哺乳動(dòng)物組織基因組DNA提取

哺乳動(dòng)物組織基因組DNA提取第1頁/共37頁2023/3/152二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciple)ThedetergentsSDS(sodiumdodecylsulfate)isaddedtodenatureproteinsandsolubilizelipidsinmembranesleadingtocelllysis.ThecelllysateisoftentreatedwithenzymesthathydrolyzeRNAandproteins.

本實(shí)驗(yàn)利用去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉)是為了使蛋白變性并溶解細(xì)胞膜中的脂質(zhì)從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，而細(xì)胞裂解物又常用蛋白酶K進(jìn)行水解處理。第2頁/共37頁2023/3/153真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)第3頁/共37頁2023/3/154Thentheyaretreatedwithphenolandchloroformtoremovetheremainingproteins,whichwilleitherentertheorganicphaseor,iftheyhaddenatured,appearattheinterphase.AlcoholhelptoconcentratetheDNAwhileremovingnucleotides,aminoacids,oligonucleotidesandpeptides.

隨后用酚︰氯仿進(jìn)行抽提，以去除殘留的蛋白質(zhì)，這時(shí)蛋白質(zhì)將進(jìn)入有機(jī)相，或者假如己變性的話將呈現(xiàn)在有機(jī)相與水相之間。乙醇沉淀處理則可以濃縮DNA，同時(shí)去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。第4頁/共37頁2023/3/155Wecanaddtheeathylenediaminetetraaceticacid

(EDTA)tokeeptheintegrity

ofDNA.EDTAcanchelateMg2+andreducedeoxyribonuclease(DNase)activity,becausetheseenzymesrequireMg2+towork.

為了進(jìn)一步保護(hù)DNA樣品的完整性，通常需要在緩沖液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，這樣將會(huì)減少脫氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因?yàn)樵撁副仨氃谟蠱g2+存在時(shí)才會(huì)起作用。第5頁/共37頁2023/3/156

本實(shí)驗(yàn)方法分離得到的染色體DNA長(zhǎng)度為100-150kb，適用于構(gòu)建基因組文庫和Southern雜交分析。如果要求得到較大分子量的DNA，則必須省略其中的振蕩步驟。第6頁/共37頁2023/3/157核酸的分離純化、測(cè)定及研究方法一、

分離核酸的一般原則

因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。第7頁/共37頁2023/3/158（一）核酸的分離和純化時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則

①保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；

②排除其它分子的污染。

（二）核酸的純度要求

①

核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然。第8頁/共37頁2023/3/159（三）核酸分離純化的注意事項(xiàng)為保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；②減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解，為避免過酸、過堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進(jìn)行；③防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價(jià)陽離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素；④減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。

第9頁/共37頁2023/3/1510高溫：如長(zhǎng)時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為0～4℃以降低核酸酶的活性從而減少對(duì)核酸的生物降解。

機(jī)械剪切力：包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，細(xì)胞突然置于低滲液中；細(xì)胞爆炸式地破裂及DNA樣品的反復(fù)凍融等。這些操作細(xì)節(jié)在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)加倍注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是大分子量的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA等。

第10頁/共37頁2023/3/1511二、核酸分離純化的一般步驟破碎細(xì)胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子→沉淀核酸→去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)→純化干燥→溶解。核酸提取方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點(diǎn)而定。對(duì)于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，采用先提取細(xì)胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。第11頁/共37頁2023/3/1512三、試劑與器材(Reagentsandapparatus)

Ⅰ.Instruments

Highspeedrefrigeratedcentrifuge（高速冷凍離心機(jī)）、Glasshomogenizer（玻璃勻漿器）、ElectrophoresisSystem（電泳系統(tǒng)）、Ultraviolettransilluminator（紫外透射儀）、Ultracoldstoragefreezer（超低溫冰箱）、Autoclave（高壓滅菌鍋）、Pipettes（微量加樣器）、Electronicbalance（電子天平）、Acidometer（酸度計(jì)）第12頁/共37頁2023/3/1513Ⅱ.Material

Liverofmice第13頁/共37頁2023/3/1514Ⅲ.ReagentsTris、SDS、EDTA、HCl、NaOH、Sodiumacetate(NaAc)、

Aceticacid(HAc)、Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、TEbuffer、ProteaseK、RNaseA、Agarose、DNAmolecularweightmarkers、Boricacid、Sugar、Bromophenol

blue、Fluorescentdye(Gelview)第14頁/共37頁2023/3/15151.5mol／LNaCl2.1mol／LTris·HClpH8.03.0.5mol／LEDTApH8.04.dddH2O5.3mol／LNaAcpH5.26.生理鹽水（0.85％NaCl）

7.10％SDS8.5×TBE9.10mg／mL蛋白酶K-20℃保存10.10mg／mL無DNA酶的RNA酶-20℃保存11.6×凝膠加樣緩沖液（一）儲(chǔ)備液的制備四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)第15頁/共37頁2023/3/1516四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)

冰浴處理生理鹽水玻璃勻漿器

冰冷的生理鹽水清洗（3次）配制工作液處死小鼠取出肝臟

組織勻漿液

酶解液2ml勻漿液

組織細(xì)胞液

玻璃勻漿器勻漿移至1.5ml離心管

5000r／min30—60s加400ul吹散加400ul

離心無菌水

酶解液

水浴處理（55℃、12—18h）

（二）破碎、酶解細(xì)胞（過夜）0.2g4℃棄上清第16頁/共37頁2023/3/1517四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)

等量分裝在兩支離心管內(nèi)

加入20ul的RNase

加入等體積①提取液(翻轉(zhuǎn)混勻)4℃10min酶解樣品待抽提的樣品

抽提

靜置離心

配制

TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc

無水乙醇

-20℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥混勻75%冷乙醇離心棄上清液加TE50ul

（三）抽提DNA、乙醇沉淀純化DNA37℃水浴1hDNA(4℃存放)第17頁/共37頁2023/3/1518四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)AgaroseGelElectrophoresis：

Preparationofthegel

制備0.3％瓊脂糖凝膠

LoadingDNAsamples

DNAsamples16μl+Loadingbuffer4μl

Gel

電壓120VGelphotography（四）、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA第18頁/共37頁2023/3/15191.制備0.3％瓊脂糖凝膠。稱取0.06g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入20mL的0.5×TBE緩沖液，放入微波爐加熱至完全溶化，則為0.3％瓊脂糖凝膠液。（由于蒸發(fā)作用，溶解前在容量瓶上作一個(gè)記號(hào)，溶解后用三蒸水補(bǔ)足）2.制膠器的安裝。3.將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入Gelview專用的三角瓶中，然后加入Gelview

2μl。4.將冷到60℃左右，緩緩倒入制膠器(注意不要形成氣泡)。5.待膠凝固后（80min），輕輕拔掉梳子，將凝膠盤從制膠槽中取出，放入電泳槽內(nèi)。6.加入電泳緩沖液(0.5×)至電泳槽中。

第19頁/共37頁2023/3/15205×TBE（電泳緩沖液）100mL5.4gTris，2.75g硼酸，2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)加蒸餾水到100mlpH8.00.5×TBE第20頁/共37頁2023/3/15216×上樣緩沖液0．25％溴酚藍(lán)：取60ml三蒸水，將250mg溴酚藍(lán)溶解于其中40％(W／V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖第21頁/共37頁2023/3/1522IlluminatethegelwithUVlightandthentakepictures.Bycomparingproductbandswithbandsfromtheknownmolecular-weightmarkers,youshouldbeabletoidentifyanyproductfragmentswhichareoftheappropriatemolecularweight.

通過紫外透射儀檢測(cè)凝膠，然后獲取圖片。并將產(chǎn)物條帶與已知分子量的標(biāo)淮條帶進(jìn)行比較，便可以對(duì)合適分子量大小的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。第22頁/共37頁2023/3/1523五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(experimentalresults)第23頁/共37頁2023/3/1524哺乳動(dòng)物基因組DNA的提?。ňC合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告）六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告第24頁/共37頁2023/3/1525溶液的配制摩爾質(zhì)量的計(jì)算:質(zhì)量(g)分子量

5mol／LNaCl分子量58.44x58.44(1)5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解14.6g氯化鈉于足量的水中，定容至50ml。

÷0.05(L)

＝5（mol/L）x＝14.61（g）÷體積(L)＝摩爾體積（mol/L）第25頁/共37頁2023/3/1526(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）:

配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽?；蚍Q取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，pH調(diào)至8.0，并溶于約40ml水中，定容至50ml。（3)3mol/L乙酸鈉（NaAc）：溶解20.4g的三水乙酸鈉于約40ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml。第26頁/共37頁2023/3/1527(4)10％十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取5gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含40ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至50ml。(5)40%氫氧化鈉（NaOH）：溶解40g氫氧化鈉顆粒于約90ml水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），氫氧化鈉完全溶解后用水定容至100ml。(6)1mol/L鹽酸（HCl）：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。第27頁/共37頁2023/3/1528(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：將200mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。(8)10mg/mlRnase（無DNase）（DNase－freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白R(shí)NA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl調(diào)pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過程中要戴手套）第28頁/共37頁2023/3/1529(9)

1mol／L

Tris緩沖液（Tris·HClbuffer）

將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調(diào)整終體積至1L。濃鹽酸的體積（ml）pH148.621

28.5

38

46

56

66

71.3

769.08.8

8.6

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.2第29頁/共37頁2023/3/1530(10)5×TBE（電泳緩沖液）100mL5.4gTris，2.75g硼酸，2mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)加蒸餾水到100mLpH8.0(11)6×上樣緩沖液0.25％溴酚藍(lán)：取60ml雙蒸水，將250mg溴酚藍(lán)溶解于其中

40％(W／V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖第30頁/共37頁2023/3/1531（12）組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml

100mmol／LNaCl：0.2ml（5MNaCl）25mmol／LEDTA(pH8.0)：0.5ml（0.5MEDTApH8.0)l0mmol／LTris·HCIpH8.0)：0.1ml（1MTris·HCIpH8.0)加三蒸水:9.2ml計(jì)算方法：5mol／LNaCl100mmol／L5mol／L×x＝0.1mol／L×10ml0.2ml第31頁/共37頁2023/3/153