常見微生物培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)

（優(yōu)選）常見微生物培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)當(dāng)前1頁(yè)，總共40頁(yè)。細(xì)菌培養(yǎng)方式用人工方法,將細(xì)菌從自然界、動(dòng)物體或病料中分離出來(lái),研究細(xì)菌的形態(tài)、生理特性、生物學(xué)特性或制取細(xì)菌的某種代謝產(chǎn)物等,這對(duì)于傳染病的診斷和防治具有重要意義。根據(jù)不同標(biāo)本及不同培養(yǎng)目的,可選用不同的接種和培養(yǎng)方法。常用的有分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)兩種方法。當(dāng)前2頁(yè)，總共40頁(yè)。(一)培養(yǎng)基的種類和常用培養(yǎng)基培養(yǎng)基的概念：將細(xì)菌所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按一定比例混合在一起,并調(diào)節(jié)到適宜的PH,這種人工配制的適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物,稱為培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制原則：培養(yǎng)基組分應(yīng)適合細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)理化條件適宜經(jīng)濟(jì)節(jié)約無(wú)菌當(dāng)前3頁(yè)，總共40頁(yè)。1.培養(yǎng)基的種類按培養(yǎng)基的組成成分分類合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的功能分類基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基。當(dāng)前4頁(yè)，總共40頁(yè)。(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有培養(yǎng)一般細(xì)菌的最基本成分。又分為:液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三種。在液體(肉湯)培養(yǎng)基中,加入2%-3%瓊脂即為固體培養(yǎng)基,加入0.2%-0.5%瓊脂即為半固體培養(yǎng)基。當(dāng)前5頁(yè)，總共40頁(yè)。(2)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖、血液、血清、腹水、生長(zhǎng)因子等,以滿足營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌生長(zhǎng)需要有的細(xì)菌還需加入特殊物質(zhì),如結(jié)核桿菌需加入雞蛋清、馬鈴薯、甘油等才能良好生長(zhǎng)當(dāng)前6頁(yè)，總共40頁(yè)。(3)選擇培養(yǎng)基利用細(xì)菌對(duì)某種物質(zhì)敏感程度的不同,可在培養(yǎng)基中加入抑制某些細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物,而選擇性地讓欲分離的細(xì)菌旺盛生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,如膽鹽和薔薇色酸可以選擇性地抑制G+菌的生長(zhǎng),而不影響G－菌的生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中加入二藥后可選擇性地分離出腸道桿菌。當(dāng)前7頁(yè)，總共40頁(yè)。(4)鑒別培養(yǎng)基利用細(xì)菌分解底物及其代謝產(chǎn)物的不同,可在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)和指示劑,即制為鑒別培養(yǎng)基,以測(cè)定不同細(xì)菌的生化反應(yīng)。紫黑色,具有金屬光澤的菌落麥康凱平板：紅色菌落當(dāng)前8頁(yè)，總共40頁(yè)。(5)厭氣培養(yǎng)基將培養(yǎng)基與空氣及氧隔離,或降低培養(yǎng)基中的氧化還原電勢(shì),供厭氧菌生長(zhǎng)。除去培養(yǎng)基中氧的方法：降低培養(yǎng)基中氧化還原電勢(shì)：如肝湯或加入谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等?；先パ醴ǎ喝缃剐詻](méi)石子酸、好氧厭氧菌混合、種子發(fā)芽等。隔絕阻氧法：如液體石臘等。當(dāng)前9頁(yè)，總共40頁(yè)。(二)細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征有關(guān)概念菌落:在固體培養(yǎng)基上,由單個(gè)細(xì)胞繁殖形成的肉眼可見的細(xì)菌集落,稱為菌落。菌苔:在固體培養(yǎng)基上,大量菌落密集生長(zhǎng),融合成一片,稱為菌苔。純培養(yǎng):挑取一個(gè)菌落到另一培養(yǎng)基桑培養(yǎng),稱為純培養(yǎng)。不同的微生物種類,其菌落特征不同。同一種菌在不同培養(yǎng)條件下菌落特征也不盡相同,細(xì)菌的生長(zhǎng)特征有助于細(xì)菌的鑒定。當(dāng)前10頁(yè)，總共40頁(yè)。細(xì)菌分離培養(yǎng)形式及培養(yǎng)結(jié)果當(dāng)前11頁(yè)，總共40頁(yè)。細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是:肽聚糖(peptidoglycan),又稱為粘肽(mucopeptide)或胞壁質(zhì)(murein)。

丹麥病理學(xué)家革蘭(HansChristianGram)為證實(shí)病組織切片中有細(xì)菌存在,在1884年介紹了脫色后再進(jìn)行復(fù)染的鑒別染色法,后來(lái)被稱為革蘭染色法革蘭陽(yáng)性菌G＋(Grampositivebacteria)革蘭陰性菌G－(Gramnegativebacteria)涂片結(jié)晶紫染色碘液媒染酒精脫色復(fù)紅復(fù)染通過(guò)革蘭氏染色法可將細(xì)菌分為G＋菌(藍(lán)紫色)和G－菌(紅色)兩大類型。主要區(qū)別在于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同。當(dāng)前12頁(yè)，總共40頁(yè)。致病菌的檢驗(yàn)程序標(biāo)本直接涂片檢查分離培養(yǎng)分子生物學(xué)技術(shù)(核酸雜交、PCR)生化試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)其它(HPLC)當(dāng)前13頁(yè)，總共40頁(yè)。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果同一細(xì)菌對(duì)不同抗生素的敏感性不同細(xì)菌對(duì)相同抗生素的敏感性當(dāng)前14頁(yè)，總共40頁(yè)。病毒病毒(Virus)：是形體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、僅含有一種核酸（DNA或RNA），能夠通過(guò)細(xì)菌濾器,具有超級(jí)寄生性（嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生），且必須在電子顯微鏡下才能觀察到的一類非細(xì)胞形微生物。1892年，伊萬(wàn)諾夫斯基和貝杰林克，煙草花葉病毒，開創(chuàng)了病毒學(xué)獨(dú)立發(fā)展的歷程。當(dāng)前15頁(yè)，總共40頁(yè)。沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以透過(guò)細(xì)菌濾器只含一種核酸（DNA或RNA）嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生增殖方式為核酸復(fù)制對(duì)干擾素敏感，對(duì)抗生素不敏感病毒的基本特征當(dāng)前16頁(yè)，總共40頁(yè)。（一）病毒的感染病毒與細(xì)胞相互作用稱為病毒的感染。1.溶解性相互作用：病毒增殖,宿主細(xì)胞被破壞或溶解,也可不破壞細(xì)胞,形成穩(wěn)定狀態(tài)感染。2.轉(zhuǎn)化性相互作用：病毒基因組與宿主細(xì)胞基因組整合,引起宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。有些非但抑制宿主細(xì)胞的生物合成,反而促進(jìn)細(xì)胞分裂增生,導(dǎo)致腫瘤或細(xì)胞癌變。病毒的增殖當(dāng)前17頁(yè)，總共40頁(yè)。（二）病毒的增殖病毒自身無(wú)完整的酶系統(tǒng),不能進(jìn)行獨(dú)立的物質(zhì)代謝,必須在活的宿主細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行生活、復(fù)制和增殖由宿主細(xì)胞供應(yīng)原料、能量和生物合成場(chǎng)所,在病毒核酸遺傳密碼的控制下,于宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白質(zhì),進(jìn)一步裝配成大量的子代病毒,并將他們釋放到細(xì)胞外,這種增殖方式稱為復(fù)制當(dāng)前18頁(yè)，總共40頁(yè)。病毒的復(fù)制周期（ReplicativeCircle）定義：自病毒吸附于細(xì)胞開始，到子代病毒從感染細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的病毒復(fù)制過(guò)程稱為病毒的復(fù)制周期。病毒的復(fù)制增殖過(guò)程,大致包括吸附、穿入、脫殼、生物合成、裝配和釋放六個(gè)步驟。當(dāng)前19頁(yè)，總共40頁(yè)。當(dāng)前20頁(yè)，總共40頁(yè)。當(dāng)前21頁(yè)，總共40頁(yè)。當(dāng)前22頁(yè)，總共40頁(yè)。Replicationofvirulentphage當(dāng)前23頁(yè)，總共40頁(yè)。Lysogenicinfection當(dāng)前24頁(yè)，總共40頁(yè)。1、吸附需要病毒表面特異性的吸附蛋白(VAP)與細(xì)胞表面受體(也稱為病毒受體)相互作用,是決定感染成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞膜受體有脂蛋白受體和粘蛋白受體兩種,除具有病毒吸附部位外,尚有促進(jìn)病毒感染的作用。病毒的細(xì)胞受體具有種系和組織特異性,決定了病毒的宿主譜。當(dāng)前25頁(yè)，總共40頁(yè)。2、穿入(侵入)病毒吸附于細(xì)胞膜后,細(xì)胞膜受體和鄰近部位的膜發(fā)生折疊,將病毒吞陷,吞飲于泡內(nèi)(牛痘病毒);或通過(guò)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合進(jìn)入細(xì)胞漿中(皰疹病毒);無(wú)包膜病毒則直接穿過(guò)細(xì)胞膜而入細(xì)胞(呼腸孤病毒);當(dāng)前26頁(yè)，總共40頁(yè)。直接進(jìn)入(裸露病毒)膜融合(包膜病毒)胞飲(包膜病毒)當(dāng)前27頁(yè)，總共40頁(yè)。3、脫殼

感染性核酸從衣殼內(nèi)釋放出來(lái)的過(guò)程。有包膜病毒脫殼包括脫包膜和脫衣殼兩步,無(wú)包膜病毒只需脫衣殼,方式隨不同病毒而異。

病毒衣殼的脫落和核酸的逸出,主要在細(xì)胞漿(RNA病毒)或細(xì)胞核(DNA病毒)內(nèi)完成。當(dāng)前28頁(yè)，總共40頁(yè)。4、生物合成

病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后生物合成階段,胞漿中無(wú)病毒顆粒,稱為隱蔽期(eclipse)。病毒的生物合成過(guò)程分早期和晚期兩個(gè)階段：1.早期:主要是由核酸(DNA或RNA)通過(guò)mRNA制造酶類蛋白質(zhì)代謝工具和核酸基因組需要的核苷酸原料；2.晚期:主要是通過(guò)晚期mRNA合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。當(dāng)前29頁(yè)，總共40頁(yè)。5、裝配多數(shù)DNA病毒在細(xì)胞核內(nèi)合成裝配,RNA病毒在細(xì)胞漿內(nèi)合成裝配。當(dāng)前30頁(yè)，總共40頁(yè)。6、釋放有的病毒聚積在細(xì)胞空泡內(nèi)后通過(guò)細(xì)胞通道向外溢出;有的依靠細(xì)胞膨脹破裂放出;有的則因細(xì)胞感染病毒后死亡裂解或自溶而釋出。有囊膜的病毒多數(shù)借出芽而穿出細(xì)胞游離。當(dāng)前31頁(yè)，總共40頁(yè)。一、動(dòng)物接種動(dòng)物選擇標(biāo)準(zhǔn):對(duì)病毒的易感性高;動(dòng)物健康,體重、年齡盡可能一致,最好使用相應(yīng)的等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,并符合所要培養(yǎng)病毒的要求;盡量使用遺傳特性相似,個(gè)體差異較小,生物學(xué)反應(yīng)比較一致的動(dòng)物;外購(gòu)動(dòng)物,接種前要經(jīng)過(guò)健康觀察,以免誤用帶有病原體動(dòng)物?？筛鶕?jù)病毒性質(zhì)、材料性質(zhì)和目的不同,采取皮下接種法、皮內(nèi)接種、肌肉接種、靜脈接種、腹腔接種法、腦內(nèi)接種法。當(dāng)前32頁(yè)，總共40頁(yè)。二、禽胚培養(yǎng)理想的禽胚為SPF雞胚。常用非免疫雞胚加以補(bǔ)充,這種蛋應(yīng)無(wú)特定病原的母源抗體,否則會(huì)影響病毒在胚內(nèi)增殖。此外,不同病原對(duì)禽胚的適應(yīng)性也不同,如狂犬病和減蛋綜合征病毒在鴨胚中比雞胚中更易增殖,雞傳染性喉氣管炎病毒只能在雞和火雞胚內(nèi)增殖,實(shí)際應(yīng)用時(shí)而加以嚴(yán)格選擇。常用的接種途徑有絨毛尿囊膜法、尿囊腔法、羊膜腔法和卵黃囊法四種,根據(jù)不同的病毒和不同的目的采用適宜的接種途徑。當(dāng)前33頁(yè)，總共40頁(yè)。絨毛尿囊膜接種(10-13日齡胚)尿囊腔接種(9-11日齡胚)羊膜腔接種(10-12日齡胚)卵黃囊接種(5-8日齡胚)禽胚接種術(shù)式當(dāng)前34頁(yè)，總共40頁(yè)。雞胚不同接種途徑與收獲比較接種途徑日齡方法破殼部位接種量(ml)收獲尿囊膜10-13開蛋窗及人工氣室或鉆孔絨毛尿囊膜發(fā)育中心及氣室0.05-0.1擴(kuò)大蛋窗、收集接種部絨毛尿囊膜尿囊腔9-11鉆孔胚胎面與氣室交界邊緣上、下約1mm處0.1-0.2破氣室,收集尿囊液(5-8ml)羊膜腔10-12開蛋窗氣室端靠近胚胎側(cè)0.1-0.2擴(kuò)大蛋窗,收集尿囊液及羊水卵黃囊5-8鉆孔氣室中心0.2-0.5破氣室,收集去卵黃的卵黃囊或雞胚體當(dāng)前35頁(yè)，總共40頁(yè)。影響禽胚病毒增殖的因素1.種蛋質(zhì)量:SPF種蛋最理想,其次是非免蛋,普通種蛋不能用。病原微生物:家禽有很多疫病可經(jīng)垂直傳遞于雞胚,這些病原體既可污染制品本身,又可影響接種病毒在雞胚內(nèi)增殖母源抗體:種蛋帶有母源抗體,影響病毒在雞胚內(nèi)增殖抗生素:家禽混合飼料中常含有一定的抗生素,這種微量的抗生素可以傳遞給蛋胚殘留當(dāng)前36頁(yè)，總共40頁(yè)。2.孵化技術(shù):適宜的孵化條件有利于病毒增殖溫度:通常適宜溫度為37-39.5℃。寧低勿高。濕度:雞胚孵化標(biāo)準(zhǔn)為53%-57%,水禽胚孵化比雞胚高5%-10%。通風(fēng):發(fā)育過(guò)程中吸入氧氣排出二氧化碳,隨胚齡增長(zhǎng)需更換孵化機(jī)內(nèi)空氣。轉(zhuǎn)蛋:大頭向上垂直放置入孵,在孵化過(guò)程中定期轉(zhuǎn)蛋,使胚胎受熱均勻,防止胚胎與蛋殼粘連3.接種技術(shù):不同病毒的增殖有不同的接種途徑,同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。同時(shí),接種操作應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定,不應(yīng)傷及胚體和血管,以免影響其發(fā)育,使病毒增殖速度降低或停止。當(dāng)前37頁(yè)，總共40頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)從廣義上講是體外培養(yǎng)之一。體外培養(yǎng)包括器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。器官培養(yǎng)常指對(duì)未分散組織進(jìn)行培養(yǎng),可保留部分或全部組織在機(jī)體中的組織形態(tài)。組織培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出組織,模擬體內(nèi)生理環(huán)境,在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下,使之生存和生長(zhǎng),并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至2－4個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的染色體和繁殖特性,細(xì)胞可分為三類,即原代細(xì)胞、細(xì)胞株和細(xì)胞系。三、組織培養(yǎng)當(dāng)前38頁(yè)，總共40頁(yè)。多數(shù)病毒在敏感細(xì)胞增殖可引起細(xì)胞代謝等方面的變化,發(fā)生形態(tài)改變,如變圓、拉長(zhǎng)、聚集和融合等即細(xì)胞病變(CPE)。但也