.進(jìn)樣系統(tǒng)電動(dòng)進(jìn)樣；壓力進(jìn)樣；擴(kuò)散進(jìn)樣。進(jìn)樣體積一般在納升級(jí)。2.分離系統(tǒng)毛細(xì)管：熔融石英，長(zhǎng)40~100cm，內(nèi)徑25~100m；恒溫系統(tǒng)：控制柱溫變化在±0.1℃；高壓電源：電流0~300A，電壓0~30kV(穩(wěn)定性±0.1%)3.檢測(cè)系統(tǒng)4.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)紫外-可見檢測(cè)器；激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；電化學(xué)檢測(cè)器。第十三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日5.3毛細(xì)管電泳分離模式6種分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE毛細(xì)管等速電泳CITP毛細(xì)管等電聚焦CIEF毛細(xì)管電色譜CEC膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜MECC毛細(xì)管凝膠電泳CGE第十四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)

用CZE時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)用一種緩沖溶液(背景電解質(zhì))，根據(jù)各組分荷質(zhì)比不同而分離。背景電解質(zhì)僅起傳導(dǎo)電流的作用。

t＝0

t＞0第十五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日2.毛細(xì)管等速電泳（CITP）使用兩種電解質(zhì)：一種為遷移率較高的前導(dǎo)離子L電解質(zhì)，一種為遷移率較低的尾隨離子T電解質(zhì)，被分離組分夾在L與T之間，以同一速度運(yùn)動(dòng)，由于遷移率不同而分離。第十六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日3.毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)

基本操作步驟：進(jìn)樣、聚焦和遷移，用于生物大分子的分離。毛細(xì)管等電聚焦電泳的運(yùn)行過程(a)進(jìn)樣；(b)聚焦；(c)遷移第十七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日4.毛細(xì)管電色譜(CEC)

分為填充柱和開管柱兩種方式，可分離離子和中性分子，且可分離手性分子。5.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MECC)兩相：流動(dòng)的水相和起固定相作用的膠束相(準(zhǔn)固定相)，被測(cè)組分由于在水相和膠束相之間分配系數(shù)的差異而分離。第十八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日5.4毛細(xì)管電泳特點(diǎn)及應(yīng)用(1)高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬(wàn)塊至數(shù)千萬(wàn)塊。(2)高靈敏度：可檢測(cè)出低至10-20mol濃度的物質(zhì)。(3)高分析速度：可3min內(nèi)分離30種陰離子；1.7min內(nèi)分離19種陽(yáng)離子；4min內(nèi)分離10種蛋白質(zhì)。(4)試樣用量少：僅需幾nL(10-9L)的試樣。(5)儀器簡(jiǎn)單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升。(6)自動(dòng)：CE是目前自動(dòng)化程度最高的分離方法。(7)通常使用水溶液，對(duì)人和環(huán)境無害。1.優(yōu)點(diǎn)HPLC中，縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力是影響譜峰展寬的重要因素，而CE只有縱向擴(kuò)散影響譜峰展寬，塔板數(shù)：D:組分?jǐn)U散系數(shù)U：毛細(xì)管兩端施加電壓可采用20000~60000V的高壓，分離速度和分離度有明顯的改善，N為(1~2)105，HPLC的N為5103~2104。理論塔板數(shù)第十九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日(1)進(jìn)樣不夠方便。(2)分析陰離子時(shí)，出峰時(shí)間較長(zhǎng)。電滲會(huì)因樣品組成而變化，影響分離重現(xiàn)性。(3)光路太短，非高靈敏度的檢測(cè)器難以測(cè)出樣品峰。2.缺點(diǎn)毛細(xì)管電泳與高效液相色譜比較：操作簡(jiǎn)單，試樣量少。分離效率高，成本低。遷移時(shí)間的重現(xiàn)性、進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和靈敏度比HPLC差。第二十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日3.應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅在基礎(chǔ)科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有較多應(yīng)用，如臨床疾病診斷、臨床蛋白分析、臨床藥物監(jiān)測(cè)、代謝研究、病理研究、PCR產(chǎn)物分析、DNA片段及序列分析等?？蓹z測(cè)多種樣品，如血清、血漿、尿樣、腦脊液、紅細(xì)胞、體液或組織及其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。除分離生物大分子（肽、蛋白、DNA、糖等）外，還可用于小分子（氨基酸、藥物等）及離子（無機(jī)、有機(jī)），甚至可以分離各種